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Revista británica de Revista británica de farmacología (2017)174628–640 628

BJP Farmacología

TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

Los conjugados de anticuerpo-fármaco anti-CD22 y anti-CD79b

se dirigen preferentemente a las células B en proliferación

CorrespondenciaSaileta Prabhu, Departamento de Ciencias Farmacocinéticas y Farmacodinámicas, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, EE.
UU. Correo electrónico: prabhu.saileta@gene.com

Recibió22 de junio de 2016;Revisado11 de noviembre de 2016;Aceptado15 diciembre 2016

Franklin K Fuh1,*, Carolina Looney1,*, Dongwei Li2, Kirsten A Poon3,8, Randall C Dere5, Dimitri M Danilenko4,
Jacqueline McBride1, Chae Reed5, Shan Chung5, Bing Zheng6, William Rodney Mathews1, Andrew Polson6, Saileta
Prabhu2y marna williams1,7

1Departamento de Biomarcadores Farmacodinámicos, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, EE. UU.,2Departamento de Ciencias Farmacocinéticas y
Farmacodinámicas, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, EE. UU.,3Departamento de Seguridad y Toxicología, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, EE. UU.,4
Departamento de Evaluación de la Seguridad, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, EE. UU.,5Departamento de Investigación y Desarrollo Bioanalítico, Genentech,
Inc., South San Francisco, CA, EE. UU.,6Departamento de Investigación en Inmunología, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, EE. UU.,
7MedImmune, Gaithersburg, MD, EE. UU., y8Denali Therapeutics, Inc., Sur de San Francisco, CA, EE. UU.

* Franklin K Fuh y Caroline Looney contribuyeron igualmente a este manuscrito.

ANTECEDENTES Y OBJETIVO
CD22 y CD79b son receptores de superficie celular expresados en tumores malignos derivados de células B, como el linfoma no
Hodgkin (LNH). Un agente antimitótico, monometil auristatina E, se conjugó con anticuerpos anti-CD22 y anti-CD79b para desarrollar
terapias específicas para el LNH. El mecanismo de acción (MOA) y los perfiles farmacológicos y farmacocinéticos (PK) de estos
conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC) se investigaron en monos cynomolgus.

ENFOQUE EXPERIMENTAL
A los animales se les administraron ADC anti-CD22 o anti-CD79b, los respectivos anticuerpos no conjugados o vehículo. A continuación, se evaluaron los
efectos farmacodinámicos sobre las células B totales y en proliferación y la farmacocinética sérica. Se evaluó la citotoxicidad celular dependiente de
anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de los ADCin vitro.

RESULTADOS CLAVE
Se observó el agotamiento de las células B después de la administración de ADC o de los respectivos anticuerpos no conjugados. Se observó una duración prolongada
del agotamiento en animales a los que se les administró ADC. De manera similar, el agotamiento preferencial de las células B en proliferación en la sangre y las células
B del centro germinal en el bazo solo se observó en animales a los que se les administró ADC. Los perfiles de PK en suero de los ADC y los respectivos anticuerpos no
conjugados fueron comparables.invitro,los anticuerpos anti-CD22 humano y anti-CD79b humano mostraron actividad ADCC nula o moderada, respectivamente;
ninguno de los anticuerpos tenía actividad CDC.

CONCLUSIONES Y CONSECUENCIAS
Los hallazgos respaldan el MOA propuesto: agotamiento inicial de las células B totales por opsonización mediada por anticuerpos, seguido de agotamiento
preferencial y sostenido de las células B en proliferación por el conjugado de auristatina debido a su acción antimitótica. La administración de agentes antimitóticos
potentes a las células B a través de la especificidad de los anticuerpos monoclonales proporciona un medio para eliminar las células B patógenas en el LNH con perfiles
de riesgo-beneficio mejorados en comparación con la quimioterapia tradicional.

DOI:10.1111/bph.13697 © 2016 Genentech. Revista británica de farmacología

publicado por John Wiley & Sons Ltd en nombre de la Sociedad Farmacológica Británica.
Este es un artículo de acceso abierto bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs, que permite el uso y la distribución en cualquier
medio, siempre que se cite correctamente el trabajo original, el uso no sea comercial y no se realicen modificaciones ni adaptaciones. .
 Farmacología de los ADC anti-CD22 y anti-CD79b BJP

abreviaturas
ADC, conjugado anticuerpo-fármaco; ADCC, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos; AICC, citotoxicidad celular independiente
de anticuerpos; anti-CD22, anti-CD22 humano; anti-huCD79b, anti-CD79b humano; AUCinf, AUC extrapolada al infinito; BJAB, línea
celular de linfoma de Burkitt; CDC, citotoxicidad dependiente del complemento; Cmax, concentración sérica máxima; FSC, dispersión
frontal; GC, centro germinal; H&E, hematoxilina y eosina; mAb, anticuerpo monoclonal; MC-VC-PAB, maleimidocaproil-valina-citrulina-p-
aminobenciloxicarbonilo; MMAE, monometil auristatina E; MOA, mecanismo de acción; LNH, linfoma no Hodgkin; NHP, primate no
humano; PBMC, célula mononuclear de sangre periférica; PK, farmacocinética/s; TA, temperatura ambiente; SSC, dispersión lateral;
TMB, tetrametilbencidina; Vss, volumen de distribución en estado estacionario

