K 32934 J/'5 UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE CITOLOGIA E HISTOLOGIA NORMAL Y PATOLOGICA TESIS DOCTORAL “ALTERACION DEL GEN SUPRESOR P53 E INMUNOREACTIVIDAD DE LAS PROTEINAS CADHERINA-E, ALFA, BETA Y GAMMA, CATENINAS EN HEPATOCARCINOMAS. RELACION CON EL GRADO TUMORAL Y VALOR PRONOSTICO” JOSE IBANEZ MARTINEZ SEVILLA, 2001Avda, Sanchez Pizjuan, s/n® 41009 Sevilla Tis. (34) 95 4371284 (34) 95 5008557 Fax. (34) 95 4371284 UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE MEDICINA Dpto. de Citologia e Histologia Normal y Patolégica Prof. Hugo Galera Davidson DON HUGO GALERA DAVIDSON, CATEDRATICO DE HISTOLOGIA Y EMBRIOLOGIA GENERAL Y ANATOMiA PATOLOGICA DE LA FACULTAD DE MEDICINA DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA, CERTIFICA: Que bajo su direccién y en el Departamento de Citologia e Histologia Normal y Patoldgica de esta Facultad de Medicina, ha sido realizado el trabajo titulado: “ALTERACION DEL GEN SUPRESOR P53 E INMUNOREACTIVIDAD DE LAS PROTEINAS CADHERINA-E, ALFA, BETA Y GAMMA, CATENINAS EN HEPATOCARCINOMAS. RELACION CON EL GRADO TUMORAL Y VALOR PRONOSTICO”", por Don JOSE IBANEZ MARTINEZ para optar al Grado de Doctor en Medicina y Cirugia. Y para que asi conste, expide el presente certificado en Sevilla, a veintitrés de Mayo de dos mil uno. A “y I [eff a ' FACULTAD DE MEDICINA O70. 08 ciToLOGIA € HisTOLOGIA IRMAL Y PATOLOGICA 41009 SEVILLAAGRADECIMIENTOS Al Profesor D. Hugo Galera Davidson. Como director de la tesis, por su impulso y experta direccién que ha sido decisiva para la conclusién del trabajo. A todos los miembros del laboratorio de inmunohistoquimica por su importante ayuda en el asesoramiento, realizacién de técnicas, cortes, y montaje de las mismas. A todos mis compaiteros del Servicio de Anatomia Patolégica del H. Carlos Haya de Mdlaga, en especial al Dr.D. Sebastian Luna y a las Dras. M® Dolores Bautista y Ana Jiménez, por compartir tanto, permitirme utilizar todo el material y facilitarme datos clinicos y bibliogrdficos de vital importancia para la realizacién de ésta tesis. Al Dr.D. José Luis Villar, porque sus conocimientos e inquietudes me abrieron nuevas perspectivas, fundamentales en la realizacién de la tesis. Por su estimulo y comprension. Al Dr. D. Antonio Garcia Escudero por su constante apoyo, su ayuda y paciencia en los problemas informdaticos. A Dia. Loli Montero por su colaboracién e importante ayuda administrativa. A Dita. M* Jestis Pareja por facilitarme la realizacién metodoldgica y técnica. Por compartir problemas comunes, por su amistad. A todos los Médicos Residentes, pasados y presentes que a lo largo de tantos afios me mantuvieron vivo. A todos los miembros del Departamento de Anatomia Patolégica del H.U. Virgen Macarena y Carlos Haya, y en suma a todas aquellas personas que de un modo u otro han contribuido en la elaboracién de ésta tesis. A mi familia y amigos, por su comprensién y carifio.A mis padres A Lola, José Ignacio y CristinaIndice INDICEIndice INDICE I.- INTRODUCCION A) ANATOMOFISIOLOGIA DEL HIGADO 1, Consideraciones anatémicas 2. Embriologia 3. Microanatomia 4. Microscopia electrénica 5. Fisiologia B) CARCINOMA HEPATOCELULAR.GENERALIDADES 1, Epidemiologia y etiologia 2. Manifestaciones clinicas 3. Caracteristicas patolégicas 4. Patrones histolégicos a) Hepatocarcinoma fibrolamelar b) Hepatocarcinoma de células claras c) Otros patrones 5. Ultraestructura 6. Diagnostico diferencial. Inmunohistoquimica 7. Factores pronésticos a) Estadio del tumor b) Reseccién quirtrgica c) Otros parametros d) Tratamiento médico y agentes quimioterapicos e) Embolizacién y quimioembolizacién f) Trasplante g) P53 y complejo cadherina E-catenina C) REGULACION DEL CRECIMIENTO CELULAR NORMAL 1. Ciclo celular 2, Regulaci6n postranscripcional del ciclo 3. Control de poblaciones celulares D) BASES MOLECULARES DEL CANCER 1, Oncogenes y cancer 2. Genes que regulan la apoptosis 3. Genes supresores del cancer 4, Gen supresorP53 a) Alteraciones y expresién de p53 en el hepatocarcinoma 5. Otros genes supresores del crecimiento tumoralIndice E) BIOLOGIA DEL CRECIMIENTO TUMORAL 1, Cinética del crecimiento de las células tumorales 2. Angiogénesis tumoral 3. Progresién y heterogeneidad de los tumores 4, Mecanismos de invasién y metastasis a) Invasién de la matriz extracelular b) Diseminacién vascular y asentamiento de las células tumorales c) Genética molecular de las metastasis F) MOLECULAS DE AHDESION 1, Consideraciones generales a) Integrinas b) Superfamilia inmunoglobulinas c) Selectinas d)CD44 e)Cadherinas 2. CADHERINA-E 3. Complejo cadherina/catenina a) Alfa-catenina b) Beta-catenina c) Gamma-catenina 4, Implicaciones del complejo cadherina/catenina en la carcinogénesis 5. Expresién de cadherina-E y cateninas en hepatocarcinomas II.- PLANTEAMIENTO DEL TEMA III.- MATERIAL Y METODO A. Material B.- Método . Estudio Clinico |. Estudio Macroscépico . Estudio Histolégico . Estudio Inmunohistoquimico . Estudio Estadistico . Busqueda bibliografica APN e 96 100 101 102 103 104 112 113Indice IV.- RESULTADOS 1. Observaciones generales 2. Parametros histolégicos 3. Higado no tumoral 4. Evolucién 5. Inmunohistoquimica 6. Relacién del complejo Cadherina-E/cateninas con el grado histolégico de los hepatocarcinomas 7. Relacién de la expresién del complejo Cadherina-E/ Cateninas con la hepatopatia asociada al hepatocarcinoma 8. Relacién de Cadherina-E/cateninas con el estadio tumoral V.- DISCUSION 1. Observaciones generales 2. Parametros histolégicos 3. Inmunohistoquimica a) p53 b) Cadherina-E/cateninas c) Expresién Cadherina-E/cateninas, relacién con el Grado histolégico d) Relacién del complejo cadherina-E/cateninas con el estadio y etiologia viral VI.- CONCLUSIONES VII.-BIBLIOGRAFIA VIILTABLAS E ILUSTRACIONES 114 15 116 121 130 132 138 142 147 150 152 158 162 166 169 172 225Introduccién INTRODUCCIONIntroduccién I. INTRODUCCION A) ANATOMOFISIOLOGIA DEL HiGADO 1, Consideraciones anatémicas El higado humano del adulto, es la glandula de mayor tamafio del organismo, pesa de 1200 a 1500 g (2,5% del peso corporal); en el nifio, su tamafio y peso, comparativamente con los del adulto, son algo mayores (5% del peso corporal), debido principalmente a la hipertrofia del lébulo izquierdo como consecuencia de la actividad hematopoyética. El higado se encuentra situado en el hipocondrio derecho, debajo de la cupula diafragmatica derecha, extendiéndose desde el quinto espacio intercostal derecho hasta el borde costal derecho; su cara anterior esta protegida por las ultimas costillas del hemitérax derecho; su cara posterior estd en contacto con el rifién derecho; su cara superior con el diafragma, y su cara inferior con el colon derecho, el duodeno y el pancreas, Su forma externa esté determinada por su adaptacién a dicho espacio, cuyo relieve interno conforma a menudo los surcos diafragmaticos sagitales y los surcos de estrangulacién horizontales (impresién del borde costal inferior). También las hernias congénitas diafragmaticas 0 umbilicales pueden condicionar importantes deformaciones del 6rgano. La diferencia dada por el ligamento falciforme, de los ldbulos hepaticos derecho e izquierdo no tiene importancia practica. Los verdaderos limites lobulares estan determinados por las ramificaciones de los vasos sanguineos (vena porta y arteria hepatica) y por las vias biliares, y se encuentran mucho mas a laIntroduccién derecha. El peso del higado puede oscilar en mas 6 en menos segin su contenido en grasa y glucégeno. La superficie del higado esta cubierta por la cépsula fibrosa de Glison, que a su vez esta recubierta por la serosa (peritoneo visceral). En el hilio hepatico, esta cdpsula penetra en el higado juntamente con los vasos y conductos biliares, siguiéndolos hasta sus mas finas ramificaciones. De las cinco superficies del higado (superior, anterior, lateral derecha, posterior e inferior), la posterior y la inferior muestran mas rasgos estructurales. Las superficies superior, anterior y laterales, son lisas y convexas para adaptarse a la cupula diafragmatica. Estan completamente cubiertas de peritoneo salvo una pequefia zona triangular donde divergen las dos capas de la parte superior del ligamento falciforme. El higado esta conectado con el diafragma, con la pared abdominal, con el estomago y con el duodeno por medio de bandas de tejido conectivo en pliegues peritoneales. Tienen la funcién de transportar vasos aferentes, eferentes y colaterales, linfaticos y plexos nerviosos al higado y de contribuir a mantener el organo en posicién. Estos son los ligamentos falciforme, coronario, hepatorrenal, triangular derecho e izquierdo. Sobre la superficie hepatica, la linea de separacién corresponde a un enlace arqueado entre el surco de la vena cava y el lecho de la vesicula biliar, y queda dividido aproximadamente por al mitad del lobulo caudado, mientras que el Idbulo cuadrado constituye una parte del Iébulo izquierdo. El higado se divide fisiolégicamente en dos ldbulos, de aproximadamente igual tamafio: lébulo