Tablas de Enlaces

OBJETIVOS LIGANDOS

CD22 Rituximab
CD79b

Estas tablas enumeran ligandos y dianas de proteína clave en este artículo que están vinculados a las entradas correspondientes en http://
www.guidetopharmacology.org, el portal común para datos de la Guía de FARMACOLOGÍA IUPHAR/BPS (Southanet al.,2016), y están archivados permanentemente
en la Guía Concisa de FARMACOLOGÍA 2015/16 (Alexanderet al.,2015).

Introducción los hace ideales para la administración dirigida de agentes citotóxicos

Los trastornos linfoproliferativos de células B son neoplasias malignas
heterogéneas que van desde linfomas indolentes de crecimiento lento
hasta linfomas agresivos. Los linfomas no Hodgkin (LNH), caracterizados
por el crecimiento patógeno de células B, son un conjunto diverso de
neoplasias malignas que varían ampliamente en agresividad y resultado
clínico. Los NHL son una de las neoplasias malignas de células B más
comunes en los Estados Unidos con una incidencia de más de 65 000
casos nuevos al año y continúan aumentando (Burton y Goldenberg,
2010).
A pesar de las nuevas terapias quimioterapéuticas y de anticuerpos
monoclonales (mAb) (p. ej., rituximab), los linfomas de células B
indolentes tienen opciones de tratamiento limitadas. Esto subraya la
necesidad de tratamientos que extiendan significativamente la
supervivencia libre de enfermedad y general en estos pacientes. Las
terapias que combinan la especificidad dirigida a células de un mAb con
la citotoxicidad de un quimioterapéutico podrían ofrecer una mayor
seguridad y eficacia en comparación con las terapias actuales. Los
conjugados de fármaco-anticuerpo (ADC, por sus siglas en inglés) son
una nueva terapia de este tipo; están compuestos por un mAb conjugado
con un agente citotóxico. Los tratamientos con ADC que se dirigen a los
antígenos CD22 y CD19 han mostrado resultados prometedores en los
primeros ensayos clínicos en NHL (Sievers y Senter, 2013).
CD22 y CD79b son receptores de superficie celular cuya expresión
está restringida a células Pre-B y células B maduras (excluyendo células
plasmáticas). CD22 y CD79b son objetivos prometedores para los ADC, ya
que se expresan en la mayoría de los tumores malignos derivados de las
células B, incluidos casi todos los subtipos principales de LNH (Dornanet
al.,2009; Polsonet al.,2010). CD22 y CD79b se expresan tanto en el linfoma
folicular primario como en el linfoma folicular recidivante y en el linfoma
difuso de células B grandes (Dornanet al.,2009; Polsonet al.,2010). Los
anticuerpos unidos a CD22 y CD79b se internalizan rápidamente, lo que
(Shan and Press, 1995).
Hemos generado ADC anti-CD22 humano (anti-CD22) y anti-
CD79b humano (anti-huCD79b) que consisten en un mAb
conjugado con un potente agente antimitótico monometil
auristatina E (MMAE) a través de un enlazador lábil a proteasa,
maleimidocaproyl- valina-citrulina-p-
aminobenciloxicarbonilo (MC-vc-PAB). El fármaco enlazador (vc-
MMAE) se conjuga con el anticuerpo a través de un enlace
tioéter entre el resto maleimida enlazador y un tiol de cisteína
que forma el enlace disulfuro intercatenario en el anticuerpo.
Tras la internalización, las enzimas lisosomales catepsina B y
posiblemente otras cisteína proteasas lisosomales escinden el
enlazador y liberan MMAE (Doroninaet al.,2003; Sutherland et
al.,2006). Una vez liberada, la MMAE se une a la tubulina e
interrumpe la red de microtúbulos, lo que da como resultado la
inhibición de la división y el crecimiento celular (Polsonet al.,
2007; Dornán et al.,2009; Polsonet al.,2009; Zheng et al., 2009).
Este enfoque terapéutico combina la capacidad de
direccionamiento específico y la farmacocinética favorable (PK)
del mAb con la actividad citotóxica de MMAE. Los ADC anti-CD22
y antihuCD79b matan las líneas celulares de NHLin vitroy son
efectivos en modelos de xenoinjerto de ratón de NHL (Dornanet
al.,2009; Polsonet al.,2010).
Los efectos farmacológicos, los perfiles farmacocinéticos y el
mecanismo de acción (MOA) de los ADC anti-CD22 y anti-CD79b se
evaluaron en primates no humanos (NHP). Como el anticuerpo anti-
huCD79b no se une al CD79b del mono cynomolgus, se utilizó un
anticuerpo anti-CD79b sustituto en los estudios de NHP. El
anticuerpo/ADC anti-CD79b sustituto se parece al mAb/ADC
antihuCD79b con respecto a la actividad farmacológica, por lo que
los estudios preclínicos realizados con la molécula sustituta
proporcionaron información farmacológica relevante y útil (Zhenget
al.,2009). Perfiles farmacocinéticos de anti-CD22 o anti-CD79b

Revista británica de farmacología (2017)174628–640 629

 FK Fuh et al.
BJP
Los ADC se evaluaron en suero y los efectos farmacológicos sobre las
células B totales y en proliferación se examinaron en sangre periférica y
tejido. Nuestros hallazgos demuestran el agotamiento dirigido de las
células B en proliferación por los ADC anti-CD22 y anti-CD79b, lo que
respalda el desarrollo de estos ADC para dirigirse específicamente a las
células B patógenas en el LNH.
Métodos
Materiales de prueba
El ADC anti-CD22 consta de un mAb IgG1 anti-CD22 humanizado
y MMAE conjugado a través de un enlazador lábil a proteasa,
maleimidocaproil-valina-citrulina-p-
aminobenciloxicarbonilo (MC-VC-PAB). El fármaco enlazador (vc-
MMAE) se conjuga con el anticuerpo a través de un enlace
tioéter entre el resto maleimida enlazador y un tiol de cisteína
que forma el enlace disulfuro intercatenario en el anticuerpo. El
número medio de moléculas de MMAE por ADC anti-CD22 es de
3,9 (3,9 mol MMAE mol-1de anticuerpo anti-CD22 no conjugado).
El ADC anti-CD22 se une al CD22 humano y del mono
cynomolgus con una afinidad similar.
Similar a anti-huCD79b ADC consta de un mAb IgG1 anti-
huCD79b humanizado conjugado con MMAE a través del
enlazador MC-VC-PAB. El número medio de moléculas de MMAE
por ADC anti-huCD79b es de 3,7 (3,7 mol MMAE mol-1del
anticuerpo anti-huCD79b no conjugado).
El ADC anti-huCD79b se une al CD79b humano pero no al
mono cynomolgus. Por lo tanto, se generó un ADC sustituto,
anti-CD79b que se une específicamente al mono cynomolgus
CD79b. Un epítopo en el mono cynomolgus CD79b, al que se
une el ADC anti-CD79b, es similar al del CD79b humano
reconocido por el ADC anti-huCD79b; ambos ADC tienen una
afinidad similar (Zhenget al.,2009). El ADC anti-CD79b consta de
un mAb IgG1 humano-ratón anti-CD79b quimérico conjugado
con MMAE a través del enlazador MC-VC-PAB. El número medio
de moléculas de MMAE por ADC anti-CD79b es de 3,5 (3,5 mol
MMAE mol-1del anticuerpo anti-CD79b no conjugado).
Los tampones de formulación de anticuerpos respectivos para ADC
anti-CD22 y ADC anti-CD79b se usaron como vehículo (control) en todos
los estudios de NHP.
Bienestar animal y declaración ética
Monos Cynomolgus (macaca fascicularis)fueron utilizados en estos estudios.
Los animales fueron tratados de acuerdo con las regulaciones descritas en la
Ley de Bienestar Animal del USDA y las condiciones especificadas en la Guía
para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Instituto de Investigación
de Animales de Laboratorio, 1996). Los estudios en animales se informan de
conformidad con las directrices ARRIVE (Kilkennyet al.,2010; McGrath y Lilley,
2015). Todos los animales fueron criados con un propósito y sin experiencia
experimental al comienzo de los estudios. Antes de la asignación del estudio,
los animales fueron puestos en cuarentena, mantenidos y monitoreados para
una buena salud de acuerdo con el SOP del centro de pruebas y/o según lo
dispuesto por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades,
Atlanta, Georgia. Se establecieron controles ambientales en las salas de los
animales para mantener una temperatura de 18 a 29 °C (64 a 84 °F), una
humedad relativa de 30 a 70 %, cambios mínimos de aire fresco de 10 h-1y un
ciclo de luz/oscuridad de 12:12 h. Todos los animales se alojaron
individualmente en jaulas de acero inoxidable, pero se les permitió
630 Revista británica de farmacología (2017)174628–640
mezclarse para proporcionar enriquecimiento psicológico. Antes de la
dosificación, se permitió que los animales se aclimataran a su
alojamiento durante un mínimo de 1 a 2 semanas. Los alimentos, dietas
certificadas para primates, se proporcionaron diariamente junto con
suplementos de frutas o vegetales 2 o 3 veces por semana. Se
proporcionó aguaad libituma cada animal a través de bebederos
automáticos. Los estudios se realizaron siguiendo los procedimientos
operativos estándar aplicables a la Organización de Investigación Clínica
(Covance, Inc. o Charles River Laboratories International, Inc.). No se
programó sacrificar ningún animal al final de los estudios de ADC anti-
CD22 y ADC anti-CD79b. Para la histopatología, los animales de estudios
independientes separados se sacrificaron bajo anestesia profunda (e
irrecuperable) inducida con ketamina y Nembutal o el equivalente,
seguida de exanguinación. Todos los animales supervivientes se
devolvieron a la colonia de reserva de animales de la instalación de
pruebas al final de los estudios.
Estudios farmacocinéticos/farmacodinámicos de dosis
única
Estudio ADC anti-CD22.Doce monos cynomolgus macho de origen
mauriciano fueron obtenidos por Covance Laboratories Inc. (Madison, WI,
EE. UU.). Los animales tenían entre 3 y 5 años y pesaban entre 2,5 y 4 kg.
Se verificó la unión del anticuerpo anti-CD22 a todos los animales antes
del comienzo del estudio. Los animales se asignaron a tres grupos
(cuatro animales por grupo) mediante un esquema de aleatorización
estratificado diseñado para lograr pesos corporales medios de grupo
similares. Luego, los grupos se asignaron aleatoriamente a la
administración de vehículo (control), 3 mg kg-1
anticuerpo anti-CD22 no conjugado o 3 mg·kg-1ADC anti-CD22. Las
sustancias de prueba y de control se administraron mediante una
única inyección en bolo iv el día 1. Las muestras de sangre periférica
para citometría de flujo se recogieron antes de la dosis los días