derecho y ldbulo izquierdo. Como sea que los vasos y las vias biliares se dividen en cada lobulo en cuatro ramas principales, se distinguen 8 segmentos, que poseen cierta importancia para las intervenciones quirirgicas. El l6bulo caudado formaIntroduccién el noveno subsegmento irrigado por la rama lobular izquierda. La divisién segmentaria es constante en aproximadamente un 30% de los casos; en el resto existen variaciones, principalmente en relacion con un aumento o disminucién del tamafio de uno o mas segmentos (Olaso V. y Ortuiio JA, 1995). E| higado recibe la sangre a través de la vena porta (60-70% del flujo sanguineo hepatico) y de la arteria hepatica (30-40%) que penetran ambas por el hilio hepatico; el conducto biliar hepatico comin sale por esta misma zona. Las primeras ramas de la arteria, la vena y el conducto biliar se encuentran situadas inmediatamente por fuera del higado, pero las ramificaciones restantes de las tres estructuras adoptan trayectos aproximadamente paralelos ya dentro del érgano, donde forman los espacios porta. El extenso parénquima hepatico esta irrigado por pequefias ramificaciones terminales y fenestradas de los sistemas de la vena porta y arteria hepatica, que penetran en el parénquima a intervalos frecuentes. La sangre pasa a las ramas de las venas suprahepaticas que desembocan en la vena cava inferior, a la que se encuentran intimamente asociadas. No hay enlaces transversales intrahepaticos entre la arteria hepatica y la vena porta, o entre las ramas de la arteria hepatica, o por lo menos no tienen importancia funcional. Las arterias hepaticas interlobulares emiten finas ramas al plexo peribiliar, el cual mantiene a su vez relacion con la vena porta (las llamadas ramas internas), y envian después ramas separadas y dotadas de dispositivos esfinterianos a las porciones centrales y periféricas de los lobulillos hepaticos. Las ramas interlobulares de la vena porta constituyen venas principales, de las cuales surgen venas de distribucién de curso paralelo, que dan origen a las venas penetrantes, las cuales atraviesan la placa limitante y seIntroduccién nN ramifican en los sinusoides. Las sangres procedentes de la arteria hepatica y la vena porta no se mezclan, por lo tanto, mas que dentro del lobulillo. (Rappaport AM, 1982) Embriologia Desde el punto de vista embriolégico (Starck, 1965), el higado procede de dos o tres esbozos embrionarios: a) un diverticulo hepatico entodérmico que en el embrién de 2,5 mm de longitud, crece hacia delante en la base ventral del intestino anterior, 5) un plexo capilar del pliegue transversal mesodérmico, y c) algunas células del mesodermo celémico que penetran en la red capilar y se convierten en células epiteliales por la accién de los organizadores. Este tercer esbozo es discutido, si se confirmara, una porcién del epitelio hepatico seria de origen entodérmico, y otra de origen mesodérmico. También las vias biliares extrahepaticas brotan del diverticulo hepatico mencionado y precisamente de su porcién caudal. Se discute si también proceden de él las vias biliares intrahepaticas. Algunos investigadores suponen que se forman junto con las células hepaticas, es decir de manera independiente del sistema conductal extrahepatico, y entran sdlo de forma secundaria en relacién con éste. Es seguro que se forman de esta manera las partes intermedias 0 intercalares (colangiolo, conductillos). Estas se diferencian al principio al mismo tiempo que los hepatocitos y alcanzan su estructura definitiva sélo bajo el influjo de organizadores secundarios 0 terciarios. Como mecanismo desencadenante se acepta el contacto de los hepatocitos primitivos con el tejido conjuntivo portal y un tipo determinado de circulacién sanguinea. De esta forma algunos hepatocitosIntroduccién w se irian convirtiendo en epitelio de segmentos intercalares hasta el momento del nacimiento. Por el contrario, el contacto de las células endodérmicas con el plexo capilar mesenquimatoso estimula el desarrollo de un epitelio hepatico regular, mientras que a su vez las células hepaticas completamente diferenciadas inducen la formacién de las vias biliares intrahepaticas. La cuestién de una transformacién de los hepatocitos en el epitelio de los segmentos intercalares se discute también para la regeneracién del higado en el adulto y ha conducido a diferentes opiniones sobre las llamadas proliferaciones de vias biliares. La circulacién sanguinea del higado procede de la anastomosis de ambas venas del saco vitelino. Microanatomia El lobulillo hepatico se considera la unidad funcional mas pequefia, agrupado alrededor de una vena central (Kiernan, 1833). Estas zonas se han considerado clasicamente como lobulillos hexagonales, de 1 a 2 mm de didmetro, orientados alrededor de las anteriormente mencionadas ramas terminales de las venas suprahepaticas (vénulas hepaticas terminales o venas centrolobulillares). Sin embargo, como los hepatocitos mas préximos a las venas centrolobulillares son las que se encuentran mas alejadas del aporte sanguineo, se admite hoy que constituyen la periferia de los lobulillos metabélicos, denominados acinos. Los acinos poseen en sus bases ramas terminales de la arteria hepatica y de la vena porta, procedentes de los espacios porta, mientras que las 10Introduccién ramificaciones de las venas centrolobulillares se sitian en sus vértices. El parénquima de los acinos hepaticos se divide en tres zonas: la zona 1 es la mas cercana al aporte vascular; la zona 3 rodea las venas centrolobulillares terminales y la zona 2 es la zona intermedia. Esta division tiene consecuencias metabélicas considerables, ya que la actividad de muchas enzimas hepdaticas muestra un gradiente lobulillar. Ademas muchas formas de lesién hepatica siguen también una distribucién zonal. El parénquima hepatico esta organizado en ldminas o placas cribiformes y anastomosadas entre si que cuando se observan al microscopio, aparecen como cordones celulares. Estos cordones 0 trabéculas estén constituidos por hepatocitos, los cuales son células poligonales de tamafio global bastante uniforme, siendo su didmetro medio de 20-30 1m, aunque sus nicleos varian de tamafio, numero, y ploidia, sobre todo en las personas de edad avanzada (Holle G, 1980). Tienden a predominar las células uninucleadas y diploides, pero existe una fracci6n significativa de células binucleadas y el cariotipo puede incluso alcanzar la octaploidia. Los hepatocitos situados en la proximidad inmediata de los espacios porta reciben el nombre de placa o lamina limitante y forman un borde discontinuo en torno al mesénquima del espacio porta. Alrededor de las venas centrolobulillares, las trabéculas de hepatocitos adoptan una disposicién radial. Entre los cordones o trabéculas hepatocitarias existen sinusoides vasculares. La sangre arterial y venosa portal, atraviesa los sinusoides y pasa a las venas centrolobulillares a través de los innumerables orificios presentes en sus paredes. Por tanto, dos lados de los hepatocitos se encuentran bafiados por una mezcla de sangre arterial y venosa portal, que representa el 25% 11Introduccién del gasto cardiaco, y forman parte de las poblaciones celulares del organismo que reciben una irrigacién més rica. Microscopia electrénica Los sinusoides se encuentran revestidos por células endoteliales fenestradas y discontinuas que limitan un espacio extrasinusoidal denominado espacio de Disse, hacia el que se proyectan abundantes microvellosidades hepatocitarias. Las células de Kupffer son células del sistema fagocitario monocitico que se unen salpicadamente a la superficie luminal de las células endoteliales, y en el espacio de Disse existen atin otras células que contienen grasa, las células estrelladas hepaticas (también llamadas células de Ito), de origen mesenquimal. Estas ultimas intervienen en el almacenamiento y metabolismo de la vitamina A que se transforman en miofibroblastos productores de coldgeno en caso de inflamacién o fibrosis del higado. Los hepatocitos tienen una orientacién bipolar y estan dotados de un abundante reticulo endoplasmico y ergastoplasma como es propio de las células con una activa sintesis proteica (Cossel, 1964). El contenido en mitocondrias es importante (estimacién: 2.000-3.000 por célula) y ofrecen un buen indicador del alto potencial energético de los hepatocitos. Sin embargo es evidente que las cifras oscilan segtin los estadios funcionales y las alteraciones patolégicas. Los hepatocitos son especialmente ricos en sustancias paraplasmaticas almacenadas. Estas estén rodeadas de una membrana, por lo que se las retine bajo el concepto de citosomas. En esta forma se encuentran con el microscopio electrénico lipofuscina, ferritina y siderina, grasas y pigmento biliar, este también en higados normales. 