- 14 y -7 y después de la dosis los días 2, 8, 15, 22, 29 y 44. Se
recogieron muestras de sangre para el análisis farmacocinético
antes de la dosis el día -1 y después de la dosis a las 0,083, 4 y 12 h y
los Días 2, 4, 8, 15, 22, 29, 36 y 44.
Estudio ADC anti-CD79b.Charles River Laboratories International, Inc
(Reno, NV, EE. UU.) obtuvo doce monos cynomolgus macho de
origen chino. Los animales tenían entre 2 y 4 años y pesaban entre 2
y 4 kg. Los animales se asignaron a tres grupos (cuatro animales por
grupo) mediante un esquema de aleatorización estratificado
diseñado para lograr pesos corporales medios de grupo similares.
Luego, los grupos se asignaron aleatoriamente a la administración
de vehículo (control), 3 mg·kg-1
anticuerpo anti-CD79b no conjugado, o 3 mg·kg-1ADC anti-CD79b. Las
sustancias de prueba y de control se administraron mediante una única
inyección en bolo iv el día 1. Las muestras de sangre periférica para
citometría de flujo se recogieron antes de la dosis los días
- 8 y -1 y después de la dosis los días 2, 8, 15, 22, 29 y 43. Se
recogieron muestras de sangre para el análisis farmacocinético
antes de la dosis el día -8 y después de la dosis a las 0,083, 4 y 12 h y
el Días 2, 4, 8, 15, 22, 29, 36 y 43.
Evaluación de la unión de anticuerpos anti-CD22 y
anti-CD79b a células B de mono cynomolgus
Unión del anticuerpo anti-CD22 al mono cynomolgus CD20+Las células B
se evaluaron mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos anti-
CD22 marcados con fluorescencia. Como control positivo, las muestras se
tiñeron conjuntamente con Hu8G10 marcado con fluorescencia.
 Farmacología de los ADC anti-CD22 y anti-CD79b
anticuerpo (Genentech, Inc.). Este anticuerpo se une al CD22
humano y de mono cynomolgus en presencia del anticuerpo
candidato clínico anti-CD22 (datos no mostrados).
Para evaluar la unión del anticuerpo anti-CD22 a las células B del
mono cynomolgus, se recolectó sangre periférica de animales de origen
chino, camboyano, mauriciano e indonesio y se trató con BD PharmLyse
(BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.) siguiendo el protocolo del
fabricante. A continuación, las muestras se lavaron en tampón de tinción
FACS enfriado con hielo (compuesto por PBS con FBS al 2 %) y se
bloquearon con suero humano inactivado por calor. A continuación, se
añadieron a las muestras concentraciones saturadas de anticuerpos
marcados con fluorescencia (anti-CD20 PE y anti-CD22 Alexa 647) y/o
controles de isotipo correspondientes (BD Biosciences) o Hu8G10 FITC
(Genentech, Inc.), seguido de incubación en hielo durante 25– 35 minutos
Antes de la adquisición, las muestras se lavaron dos veces con tampón de
tinción FACS y se resuspendieron en tampón fijador (PBS con
paraformaldehído al 1 %). Se adquirieron diez mil eventos controlados
por linfocitos utilizando una puerta de dispersión frontal (FSC)/dispersión
lateral (SSC) en el BD FACSCantoTM II (BD Biosciences). Los datos se
analizaron con el software BD CellQuestTM Pro, versión 5.2 (BD
Biosciences). Los linfocitos se identificaron a partir de un diagrama de
dispersión FSC/SSC. Unión de CD20+Las células B por Hu8G10 o el
anticuerpo anti-CD22 se identificaron utilizando gráficos de citograma de
anti-CD20 PE frente a Hu8G10 FITC o anti-CD20 PE frente a anti-CD22
Alexa 647, respectivamente. Se utilizó un procedimiento similar para
evaluar la unión del anticuerpo anti-CD79b a las células B de sangre
periférica de mono cynomolgus. El anticuerpo anti-CD79b y el control de
isotipo de IgG humana (Genentech, Inc.) se marcaron con el kit de
etiquetado de IgG humana Zenon Alexa Fluor 647 (Invitrogen) de acuerdo
con el protocolo del fabricante.
Análisis de células B, T y NK de sangre periférica
Las muestras de sangre periférica de monos cynomolgus se tiñeron
con concentraciones saturadas de mAb conjugados con
fluorescencia con CD3, CD8, CD20 y CD45 humanos (todos
reaccionan de forma cruzada con leucocitos de monos cynomolgus),
y con controles de isotipo apropiados. Las muestras se incubaron en
hielo, se lavaron dos veces con tampón de tinción FACS y se
volvieron a suspender en tampón fijador antes de la adquisición. La
adquisición de citometría de flujo se realizó en el BD FACSCantoTM II
el día de la tinción. Los datos se analizaron con el software BD
FACSDivaTM, versión 6.1.1 (BD Biosciences). Se generaron
citogramas de flujo para establecer la fracción de células que
expresan cada marcador de superficie celular (expresado como
porcentaje de linfocitos activados por FSC/SSC). Las células B se
definieron como CD3-CD20+células, células T como CD3+(células T
citotóxicas como CD3+CD8+células T auxiliares como CD3+CD8-
células), y las células NK como CD3-CD20-células. Para cada muestra
en cada punto de tiempo para cada subconjunto de linfocitos, el
recuento absoluto de células se calculó en función del % de datos
sincronizados generados por citometría de flujo multiplicado por el
recuento total de linfocitos. No se realizó un análisis estadístico
debido al bajo número de animales asignados a cada grupo de
dosis. Todos los anticuerpos (anti-CD3, anti-CD8, anti-CD20 y anti-
CD45) se adquirieron de BD Biosciences.
Análisis de la expresión de Ki-67
El anticuerpo Ki-67 se une a la proteína pKi-67, que se expresa
exclusivamente en células en proliferación (Schlüteret al., 1993).
Las muestras de sangre periférica se tiñeron con saturación
BJP
concentraciones de un mAb conjugado con fluorescencia a CD20.
Luego, las células se lavaron, fijaron y permeabilizaron con Dako
IntraStain (Dako, Carpinteria, CA, EE. UU.) y se tiñeron con un
anticuerpo contra el Ki-67 intracelular (BD Biosciences). La
adquisición de citometría de flujo se realizó en un FACSCaliburTM
(BD Biosciences) el día de la tinción. Los datos se analizaron con el
software FlowJoTM, versión 8.8.7 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, EE.
UU.). Los linfocitos fueron controlados por FSC/SSC y los
subconjuntos de CD20+y CD20-se evaluó la expresión de Ki-67 en los
linfocitos, con positividad basada en la comparación con el control
de isotipo. Recuentos absolutos de Ki-67+y Ki-67-Las células B se
determinaron multiplicando el porcentaje de cada subconjunto por
el recuento absoluto de células B para cada animal en cada punto de
tiempo. No se realizó un análisis estadístico debido al bajo número
de animales asignados a cada grupo de dosis.
Estudios de histopatología
En un estudio separado de ADC anti-CD22, se obtuvieron monos
cynomolgus de origen mauriciano de Covance, Inc y se
aleatorizaron por peso en grupos. A cinco machos y cinco
hembras por grupo se les administró una sola inyección iv de
vehículo (control) o 6 mg·kg-1ADC anti-CD22 el día 1. Las
necropsias se realizaron el día 8; todos los tejidos (incluido el
bazo) se recogieron para la evaluación histopatológica de rutina.
En un estudio separado de ADC anti-CD79b, se obtuvieron
monos cynomolgus de origen chino de Charles River
Laboratories International, Inc y se aleatorizaron por peso en
grupos. A cinco machos y cinco hembras por grupo se les
administraron inyecciones iv de vehículo (control) o 5 mg·kg-1
ADC anti-CD79b una vez cada 3 semanas para un total de cuatro
dosis. Las necropsias se realizaron 1 semana después de la última
dosis el día 71; todos los tejidos (incluido el bazo) se recogieron para
la evaluación histopatológica de rutina.
Las secciones de bazo se fijaron en formalina tamponada neutra al
10%, se procesaron de forma rutinaria y se incluyeron en parafina. Las
secciones se cortaron a 4-5 μM y se tiñeron con hematoxilina y eosina
(H&E) para la evaluación histopatológica de rutina. Se evaluaron
específicamente los centros germinales (GC) dentro de los folículos
linfoides esplénicos. Los GC se identifican en secciones teñidas con H&E
por sus características de tinción basófila más pálidas en comparación
con el resto del folículo linfoide.
Bioanálisis de ADC séricos anti-
CD22 y anti-CD79b
anti-CD22 ELISA.Concentraciones de no conjugado
El anticuerpo después de una administración iv única de anticuerpo
anti-CD22 no conjugado y el anticuerpo total (anticuerpos
totalmente conjugados, parcialmente desconjugados y totalmente
desconjugados) después de una administración iv única de ADC anti-
CD22 se determinaron en suero mediante ELISA como se describió
anteriormente (Kauret al.,2013; liet al.,2013). El ensayo mide solo
anticuerpos con al menos una región determinante de la
complementariedad intacta y una región de unión al antígeno del
fragmento. Brevemente, los estándares anti-CD22 y las muestras
diluidas en diluyente de muestra se incubaron durante 2 h con
anticuerpo IgG antihumano de oveja biotinilado (Genentech, Inc.) y
anticuerpo IgG antihumano de cabra conjugado con peroxidasa de
rábano picante en tubos micrónicos (National Scientific, Claremont,
CA, EE. UU.) o placas de fondo redondo de polipropileno (Corning
Costar, Corning, NY, EE. UU.) para formar un
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complejo puente. Posteriormente, estos complejos se transfirieron a
placas recubiertas con NeutrAvidin (Thermo Fisher Scientific Inc.,
Waltham, MA, EE. UU.) y se incubaron durante 1 h. Después del
lavado, el paso de detección se realizó utilizando sustrato de
tetrametilbencidina (TMB) (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.,
Gaithersburg, MD, EE. UU.). La absorbancia se midió a 450 nm frente
a una longitud de onda de referencia de 620 nm. La concentración
mínima cuantificable fue de 63 ng·mL-1.
Anti-CD79b ELISA.Concentraciones de no conjugado
anticuerpo después de una sola administración iv de
El anticuerpo an-CD79b no conjugado y el anticuerpo total (anticuerpos
totalmente conjugados, parcialmente desconjugados y totalmente
desconjugados) después de una única administración iv de ADC anti-
CD79b se determinaron en suero mediante ELISA (Kauret al., 2013). El
ensayo detecta anticuerpos que tienen al menos una región
determinante de complementariedad intacta y una región de unión a
antígeno fragmentada. Se recubrieron placas de microtitulación (96
pocillos) (Nunc, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU.) con
un péptido de 21 mer del dominio extracelular del mono cynomolgus
CD79b (Genentech, Inc.) en tampón de recubrimiento (PBS) . Después de
una incubación durante la noche a 4 °C, las placas se lavaron y trataron
con tampón de bloque (PBS, BSA al 0,5 %, polisorbato 20 al 0,05 %,
ProClin 300 al 0,05 %) durante 1 a 2 h. A continuación, se añadieron
muestras de suero a las placas y se incubaron a temperatura ambiente
(TA) durante 2 h. Luego, las placas se lavaron e incubaron durante 1 h con
anticuerpo IgG antihumano de oveja biotinilado (Genentech, Inc.)
seguido de estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante
(GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA, EE. UU.). Después del