12Introduccién Entre los hepatocitos contiguos se forman canaliculos biliares, que son canales de 1 a 2 ym de didmetro, constituido por depresiones de las membranas plasmaticas de las células vecinas y separadas del espacio vascular por uniones intimas. Hacia estos espacios intercelulares, considerados las raices mds extremas del Arbol biliar, se proyectan numerosas microvellosidades. Los microfilamentos intracelulares de actina y miosina localizados en torno a los canaliculos ayudan a impulsar el liquido biliar hacia los espacios porta. Los canales comienzan en las regiones centrolobulillares y se van uniendo progresivamente hasta drenar en los conductos de Hering, las ramas tributarias parenquimatosas terminales del sistema de conductos biliares. Estos conductos estén revestidos por un epitelio biliar cibico bajo. El flujo biliar pasa por sus luces en direccién a los conductos biliares interlobulillares, situados en los espacios porta y poseedores de un revestimiento epitelial cubico mas resistente. Fisiologia El higado realiza un gran numero de funciones fisiolégicas de lo mas variadas. Su consecucién por un mismo y tnico tipo de células no es probablemente posible mas que mediante un cambio ritmico de los diferentes mecanismos metabdlicos. Asi por ejemplo, la produccién de bilis se realiza principalmente por el dia y la sintesis de glucdgeno, durante la noche (Forsgren, 1935). 13Introduccién Se pueden distinguir las siguientes funciones del higado (Popper y Schaffner, 1961): a) secrecin externa en el intestino; b) secrecién interna a la sangre; c) funciones metabdlicas, incluyendo el almacenamiento de sangre; f) participacién en las funciones del SER mediante el sistema de células estrelladas de Kupffer (Rouiller, 1963). Funci6n excretora del higado. Esta funcién hacia el intestino se relaciona en primer lugar con la formacién y excrecién de la bilis (330- 700-1200 ml en 24 horas, peso especifico 1.008-1015, pH=5. 8,6), y sus componentes principales estén formados por la bilirrubina y los acidos biliares. Mientras que la bilirrubina ocupa una posicién central en el metabolismo de la hemoglobina, los acidos biliares ejercen importantes funciones en el desarrollo de la digestién. Se forman en las células hepaticas y estan emparentadas quimicamente con la colesterina. Antes de su excreci6n, los acidos biliares se conjugan con la glicocéla (2/3) 0 la taurina (1/3). El lugar en que se realiza este enlace es el reticulo endoplasmatico. Tanto para la bilirrubina como para los acidos biliares existe una circulacién enterohepatica: la mayor parte de la sustancia excretada en el intestino regresa otra vez al higado. Con la bilis pueden también expulsarse sustancias exdgenas, en primer lugar, medicamentos, bacterias y colorantes. Paso de sustancias del higado a la sangre. Este paso comprende un gran espectro de compuestos de importancia vital. Casi toda la glucosa procede del glucdgeno hepatico y, en las lesiones hepaticas, el higado renuncia a todas las restantes funciones a favor de la formacién de azucar. También se sintetizan lipidos en el higado, y una parte de los 14Introduccién fosfolipidos plasmaticos proceden de éste organo. Para los cuerpos cetonicos, el higado representa su tinica fuente de origen. De importancia central es la capacidad del higado para la sintesis proteica. Una gran parte de las proteinas séricas, tales como la albimina, el fibrindgeno, la globulina, la protombina y los factores V y VII de la coagulacién de la sangre, son formados por el higado, asi como algunos fermentos, como, por ejemplo, la esterasa sérica. También es el lugar de formaci6n de la urea. Metabolismo. El higado es un sitio de transformacién universal para los hidratos de carbono, los lipidos y las proteinas, que son sintetizados y catabolizados aqui. En las células hepdticas existe por ello en todo momento una gran cantidad de pequefios depdsitos metabdlicos prestos para las sintesis mas variadas y que pueden transformarse en su mayor parte los unos en los otros. Hay, sin embargo, toda una serie de aminodcidos (colina, metionina) y Acidos grasos (los menos saturados) que el higado no puede formar por si mismo. Por eso se denominan “esenciales” y tienen que ser aportados en todo caso por la alimentacién. Ante estas posibilidades de transformacién casi ilimitada no es sorprendente que muchas de estas sustancias sean también almacenadas en el higado y se visualicen histolégica o histoquimicamente o por medio de la microscopia electronica. Esto es valido para el glucégeno, los lipidos también en condiciones patolégicas, para las proteinas y aminodcidos. El glucégeno, un componente principal de la sustancia citoplasmatica fundamental de las células hepaticas, se presenta con el microscopio electrénico de forma finamente granular 0 vesicular y se encuentra en cantidades muy variadas segun las distintas 15Introduccién situaciones metabdlicas. En la hibernacién, el almacenamiento de glucégeno en las células hepaticas alcanza su maximo. También, el higado es el organo principal de almacenamiento para las vitaminas (A y D). Funci6n desintoxicante. Esta funcidn no solo tiene importancia para la eliminacion de sustancias propias del organismo, sino también para la inactivacién de medicamentos. El higado dispone para ello de los mecanismos de desintegracién quimica, la oxidacién y el acoplamiento a sulfatos, acido glucorénico 0 aminodcidos. Para ello es importante la actividad de los fermentos necesarios para la transformacién y la preparacion de las sustancias necesarias para el acoplamiento. Almacén de sangre. El higado puede aceptar importantes cantidades de ella. En los higados de los cadaveres unos 2.500 ml. En el ser vivo, el paso de sangre por el higado seria de 1.500 ml/min por 1,73 m* de superficie corporal. Sin embargo la irrigacién varia mucho y depende de la funcion, y esta caracterizada por periodos alternativos de circulacion aumentada o disminuida. El higado es ademas parte del sistema reticuloendotelial, en el que hay que incluir las células estrelladas de Kupffer y el mesénquima laxo de los espacios periportales. A las funciones particulares de estas células pertenecen la fagocitosis, la formacién de anticuerpos, la sintesis de globulinas, la formacién de bilis y varias otras (en parte atin incompletamente conocidas) funciones metabdlicas. Asi, las células estrelladas pueden probablemente fagocitar grasas y colesterinas carentes 16Introduccién de valor y almacenar vitamina A y distribuirla por el resto del higado. Como expresién de estas variadas funciones, las células parietales de los sinusoides son ricas en inclusiones y en material acumulado, que con frecuencia da una reaccién positiva al PAS (Holle G, 1980). B). CARCINOMA HEPATOCELULAR. GENERALIDADES 1. Epidemiologia y etiologia Frecuencia El carcinoma hepatocelular, es el tumor hepatico primitivo maligno mas frecuente, seguido del colangiocarcinoma. Constituye alrededor de 2/3 de las neoplasias malignas del higado. Siendo el tumor visceral mas frecuente 350.000 casos anuales y en algunas poblaciones es el cancer mas frecuente del conjunto de todos ellos (Crawford JM, 1997). Ha recibido diversos nombres como, hepatocarcinoma, carcinoma de células hepaticas, carcinoma trabecular, hepatoma, carcinoma sdlido y carcinoma simple. (Burdette WJ, 1980) En el mundo occidental los tumores hepaticos son relativamente raros, pero en otras zonas como Africa y Extremo Oriente el carcinoma hepatocelular es una neoplasia observada con gran frecuencia, siendo la incidencia en la poblacién negra 4 veces superior a los blancos, y responsables de la muerte de todos los pacientes afectados (alta mortalidad).Introduceién Espafia se situa en un nivel medio de incidencia de hepatocarcinoma (alrededor de 10,8 casos por 100.000 habitantes en 1988). Aunque se carece de datos recientes, el aumento de casos diagnosticados en los Ultimos afios parece indicar un incremento sustancial en las cifras de incidencia en nuestro pais. Los avances realizados en la reseccién de tumores, asi como, la realizacion de trasplantes, ha supuesto un importante paso especialmente para las lesiones mas circunscritas; sin embargo la historia natural del proceso se caracteriza por una sintomatologia tardia que dificulta su tratamiento. La cirrosis aparece con frecuencia antes de que lo haga el carcinoma hepatico, sin embargo, no ocurre en todos los casos, ya que sélo entre un 30-90% de los pacientes con hepatocarcinoma ha presentado cirrosis previa. La cirrosis macronodular postnecrotica constituye el tipo de cirrosis que con mas frecuencia se acompafia de hepatocarcinoma. Edad y sexo En las areas con alta incidencia de hepatocarcinoma y de portadores de HbsAg, el hepatocarcinoma aparece en personas mas jévenes que en las areas de incidencia intermedia o baja. Asi, en el norte de Europa y en el continente americano, el pico de mayor incidencia se situa entre los 50- 70 afios, con una media de 63 afios. En el sudeste asidtico el pico se encuentra entre los 40 y 50 afios. En Espafia la edad media se sitha en los 60 afios, afectando més tardiamente a las mujeres (Garrigues Vy Prieto M, 1985). Parece que ser que el factor condicionante més importante de 18Introduecién estas diferencias es la edad de adquisicién de la infeccién crénica por el virus de la hepatitis B. El hepatocarcinoma afecta principalmente a varones, variando la proporcién, segin las areas geograficas, entre 3-6/1. Si el hepatocarcinoma se desarrolla sobre higado cirrético la proporcién hombre/mujer llega a ser 8-9/1. Patogenia Los origenes moleculares del carcinoma hepatocelular siguen sin aclararse aunque pueden apuntarse los siguientes datos (Geissler M, et al, 1997). e En la patogenia de los canceres hepaticos asociados al VHB y al VHC es importante la repeticién de ciclos de muerte y regeneracion celular. La acumulacién de mutaciones durante los ciclos continuos de division celular puede llegar a transformar a algunos hepatocitos. e En practicamente todos los casos de cancer hepatico asociado al VHB, el DNA viral se encuentra integrado en el genoma de las células huésped, y los tumores son clonales en relacion con estas inserciones. Ello indica que la integracién del virus procede o acompaiia a la transformacién. ¢ La integracién del DNA del VHB provoca inestabilidad gendmica, pero sus efectos se distribuyen ampliamente por todo el genoma del huésped, en lugar de limitarse al lugar de integracién. ¢ El genoma del VHB sélo contiene cuatro marcos de lectura abiertos, por lo que los candidatos a oncogenes son escasos. Se ha propuesto que la proteina VHB X desempefia un papel en la carcinogénesis, 19Introduceién actuando como un transactivador de los promotores celulares y virales. Se cree que esta proteina altera el control normal del crecimiento de las células infectadas mediante la activacién transcripcional de varios genes promotores del crecimiento del huésped, como el factor de crecimiento insulinico II y los receptores para el factor de crecimiento insulinico I. La proteina VHB X se une también al gen supresor del cancer p53 y puede interferir en sus actividades inhibidoras del crecimiento. e El cambio de prevalencia en las poblaciones que migran hacen probable que los carcindgenos ambientales tengan un importante papel en esta enfermedad. En determinadas areas de endemia del carcinoma hepatocelular, existen datos que indican que los agentes carcinégenos podrian encontrarse en alimentos contaminados o en productos medicinales obtenidos a partir de plantas, por ejemplo, las aflatoxinas B y C, procedentes del moho Aspergillus flavus, etc. Estas sustancias son los factores mds potentes implicados en la carcinogénesis del carcinoma hepatocelular. Las aflatoxinas son inactivadas en los hepatocitos, y sus productos se intercalan en el DNA y forman complejos mutaégenos con la guonosina. Un lugar especialmente susceptible a la accion de las aflatoxinas es la base guanosina del codén 249 del gen p53, lo que provoca una sustitucién de G por T en dicho lugar. Esta mutacin especifica de p53 es frecuente en los carcinomas hepatocelulares del Africa subsahariana y de China, que son las mismas regiones geograficas en las que existe susceptibilidad hereditaria a la aflatoxina. El epdxido hidrolasa microsomal hepatica y la glutatién S-transferasa son las responsables de la destoxificacién de la aflatoxina, y los pacientes con carcinoma 20Introduccién hepatocelular de las regiones aludidas poseen unas enzimas hepaticas mutantes, con accién escasa o nula sobre la aflatoxina. Parece, pues, que la infeccién por el VHB, la exposicién a la aflatoxina y las variaciones genéticas actian de manera sinérgica en ciertas regiones del mundo, aumentando el riesgo de carcinoma hepatocelular. ¢ En los pacientes no infectados por el VHB, el factor principal de riesgo para el carcinoma hepatocelular es la cirrosis alcohdlica y la hemocromatosis primaria. Curiosamente, la incidencia mayor de carcinoma hepatocelular ocurre en la tirosinemia hereditaria, en que casi el 40% de los pacientes desarrollan el tumor, pese a seguir una dieta adecuada. Podria pensarse que el hecho comtn en los carcinomas hepatocelulares no asociados a la infeccién por el VHB es la estimulacién de la division hepatocitaria en el contexto de una necrosis e inflamaci6n incesantes. Aunque hasta hace poco no se habia establecido la existencia de una relacién directa entre la neoplasia y 1a hepatitis virica, hoy dia parece comprobada la estrecha relacin entre la infeccién viral y la génesis del hepatocarcinoma, ya que se ha demostrado genoma de VHB y VHC en el 20,6% y 62% de los hepatocarcinomas, respectivamente. Existen estudios epidemiolégicos en los que se detecta una relacién significativa entre la infeccién y el hepatocarcinoma, sin embargo el mecanismo por el que el VHC pudiera estar implicado en la carcinogénesis hepatica es atin desconocido, habiéndose relacionado la infeccién por virus C con un mayor indice proliferativo en hepatocitos. 21Introduceién Con todo lo anteriormente expuesto, podemos considerar que aunque el conocimiento de la carcinogénesis hepatocelular es incompleto, la vacunacién universal frente al VHB en las areas endémicas podria reducir de manera espectacular la incidencia de carcinoma hepatocelular. Algunos programas de este tipo se iniciaron en Taiwan en 1984, habiéndose logrado reducir las tasas de infeccién por el VHB del 10% al 1.3% en 10 afios (Chen L, et al). 1996). Sin embargo dado el periodo de latencia para el desarrollo del carcinoma, se necesitaran de 3 a 4 decenios para determinar con precision el impacto real del control del VHB en la incidencia del carcinoma hepatocelular. 2. Manifestaciones clinicas Sus manifestaciones iniciales suelen ser inespecificas (astenia, adelgazamiento, fiebre) lo que dificulta su diagnostico precoz. Si estos sintomas aparecen en un paciente cirrético conocido, puede sospecharse el desarrollo de un hepatocarcinoma; pero esto se desconoce en el 75% de los casos. El diagnéstico, pues, suele retrasarse hasta la aparicion de manifestaciones clinicas mas especificas. Lo mas frecuente (el 38% de los casos) es que el hepatocarcinoma se manifieste como una hepatomegalia grande, dura, de superficie irregular o nodular y dolorosa al tacto. En ocasiones se manifiesta por dolor abdominal, localizado preferentemente en hipocondrio derecho, en un sujeto aparentemente sano hasta entonces 0 con cirrosis hepatica. Otras veces se manifiesta con ascitis y/o por un sindrome ictérico persistente y progresivo un 34% de los casos (Kassianides C y KewMC, 1987). En ocasiones las primeras 22Introduccién manifestaciones son de indole paraneoplasica. Por ultimo cabe sefialar que puede ser asintomatico, detectandose en el curso de exploraciones (ecografia, TC, laparoscopia) o laparotomia, indicadas por otros motivos. En el periodo de estado, existe dolor abdominal sordo y continuo en el 75% de los casos. Cuando existe infiltracién de la cépsula o invasion del diafragma, el dolor puede llegar a ser muy intenso. Con el tiempo la astenia aumenta, Ilegando a constituir uno de los motivos principales de consulta. En ausencia de cirrosis los signos clinicos de insuficiencia hepatica son excepcionales y de aparicién tardia. La elevacién de alfa feto proteina sérica esta en aproximadamente el 80% de los pacientes. Clinicamente, el carcinoma fibrolamelar es muy similar al hepatocarcinoma trabecular, del que los distinguen ciertos rasgos, en particular la ausencia de predominio sexual, su mayor incidencia en gente joven, ausencia de secrecién de alfafetoproteina y ausencia de cirrosis en la mayoria de los casos. (Bermann MM, 1980). 3. Caracteristicas patolégicas. Macroseépicas Tanto el hepatocarcinoma como el colangiocarcinoma pueden manifestarse como: a) Una masa tinica (generalmente grande), b) nédulos multiformes diseminados y de tamafio variable, o c) un cancer infiltrante difuso, que permea ampliamente el higado, a veces en su totalidad. Los tres patrones pueden causar aumento del tamafio del higado. El tumor infiltrante difuso puede mezclarse de manera imperceptible con un higado cirrético previo. Suelen tener coloracién més palido que el tejido 8Introduceién hepatico que los rodea y a veces, cuando estan formados por hepatocitos bien diferenciados capaces de secretar bilis, adoptan un tono verdoso. Todos los patrones de carcinoma hepatocelular muestran una fuerte tendencia a invadir los canales vasculares. Su aspecto también va a depender de la presencia 0 ausencia de cirrosis, trombosis de la vena porta o infiltracién capsular. Suele existir focos de hemorragia y necrosis lo cual produce cambios en la coloracién. Caracteristicas microscépicas Citologia Las células tumorales son cominmente poligonales y tienen, un incremento de la relacién nucleo citoplasmico. Comparado con el hepatocito normal, el citoplasma va a mostrar cambios como es una mayor basofilia, pueden contener inclusiones como, hialina de Mallory o cuerpos aciddfilos los cuales estan compuestos de productos proteicos tales como alfa-l-antitripsisna, albimina, fibrindgeno o ferritina (Anthony P, 1994). En algunos casos la presencia de grasa, glucégeno 0 incluso agua, puede dar al citoplasma una apariencia clara. Este aspecto puede observarse focalmente o bien puede el tumor estar predominantemente constituido por este tipo de células, lo cual puede plantear problemas de diagnostico diferencial en los higados no cirréticos con las metdstasis del carcinoma renal. El nicleo es redondo con presencia de frecuente nucléolo prominente. 