lavado, el paso de detección se realizó usando sustrato TMB. La
absorbancia se midió a 450 nm frente a una longitud de onda de
referencia de 620 nm. La concentración mínima cuantificable fue de 60
ng·mL-1.
Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos
(ADCC)
Se evaluó la capacidad de los anticuerpos anti-CD22 y anti-huCD79b para
inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).in vitro.
Se usaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de
donantes humanos sanos como células efectoras, y se usó una línea
celular de linfoma de Burkitt humano (BJAB; Genentech Inc.) como células
diana. Se contaron las células y se determinó la viabilidad mediante Vi-
Cell™(Beckman Coulter, Brea, CA, EE. UU.).
Brevemente, las PBMC se aislaron mediante centrifugación en
gradiente de densidad utilizando tubos de separación de sangre Uni-Sep
(Accurate Chemical & Scientific, Westbury, NY, EE. UU.). Las células diana
en medio de ensayo (medio RPMI 1640 con FBS al 10 %) se sembraron en
una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Se añadieron diluciones en
serie de anticuerpos de prueba y de control a las placas que contenían las
células diana, seguido de incubación a 37 °C con 5 % de CO2durante 30
min para permitir la opsonización. Después de la incubación, se
añadieron células efectoras PBMC en medio de ensayo a cada pocillo en
una proporción de células efectoras:diana de 25:1, y las placas se
incubaron durante 4 h. Luego, las placas se centrifugaron y la actividad
de LDH en los sobrenadantes se determinó utilizando el kit de detección
de citotoxicidad (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN, EE. UU.). La mezcla
de reacción de LDH se añadió a los sobrenadantes y las placas se
incubaron a TA durante 15 min con agitación. La reacción se terminó con
1 MH3correos4y la absorbancia se midió a 490 nm frente a una longitud
de onda de referencia de
632 Revista británica de farmacología (2017)174628–640
650 nm. La absorbancia de los pocillos que contenían solo las células
diana sirvió como control de fondo (control bajo), mientras que los
pocillos que contenían células diana lisadas con Triton-X100
proporcionaron la señal máxima alcanzable (control alto).
La actividad de ADCC se presenta como la relación entre la señal de
la muestra y la señal máxima alcanzable (% ADCC). La citotoxicidad
celular independiente de anticuerpos (AICC) se midió en pocillos que
contenían células diana y efectoras sin la adición de anticuerpos. La
extensión de ADCC específica se calculó de la siguiente manera:
A490nmdMuestraÞA490nmdAICCÞ
%ADCC¼100-
A490nmdalto controlÞA490nmdbajo controlÞ
Los valores de ADCC de las diluciones de muestra se trazaron frente a la
concentración de anticuerpos y las curvas de dosis-respuesta se ajustaron con un
modelo de cuatro parámetros.
Citotoxicidad celular dependiente del complemento
(CDC)
Se evaluó la capacidad de los anticuerpos anti-CD22 y anti-huCD79b
para inducir citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) in
vitro.La línea celular BJAB de linfoma humano se usó como células
diana. El complemento se derivó de suero humano normal (Quidel
Corporation, Santa Clara, CA, EE. UU.) o de conejo (Calbiochem,
Billerica, MA, EE. UU.). La actividad de CDC se determinó en un
ensayo de viabilidad celular, en el que una reducción de la señal
indica el grado de citotoxicidad de los anticuerpos anti-CD22, anti-
huCD79b y rituximab (el control positivo).
Se contaron las células y se determinó la viabilidad mediante Vi-Cell.
Los anticuerpos de prueba y de control se diluyeron en serie en el medio
de ensayo y se dividieron en alícuotas en una placa de cultivo de tejidos
blanca de fondo plano de 96 pocillos (Corning Costar, Corning, NY, EE.
UU.). Después de la adición del complemento sérico y las células diana, la
placa se incubó a 37°C con 5% de CO2durante 2 h seguido de 10–15 min
de incubación a temperatura ambiente. Luego se agregó el reactivo
CellTiter-Glo (Promega, Madison, WI, EE. UU.) y la placa se incubó a TA
durante 10 min con agitación. La extensión de la lisis celular se cuantificó
midiendo la intensidad de la luminiscencia. Los valores de luminiscencia
de las diluciones de muestra se trazaron frente a la concentración de
anticuerpos y las curvas de dosis-respuesta se ajustaron con un modelo
de cuatro parámetros.
análisis estadístico
No se realizaron análisis estadísticos debido al tamaño de muestra
limitado por grupo de estudio (norte =4 animales por grupo) en
estudios ADC anti-CD22 y anti-CD79b.
Análisis farmacocinético
Se usaron perfiles de concentración sérica-tiempo para estimar la
concentración sérica máxima observada (Cmax), la exposición total al
fármaco definida como AUC extrapolada al infinito (AUCinf), el volumen
de distribución en el estado estacionario (Vss) y el aclaramiento (dosis/
AUCinf). Un análisis no compartimental (Modelo 201, WinNonlin®
Profesional, Versión 5.2.1; Corporación Farsight; Mountain View, CA, EE.
UU.) para describir los datos de concentración sérica observados para el
anticuerpo anti-CD79b; Se utilizó un modelo de dos compartimentos con
entrada de bolo iv, eliminación de primer orden y constantes de
macrovelocidad (Modelo 8, WinNonlin Pro, Versión 5.2.1; Pharsight
Corporation) para describir los datos de concentración sérica observados
para el anticuerpo anti-CD22. La selección del modelo se basó en la
bondad de ajuste por
 Farmacología de los ADC anti-CD22 y anti-CD79b BJP