24Introduccién Gradaci6n El grado de diferenciacién puede ser desde bien diferenciado a indiferenciado o muy anaplasico, pasando por todos los estadios intermedios. El sistema de gradacién va del I al IV (Edmonson y Steiner, 1954), sin que tenga gran significado pronéstico, observandose con gran frecuencia mas de un grado en el mismo tumor incluso en aquellos menores de 2 cm. Los grados describen proporcionalmente el incremento de hipercromasia, variabilidad nuclear, relacién nticleo/citoplasma y perdida de la arquitectura trabecular. Grado I. En las neoplasias mas diferenciadas, las células recuerdan a las originales, con minima atipia citolégica y distorsién arquitectural. Ellos son morfolégicamente similares a los adenomas y el reconocimiento del tumor como maligno puede depender de la existencia de metastasis 0 la asoci: i6n con otros focos de hepacocarcinoma grado Il o mayor (Craig J, Peter H, Edmondson H, 1989). Muchas de estas lesiones son ahora consideradas como “borderline”, cuando no hay evidencia de metastasis. (Ferrell L, Crawford J, Dhillon A, et al, 1993). Grado II. Son tumores compuestos de grandes células con un citoplasma granular eosindfilo, bordes bien definidos, nicleos anémalos, pudiéndose observar trabéculas tipicas, asi como, acinos y estructuras papilares. Grado III. En estos se aprecia un mayor pleomorfismo, siendo por tanto su citologia més variable, pudiéndose objetivar a menudo células gigantes y multinucleadas, no siendo habitual la presencia de bilis.Introduccion Grado IV. Se ha reservado éste, para los tumores anaplasicos, que resultan muy frecuentemente dificil de diagnosticar como hepatocarcinomas, debido a que presentan un aspecto muy alejado del hepatocito normal siendo dificil su clasificacién. En general se suelen caracterizar por la presencia de amplias dreas de células fusiformes y capas de células anaplasicas con ntcleos picnoticos que recuerdan a los sarcomas. La mayoria de los hepatocarcinomas corresponden a los grados II y III, siendo escasa, y para algunos autores nula la relacién entre el grado tumoral y el prondstico (Ishak K, Anthony P, Sobin L, 1994). Segtin aumenta el grado vemos como la célula aumenta de tamaiio y los nucléolos se hacen mas prominente. En los mejor diferenciados, vacuolas de bilis pueden detectarse en algunas células. En general, al microscopio, estas neoplasias contienen una escasa cantidad de estroma; este es de tipo capilar y menos abundante que en los colangiocarcinomas del higado. En los tumores menos diferenciados, no es raro detectar la presencia de células gigantes, que pueden hallarse aisladas, con nucleos unicos, lobulados 0 multiples, o formar un sincitio. Algunas células contienen lipocromos, y los tumores pueden tener zonas de metamorfosis grasa. (Burdette WJ, 1980). 4, Patrones histolégicos Se han descrito numerosos patrones, pudiéndose objetivar varios de estos en un mismo tumor. Aunque son importantes para el patélogo para 26Introduecién reconocer su aspecto morfologico, sdlo algunos parecen tener significacion pronéstica. Los subtipos de carcinoma hepatocelular en los que se ha objetivado variaciones en cuanto a su _ significacién prondstica frente al hepatocarcinoma comin y por tanto merecen ser considerados especialmente son: a) Hepatocarcinoma fibrolamelar. Es una rara variante de hepatocarcinoma (Craig JR, et al; Berman MM, et al, 1980), que difiere clinica e histologicamente del hepatocarcinoma tipico. Las caracteristicas de los pacientes con hepatocarcinoma fibrolamelar son notablemente diferentes, tiene prevalencia en pacientes jévenes (edad media de 26 afios), igual relacién entre sexos, y falta de asociacién con higados cirroticos u otras enfermedades hepaticas subyacentes (Wood WJ, 1988). Tienen un mejor pronéstico que el hepatocarcinoma tipico, especialmente si la lesién puede ser totalmente resecada (Hodgson HJF, 1987). El hepatocarcinoma fibrolamelar se puede presentar de forma incidental 0 con sintomatologia inespecifica tales como, dolor abdominal, anorexia y perdida de peso, ictericia, y ocasionalmente hemoperitoneo. No se han establecido factores de riesgo. Generalmente presentan niveles normales de alfa feto proteina sérica, pero raramente se han descrito niveles altos (Berman MA, 1988). Otros tests de funcién hepatica como son transaminasas y fosfatasa alcalina pueden estar discreta o moderadamente aumentadas. 27Introduccién Macroscopicamente se presentan como tumores bien delimitados, coloracién pardusca con evidentes focos de fibrosis. Puede ser una cicatriz central que recuerda la de la hiperplasia nodular focal. Lesiones satélites son raras y focos de necrosis 0 hemorragia sdlo se ven en tumores muy grandes. Microscépicamente se presentan constituidos por nidos de hepatocitos con grandes ntcleos redondeados con un nucléolo prominente, el citoplasma es granular, eosinéfilo, denso, de aspecto oncocitico separados por bandas de fibrosis lamelar o (bandas paralelas). Otra caracteristica tipica es la presencia de “cuerpos palidos” citoplasmicos; estos son redondos u ovales, claros o levemente eosin6filos, los cuales contienen albimina y fibrinégeno. (Anthony P, 1994). Inclusiones hialinas pueden también estar presentes, a menudo PAS diastasa positiva, y probablemente representan una variedad de secreciones de glicoproteinas. Figuras de mitosis, células multinucleadas, grupos acinares, tapones biliares, depdsitos de cobre y grasa son raras veces observadas. La presencia de produccién focal de mucina y diferenciacion neuroendocrina han sido descrita, pero no tienen significacién pronéstica. (Wang J, 1991). b) Hepatocarcinoma de células claras. Esté caracterizado como su nombre indica por células tumorales con prominente citoplasma claro debido a la pérdida de glucégeno y/o grasa durante su procesamiento. El 20-40% de los hepatocarcinomas contienen de forma ocasional o focal células claras, sin embargo la presencia de forma difusa de células claras es mucho més rara 5-16%, y se ha relacionado a estos ultimos con un 28Introduecién mejor pronéstico (Lai CL, et al, 1979, Kishi K. Et al, 1983, Buchanan TF). Y Huvos AG., 1979). Unos pocos casos han sido asociados con hepatitis noA-noB. C) Otros patrones de carcinoma hepatocelular. La WHO ha definido los siguientes (Ishak K, 1994): 1) Trabecular o sinusoidal. Es el mds comin, suele considerarse como la forma o patrén clasico, constituido por placas de hepatocitos, tapizados por células endoteliales aplanadas que recuerdan a la trabécula hepatocitaria normal, aunque la relacién nicleo/citoplasma de los hepatocitos esta incrementada y sus nucléolos son mas prominentes. Constituye la mayor parte de los tumores bien o moderadamente diferenciados, y suelen con frecuencia mostrar dreas de otro patron histoldgico. 2) Pseudoglandular (acinar o adenoide). Se encuentran al menos focalmente en el 20-40% de los hepatocarcinomas, siendo menos frecuente que los trabeculares o sdlidos. Su morfologia presenta espacios tipo glandulas tapizadas por células tumorales. Los espacios pueden resultar de necrosis de la parte central de la trabécula y pueden contener restos celulares, macréfagos o proteinas. Material PAS positivo diastasa resistente puede encontrase en su luz. Estructuras acinares pueden también formarse por la dilatacién 0 expansion de canaliculos biliares y pueden Ilenarse de bilis (Kondo Y, 1987). 3) Sélido 0 compacto. Consiste en células tumorales comprimidas, donde parecen faltar las trabéculas hepatocitarias tapizadas por las 29Introduccién células endoteliales; sin embargo al utilizar marcadores de células endoteliales revela su presencia en trabéculas comprimidas. 4) Esclerosante o escirro. Este término ha sido utilizado para definir carcinomas hepatocelulares, colangiocarcinomas o mixtos colangio- hepatocarcinomas que contienen estructuras tubulares neoplasicas rodeadas por estroma fibroso intenso y que estén generalmente asociadas a hipercalcemia (Omata M, 1981). Este tumor puede ser confundido con metastasis de adenocarcinoma por la presencia de fibrosis peritubular difusa. Las areas de fibrosis son muy prominentes y pueden estar asociadas a cualquiera de los otros patrones. 5) Pelioide. Caracterizado por prominentes lagos vasculares. 6) Anaplasico 0 pleomérfico. Constituido por células gigantes, muy pleomérfico, y a veces células fusiformes, comprende sdlo el 2% de los casos. Otras raras variantes son las formas mixtas colangio- hepatocarcinomas con elementos osteo y condrosarcomatosos (Ferrell LD., 1997). 5. Ultraestructura La ultraestructura del carcinoma hepatocelular ha sido estudiada ampliamente tanto en animales de experimentacién como en casos clinicos. Quizds la caracteristica mas marcada consista en el contorno irregular de los nticleos y en las seudoinclusiones citoplasmicas, junto con una rara disgregacién del nucléolo. Los nucleos pueden contener inclusiones lipidicas. En el citoplasma puede observarse una marcada alteracién del reticulo endoplésmico rugoso, con cisternas dilatadas y en proliferacion. En algunas células, el reticulo endoplasmico se dispone 30Introduccién principalmente alrededor de las mitocondrias. Ocasionalmente, las membranas presentan un aspecto desgranulado y fragmentado. El reticulo endoplasmico liso tiende a proliferar, presentando dilataciones e invaginaciones, observandose en algunas células una disposicién que recuerda una huella dactilar, consistente en laminas concéntricas irregulares. Las mitocondrias presentan un notable polimorfismo, crestas irregulares y un aspecto hinchado, asi como inclusiones cristalinas. No se han descrito alteraciones del aparato de Golgi. En algunos casos puede existir una disminucién de la cantidad de glucdgeno. Numerosos investigadores han descrito la presencia de cuerpos densos rodeados de membrana, especialmente en las cercanias de los polos biliares. El citoplasma puede presentar lipofuscina, Iipidos y vacuolas autofagicas con sustancia mieloide y pigmentos, y también canaliculos biliares y desmosomas. (Shaff Z, et al. 1971; Reubner BH, et al. 1967; Kay S y Schizki P, 1971). 6. Diagnostico diferencial. Inmunohistoquimica. Los problemas de diagnéstico diferencial se plantean principalmente entre los tumores malignos bien diferenciados con entidades benignas y tumores pobremente diferenciados con otras neoplasias. Los hepatocarcinomas bien diferenciados suelen presentar problemas sobre todo con los nédulos macroregenerativos, ndédulos borderline etc. La diferencia con otros adenocarcinomas se realiza con técnicas para mucinas ya que estas no deberian estar presente en los hepatocarcinomas 31Introduccién salvo en los combinados con colangiocarcinomas y en algunos casos de hepatocarcinoma fibrolamelar. Las técnicas inmunohistoquimicas son fundamentales para distinguir tumores hepaticos benignos y malignos. La alfa feto proteina cuando es Ppositiva es un buen marcador de hepatocarcinoma; desafortunadamente se observa de forma parcheada y esta ausente en aproximadamente el 50% de estos. (Furich L., 1994). El CEA cuando tifie los canaliculos biliares es altamente especifico, (Carroza M, 1991) pero sdlo ayuda en las lesiones bien diferenciadas y no diferencia tumores hepatocelulares benignos de malignos. Citoqueratinas 8 y 18 se ven generalmente en tumores con diferenciacién hepatocelular (Hurlimann J, 1991); generalmente el CAM 5.2 que consiste en citoqueratinas 8 y 18 puede ser positiva, mientras que las AE1 Y AE3, que contienen la mayoria de las otras queratinas excepto las 8 y 18 son negativas. Sin embargo, ambas tifien la mayoria de los carcinomas tipo ductal, por lo que el CAM 5.2 no puede ser utilizada exclusivamente. Factor XIIla es a menudo positivo en el hepatocarcinoma pero rara vez tifie adenocarcinomas; sin embargo, en combinacién con una alfa-1-antitripsina positiva (la cual en si mismo no es muy especifica), incrementa la sensibilidad para el hepatocarcinoma. Las metastasis de carcinoma renal, las neoplasias neuroendocrinas y melanomas pueden también plantear problemas de diferenciacién con el hepatocarcinoma. El carcinoma renal simula un hepatocarcinoma de células claras y la queratina CAM 5.2 es también positiva, pero el CEA positivo para el hepatocarcinoma y sobre todo si la Alfa feto proteina es negativa ayudan en su diferenciacién. Los melanomas pueden simular 32Introduccion hepatocarcinomas por lo que es importante la S-100 y HMB 45 los cuales son negativos en el hepatocarcinoma. 7. Factores pronésticos Hasta hace poco, el hepatocarcinoma era considerado una entidad de pronéstico uniformemente fatal. Esta vision tan pesimista se basa en el hecho de que a menudo el diagnéstico se realiza muy tardiamente. Por lo general el fallecimiento esta en relacién con hemorragia digestiva, hemoperitoneo masivo tras rotura del tumor, insuficiencia hepatocelular © insuficiencia renal progresiva. (Berenguer J, et al, 1986). Se han descrito casos aislados de regresién espontanea (Sato Y, 1985), lo que sugiere la existencia de mecanismos “naturales” reguladores del crecimiento tumoral (Gottfried EB, Steller R, Paronetto F, et al, 1982), asi como varios casos de supervivencias prolongadas en pacientes con hepatocarcinoma (Yoshida T, Okazaki N, Yoshino M, et al, 1982). Dejando aparte estas raras excepciones, la supervivencia media de los pacientes con hepatocarcinoma es baja, generalmente de pocos meses tras el diagnéstico. El pronéstico de estos pacientes va a depender de: a) Estadio del tumor. Un sistema de estadiaje fue propuesto por Okuda et al. , en el que se consideran cuatro parametros: tamafio del tumor superior al 50% del volumen hepatico, presencia de ascitis, albimina sérica <3g/dl y bilirrubina sérica >3mg/dl, como indicadores del estado avanzado del 33Introduccién proceso (Okuda K, Ohtsuki T, Obata H, et al, 1985). El estadio I (menos avanzado) no tiene ninguno de los signos anteriores, el estadio II (moderadamente avanzado) presenta uno 0 dos signos y el estadio III (muy avanzado) se define por la presencia de tres o cuatro de los signos mencionados. La ausencia de cirrosis acompafiante, asi como, la existencia de tumores de pequefio tamafio, sobre todo si son menores de 3 cm van a tener buena influencia pronéstico, (Zhao-you T, 1985; Craig J, Peter R, Edmondson H, 1989). Okuda encontr6 que la supervivencia media de 229 pacientes con hepatocarcinomas no tratados fue de 1.6 meses en general y, segiin el estadio 0,7 meses en el estadio III, 2 meses para el estadio II y 8,3 meses en el estadio I. El grado de diferenciacién tumoral puede influir en la expresién celular de alfa-fetoproteina, encontrando que todos los hepatocarcinomas grado I fueron negativos para AFP, mientras que el 20% de los de grado II, 36% de los de grado III, y 16% de los de grado IV, mostraron positividad para AFP (Brumm C, et al, 1989). Aunque se ha sugerido en algunos estudios realizados en Asia (Chen DS, Sheu JC, Shun JL, et al, 1982; Okuda K, et al, 1985) que el reconocimiento temprano del hepatocarcinoma en __ fases presintomaticas, mediante la determinacién secuencial de alfa- fetoproteina sérica y ecografia en los portadores crénicos del HbsAg, puede ser util para mejorar el prondstico, estos resultados no han sido confirmados en estudios realizados en Europa (Durand F, et al, 1993). No existe una clara relacién entre le grado histolégico y el pronéstico (Okada S, et al, 1994) con la excepcién del hepatocarcinoma fibrolamelar que como ya hemos mencionado anteriormente tiene un mejor prondstico, con una supervivencia media prolongada incluso en presencia de metédstasis a distancia, por lo que su hallazgo no debe ser 34Introduccién considerado ominoso a corto plazo (Craig JR, Peters RL, Edmondson HA et al, 1980). b) Reseccién quirtrgica. Aproximadamente un 10 a 20% de los pacientes, tienen tumores potencialmente resecables, produciéndose en estos casos a los que se les realiza reseccién quirtrgica una elevacién de la supervivencia media a 1- 2 afios. La extirpacin completa del tumor va a ser por tanto uno de los factores mas importante para un prondstico favorable (Castell A, et al, 1993). ¢) Otros parametros. Existen otros pardmetros que parecen influir en el prondéstico, como son la ausencia o presencia de invasién vascular (Wakan K, et al, 1985, y Okada S, Shimada K, Yamamoto J, et al; Izumi R, et al, 1994), esta Ultima implica un peor pronéstico, asi como, la infiltracién de la cApsula de Glison (Hamazaki K, et al, 1992; Torii A, et al, 1994). La invasion vascular es objetivada mds a menudo cerca de los margenes 0 areas terminales del tumor, y no suele observarse en tumores< 2 cm de didmetro. Cualquier apreciacién macroscépica de posible invasion de grandes vasos, deberia ser estudiada y corroborada microscépicamente. Recientes estudios han sugerido que para algunos tipos de tumores, la 35Introduccién existencia de al menos 1 cm de margen libre de tumor tras la reseccién de este, puede conllevar un mejor pronéstico. (Cady B, et al, 1992; Schoenthaler R, et al, 1994). d) Tratamiento médico y agentes quimioterapicos. Diversos tipos de estos han sido recomendados y utilizados. Sin embargo, quimioterapia sistémica intravenosa u oral no ha reportado mejora significativa en pacientes con hepatocarcinoma, excepto la Adriamicina (Vogel CL, et al, 1977 y Olweny CLM et al, 1980) que parece tener una relativa mejor respuesta. En Japon la mitomicina C ha sido preferida frente a otros agentes, utilizindose como bolos de inyeccién arterial intrahepdtica. Sin embargo, para algunos investigadores, (Okuda et al, 1987) este procedimiento no fue muy favorable. e) Embolizacién arterial y quimioembolizacion. En la ultima década_y sobre todo en los tltimos afios en Japon, esta técnica ha ido incrementandose, sobre