inspección y por la comparación entre modelos del criterio de
información de Akaike. Los parámetros farmacocinéticos se analizaron
para cada animal por separado y los resultados para cada grupo de dosis
se resumen como SD media.
Resultados
Unión de anticuerpos anti-CD22 y anti-
CD79b a células B de mono cynomolgus
La unión de los anticuerpos anti-CD22 y anti-CD79b a las células B de
mono cynomolgus se determinó con citometría de flujo. Anti-CD22
unido a células B de sangre periférica en todos los animales de
Indonesia (norte =120) y de origen mauriciano (norte =10) (Figura 1).
Por el contrario, el anti-CD22 se unió a las células B de sangre
periférica en el 30% de los animales de origen chino (3 de 10
probados) y camboyano (3 de 10 probados); en el resto de estos
animales, la unión fue variable de baja a nula (Figura 1). Hu8G10, un
anticuerpo humanizado que se une a CD22 en un epítopo distinto
del candidato clínico anti-
Anticuerpo CD22, unido a las células B de todos los animales analizados.
Dada la unión constante del anticuerpo anti-CD22 a las células B en
animales de origen mauriciano, estos animales se utilizaron en estudios
que evaluaron la farmacocinética y la toxicología del ADC anti-CD22.
Antes del inicio de los estudios, se confirmó la unión del anticuerpo anti-
CD22 a las células B en todos los animales incluidos. No se observó una
unión selectiva similar del anticuerpo anti-CD79b a las células B de
animales de diferentes orígenes, lo que permitió el uso de monos de
origen chino para estudios relacionados con CD79b.
Agotamiento de CD20 circulante+Células B
después de la administración de ADC anti-CD22
o anti-CD79b en estudios de ADC
para examinar elen vivoefectos farmacodinámicos de los ADC anti-
CD22 y anti-CD79b en monos cynomolgus mauricianos y chinos,
respectivamente, se evaluaron los niveles de los subconjuntos de
linfocitos de sangre periférica a lo largo del tiempo. A los animales
se les administró ADC anti-CD22, ADC anti-CD79b, los respectivos
anticuerpos no conjugados o vehículo.