todo para los casos de hepatocarcinomas de tipo expansivo, sobre todo, si son encapsulados, obteniéndose la casi completa necrosis del tumor por este procedimiento, lo cual conlleva una significativa prolongacién de la supervivencia en pacientes con estadio II, y cuando se compara con los resultados obtenidos por cirugia en el mismo estadio no se encuentran diferencias 36Introduccién significativas. Sin embargo, en pacientes en estadio I, no se ha encontrado mejora en la supervivencia. f) Trasplante. El trasplante hepatico se ha mostrado desde su introduccién como el tratamiento ideal, sobre todo en los hepatocarcinomas sobre higados cirréticos. Dos grandes problemas existen para que pueda ser utilizado a escala mundial, uno es el econdmico, dado que es un tratamiento costoso, y el mas importante, la limitacién que supone depender de la obtencién de érganos. g) P53 y complejo cadherina E-catenina ¢ Entre los factores prondsticos que pueden estar implicados en la carcinogénesis, gradacién y estadio de los hepatocarcinomas, se encuentran las alteraciones y mutaciones del gen supresor p53 y las moléculas de adhesién celular cadherina epitelial (E-CD), complementadas por sus proteinas cateninas (a, , 7). Dado que se conoce poco de sus implicaciones en el hepatocarcinoma y de los escasos estudios los resultados obtenidos son conflictivos, y a veces contradictorios, vamos a valorar la sobreexpresién del gen supresor p53, asi como, la expresién inmunohistoquimica de E-CD y alfa, beta y gamma cateninas. La evaluacién por tanto de todos ellos y su relacin con el hepatocarcinoma son parte primordial en el trabajo de 37Introduceién ésta tesis y por tanto seran desarrollados por separado, y de forma especial mas adelante asi como en el objetivo, método y resultados. C) REGULACION DEL CRECIMIENTO CELULAR NORMAL 1. Ciclo celular Los organismos superiores pluricelulares requieren durante su desarrollo, e incluso una vez alcanzada la madurez, de sucesivas y complejas divisiones celulares. Durante este proceso, a partir de una misma célula madre progenitora, se generan dos células hijas iguales entre si. Para ello, la célula madre experimenta una duplicacién exacta de su material genético (ADN), y posteriormente la biparticién del mismo. Los principales hechos que acontecen en el ciclo celular pueden ser divididos en dos apartados: el primer grupo lo constituye aquellos cambios que afectan directamente al material genético o “ciclo cromosémico”, y el segundo, los factores y mecanismos citoplasmicos responsables del control del proceso 0 “ciclo citoplasmico”. Es necesario sefialar que, si bien tienen lugar de forma paralela y existen formas para observar uno u otro por separado, no son realmente independientes entre si, sino que los distintos hechos que acontecen en el ciclo cromosémico son consecuencia de sucesos concretos citoplasmicos siendo, estos ultimos responsables del control del ciclo cromosémico.Introduccién Ciclo cromosémico Durante este proceso, la célula progenitora duplica su material genético y luego lo reparte por igual entre las dos células hijas. Puede dividirse en 4 fases: Fase G1. Durante esta fase los cambios en el ambito cromosémico no es evidente, siendo, principalmente, una fase citoplasmica en la que se va preparando la célula para la siguiente etapa. Esta parte del ciclo es regulada por diversos factores (proteinas-quinasas, ciclinas, etc.) responsables de que la duracién de la misma sea mayor o menor (entre 10 y 24 horas), e incluso Ja célula podra escapar del ciclo y pasar a una fase quiescente (GO), sin capacidad de dividirse cobrando una importancia capital en la regulacion del control de una poblacion celular. Fase S. Durante esta etapa, algunos de los productos acumulados en el citoplasma durante la fase anterior actian a modo de sefial y ponen en marcha el proceso de replicacién del ADN, mediante el cual la célula duplica su material genético. Para ello, primero separa las dos cadenas de ADN que forman la doble hélice y luego sintetiza, a partir de cada una de ellas, otra “complementaria”. En conjunto, es un proceso de una duracién estable, generalmente en torno a las ocho horas. Fase G;. Esta etapa precede a la mitosis, y al igual que en la fase G; no se producen cambios significativos objetivables en el ADN. En este momento, la célula ha completado ya la duplicacin de su material genético, iniciéndose un periodo de reparacién de los errores que puedan 39Introduccion haberse producido durante la fase precedente, de manera que sin estas reparaciones la célula no entra en mitosis. En este proceso reparativo participan proteinas como p53, p21, bax, pGADD45, etc. En general, la duracion de la fase G; oscila entre las 4 y 5 horas. Mitosis. Representa la fase de menor duraci6n del ciclo celular. Tan sdlo el 5% de las células de una poblacién normal, en un tejido fijado, estan en mitosis en un momento dado. Durante esta fase, el material genético ya duplicado se condensa y queda organizado en forma de cromosomas. Finalmente, éstos son dirigidos a los dos polos celulares (divisién que se realiza a partes iguales cuantitativa y cualitativamente) para, tras el proceso de citocinesis (particién citoplasmica), quedar repartidos entre las dos células hijas. La duracién de esta fase es aproximadamente dos horas, siendo un hecho constante y poco modificable por las distintas circunstancias que puedan acontecer. Ciclo citoplasmico. Existe, a nivel citoplasmico, todo un engranaje de proteinas de diversa naturaleza, cuya misién es la de asegurar que los acontecimientos del ciclo cromosémico ocurran siempre en un orden predeterminado. Estas proteinas funcionan a modo de cascada, de tal forma que el acontecimiento de un hecho depende de! precedente. Asi pues, la célula no puede entrar en mitosis hasta que no se haya producido el "factor promotor de mitosis", el cual no puede ser producido hasta que desaparezca el "factor de retraso de fase M". Este y el “activador de la fase S" no pueden desaparecer hasta que la sintesis de ADN haya 40Introduccién concluido, la cual no termina hasta que todo el ADN se haya duplicado. Por ultimo, el inicio de esta replicacién no puede tener lugar hasta que el "bloqueo de la re-replicacién" sea eliminado cuando, después de pasar por mitosis, se alcance la fase G1. Esta interdependencia entre los dos ciclos hace que ambos se desarrollen de una forma compenetrada. Los factores de naturaleza proteica responsables del control del ciclo celular se distribuyen en dos grupos principales (Nurse, 1990; Reed, 1992; Murray y Hunt, 1993) * Grupo de las “proteinas-quinasas”. Estan presentes de forma constante a lo largo del ciclo, sin modificaciones en su concentracion. Cuando son activadas actiian fosforilando distintos substratos proteicos, poniendo en marcha cada uno de los acontecimientos del ciclo celular (Draetta y Beach, 1988). * Grupo de las proteinas “ciclinas”. Denominadas asi por su cardcter y accion ciclicos en momentos precisos, desapareciendo mas tarde. Su presencia determina la activacién de las proteinas anteriores, mediante la formacién de complejos ciclinas-proteinas/quinasas (Evans et al, 1983). Hasta la fecha, se han aislado y caracterizado numerosos tipos distintos de ciclinas, habiéndose trazado, al mismo tiempo, un mapa temporal de su expresion durante el ciclo. De manera resumida, se acepta que existen cinco tipos principales de ciclinas (denominadas A-E), asi como subgrupos dentro de cada uno de ellos. Las ciclinas C, D1-3 y E alcanzan su pico de sintesis y actividad durante la fase G1 y, aparentemente, regulan la transicién de G1, a fase S. Las ciclinas A y B1-2 consiguen sus niveles maximos en fases mds avanzadas del ciclo, durante las fases S y 41Introduccién G2 y, se piensa, que juegan un papel regulador en la transicion a la mitosis. De forma similar, también estan siendo identificadas numerosas moléculas proteinas-quinasas dependientes de ciclinas (Cdk) y, ademas, se estan reconociendo las asociaciones especificas de cada una de ellas con los distintos tipos de ciclinas. Se ha propuesto que complejos formados por ciclinas DI y Cdk4 gobiernan la progresién del ciclo durante la fase Gl, mientras que la ciclina E-Cdk2 controla la entrada a fase S. La unidad ciclina A-Cdk2 ejerce su accién durante la fase S y la ciclina B- Cdkl controla la entrada en mitosis (Lewin, 1990). Ademas de estos mecanismos anteriores, _ responsables del funcionamiento correcto del ciclo cromosémico, existen otros mecanismos, también citoplasmicos, gracias a los cuales se asegura la estabilidad genética. Actian en momentos muy precisos del ciclo, Hamados “puntos criticos”, y constituyen la Ilave que determina la entrada en fase S y mitosis. (King et al, 1994; Nurse, 1994; Sherr, 1994). * Al final de la fase G, existe un control encargado de evitar la entrada de la célula, en fase S si se aprecian dafios en el material genético, induciendo apoptosis si éstos no son reparados. De esta forma se evita la transmision y perpetuacién de estas alteraciones. Si, por el contrario, los dafios reconocidos consiguen ser subsanados, el freno desaparece y el ciclo continua, entrandose en fase S. *Terminada la fase S de duplicacion del ADN, durante la fase G2, se encuentra el segundo punto critico, que no permite la entrada en mitosis mientras sean reconocibles errores que hayan podido ocurrir durante la sintesis del nuevo ADN. Solamente una exacta duplicacion del material genético permitira el paso a la fase de mitosis.Introduceién 2. Regulaci6n postranscripcional del ciclo. Existen otros productos de naturaleza proteica, distintos a las ciclinas y proteinas-quinasas, que también tienen capacidad reguladora del ciclo celular. Estos productos, codificados por genes concretos, ejercen su accion basicamente de dos formas: facilitando y estimulando el ciclo, 0 frenandolo e impidiéndolo. Precisamente, la base del proceso de carcinogénesis es el dafio “no letal” a nivel de estos genes, con la induccién de divisiones celulares incontroladas (Cordén Card6, 1995; Cordon y Reuter, 1997). En condiciones normales, el crecimiento celular comienza con la localizado generalmente en la superficie, o en el interior de la célula union de un factor de crecimiento o ligando a su receptor especifico, (hormonas esteroides). La mayoria de los receptores, al interaccionar con su ligando, dan lugar a reacciones de fosforilizacién proteica. Por otro lado, en la membrana celular existen una serie de proteinas ligadoras de guanosina trifosfato (GTP), como las pertenecientes a la familia “ras”, que son esenciales en la transduccién de la sefial hasta la porcién interna de la membrana. Estos estimulos acttian fosforilando proteinas y activando a los segundos mensajeros, que transfieren la sefial, a través del citoplasma, hasta el nucleo, donde se inducen una gran cantidad de genes ligados a los procesos proliferativos celulares. La fosforilizacién proteica est4 regulada por fosfatasas, fundamentales en el crecimiento, al controlar a las quinasas, inhibiendo el ciclo celular. Las dianas principales de la lesién genética son tres clases de genes reguladores normales, los protooncogenes que estimulan el crecimiento, los genes supresores o antioncogenes y los genes que regulan la muerte 43Introduccién celular programada o apoptosis. Se considera que los alelos mutantes de los protooncogenes son dominantes, ya que transforman a las células pese a la presencia de sus contrapartidas normales. Por el contrario para que se produzca la tranfosrmacion neoplasica de la célula, deben resultar dafiados los dos alelos normales de los genes supresores del cancer, por lo que esta familia de genes se denomina a veces oncogenes recesivos. Los genes que regulan la apoptosis pueden ser dominantes, como los protooncogenes, o pueden comportarse como genes supresores del cancer. Ademas de estas tres clases de genes ya mencionados, existe una cuarta categoria de genes que regulan la reparacién del DNA dafiado, y que también estan implicados en la carcinogénesis. La carcinogénesis es un proceso de pasos miiltiples, tanto en el ambito fenotipico como genético. Una neoplasia maligna posee varios atributos fenotipicos, como el crecimiento excesivo, la capacidad de infiltracién local y la de producir metastasis a distancia. Estas caracteristicas se adquieren de manera progresiva, fendmeno al que se ha denominado progresién tumoral. A nivel molecular, la progresién es consecuencia de la acumulacién de lesiones genéticas que, en algunos casos, estén potenciadas por los defectos de la reparacion del DNA. 3. Control de poblaciones celulares El numero de elementos constitutivos de una poblacién celular resulta de la homeostasis entre fuerzas contrapuestas. Los mecanismos que participan en la regulacién del crecimiento celular y en el mantenimiento de la poblacién son basicamente los siguientes: 44Introduceién Diferenciacién. El impacto de este fendmeno en el control de una poblacion celular depende de si ésta es tumoral 0 no. En las poblaciones normales, la diferenciacién celular influye de una forma limitada y, esencialmente, depende de la estirpe histogenética a la que pertenezcan las células. Existen células llamadas indivisibles (células nerviosas, musculares esqueléticas y cardiacas); células quiescentes, con capacidad de entrar en ciclo ante ciertos estimulos (células parenquimatosas y mesenquimales) y, células labiles, que a0enas requieren estimulos para encadenar ciclos celulares (células de epitelios de superficie y hematopoyéticas blasticas). En el caso de los tumores, la diferenciacién adquiere un mayor peso relativo respecto del control de la poblaci6n celular y, al mismo tiempo, pasa a depender de circunstancias distintas: 1. Por un lado, sabemos que lo universalmente es conocido como “grado de diferenciacién” (entendida como la forma en que un tumor determinado remeda al tejido del que se origina) influye en la tasa de crecimiento; de manera que aquellos tumores bien diferenciados tienden a tener tasas de crecimiento sensiblemente menores que aquellos otros pobremente diferenciados. N Por otra parte, los tumores, en su evolucién temporal, ademas de poder modificar su grado de diferenciacién (generalmente de mejor a peor), sufren cambios en otras propiedades sin reflejo en la morfologia. A menudo, muchos de estos cambios (por ejemplo, adquisicién de capacidades infiltrativas y metastatizantes) determinan “perdidas” en otras propiedades que, con mucha frecuencia, influyen negativamente en la capacidad proliferante. 45,Introduccién Reclutamiento Gp - G;. El que una célula permanezca en estado estable 0 quiescente, o bien entre en el ciclo celular para completar su division, depende de varios factores que exponemos a continuacién: 1. Existen una serie de sefiales de naturaleza proteica, circulantes en el suero © liberadas directamente desde células vecinas, capaces de poner en marcha la cascada de reacciones citoplasmicas y nucleares responsables de la ejecucién del ciclo celular. A estas sefiales se las conoce con el nombre de factores de crecimiento, Estos factores de crecimiento pueden ser de “progresién”, si son capaces de estimular por si mismos la sintesis de ADN o de “competencia”, que, aunque no estimulan dicha sintesis, convierten a células quiescentes en competentes para hacerlo. La estimulacién de la divisién se realiza mediante mecanismos de accién autocrinos (algunas células tienen receptores para sus propios factores de crecimiento, como por ejemplo las células hepaticas en la hiperplasia compensadora poshepatectomia, y particularmente los tumores) y paracrinos. La presencia 0 ausencia de estos factores, o mejor dicha, su concentracién mayor o menor en un medio concreto, asi como la competitividad por los mismos en funcién del numero de células sensibles, resulta determinante, en gran medida, del porcentaje total de elementos de una poblacién incluido en el ciclo celular, 0 excluido del mismo (G0) (Evered et al, 1985; Ross R, et al, 1986; Deuel, 1987). Sin embargo, el crecimiento de las células tumorales no sdlo puede deberse a sefiales estimuladoras, sino que también puede ser ocasionado por un déficit de sustancias inhibidoras de la proliferacién (como el TGF-B),0 por una mala 46Introduccién respuesta de las células diana a estas sustancias ( Moretti S, et al, 1997). 2. La competitividad celular por los factores de crecimiento no es la unica influencia que afecta al ritmo de la division. En cultivos celulares, se ha observado que a medida que las células se extienden y migran sobre un sustrato, ocupando espacio libre, cambian de forma, afectando notablemente a su capacidad de division. Es posible que, a causa de su mayor 4rea de superficie, cuando las células estan bien extendidas puedan capturar mayor ntimero de factores de crecimiento, y tomar mayores cantidades de nutrientes. Sea cual sea el mecanismo, el hecho claro es que las células requieren de contacto focal con el medio que las rodea para dividirse. Ello apunta fuertemente a que el control de la divisién celular esta, de alguna manera, acoplado a la organizacién del citoesqueleto. La perdida de estos puntos de contacto o anclaje supone la incapacidad de entrar en ciclo. De esta forma, queda asegurado el crecimiento cohesionado de los tejidos, y se impide la proliferacion de células “fuera de su entorno” (Folkman y Moscona, 1978; Dunn e Ireland, 1984; O'neill et al, 1986). 3. Todas las células normales del organismo poseen una caracteristica, atin no del todo bien comprendida, segin la cual pierden la capacidad de dividirse una vez que han completado una serie determinada de ciclos celulares. A esta propiedad, dada su correspondencia con el envejecimiento organico general, se le ha denominado senescencia celular. Recientemente, a través del descubrimiento de la actividad telomerdsica en las células neoplasicas, se ha propuesto un mecanismo segiin el cual, con cada ciclo celular, el material genético sufriria pequefias pérdidas a nivel de los telomeros cromosémicos 47