Figura 1
Unión de anticuerpos anti-CD22 a CD20+Células B de monos cynomolgus de origen chino, camboyano, mauriciano e indonesio. Gráficos de dispersión de citometría de
flujo representativos de anticuerpo anti-CD22 (panel superior), control de isotipo (panel central) o Hu8G10 (panel inferior) en CD20 sincronizado+Se presentan las
células B en la sangre periférica de monos cynomolgus de diferentes orígenes.

Revista británica de farmacología (2017)174628–640 633

 FK Fuh et al.
BJP

Se observó agotamiento de las células B circulantes en animales a los animales a los que se les administró ADC anti-CD22, un agotamiento
que se administró ADC o el anticuerpo no conjugado respectivo (Figura preferencial de CD20+Ki-67+Se observaron linfocitos B el día 15
2). Se observó una recuperación más temprana a la línea de base de los (mediana del 0,3 % del valor inicial para CD20+Ki-67+frente al 45,0 %
niveles de células B circulantes en animales a los que se les administró del valor inicial para CD20+Ki-67-); este agotamiento preferencial no
anticuerpos no conjugados (Día 22 para anticuerpos anti-CD22 y Día 30 se observó el día 22 (Figura 3C). Por el contrario, no se observó
para anticuerpos anti-CD79b) en comparación con animales a los que se agotamiento preferencial en animales a los que se administró
les administró ADC (Día 45 para anticuerpos anti-CD22 y ADC anti-CD79b) anticuerpo no conjugado o vehículo en ninguno de los días. Además,
(Figura 2). Hubo un agotamiento limitado o aparente de CD20 en sangre el agotamiento de CD20-Ki-67+no se observaron linfocitos no B
periférica+Células B en animales a los que se administró vehículo. (incluidas las células T, NK y NK T) en animales a los que se
Depleción de CD3 en sangre periférica+, CD3+CD4+o CD3+CD4-No se administró vehículo, anticuerpo anti-CD22 no conjugado o ADC anti-
observaron células T en ningún animal al que se le administró ningún CD22 (datos no mostrados). Este hallazgo demostró la especificidad
artículo de prueba o vehículo de control. del ADC anti-CD22 para la proliferación de células B.
Evaluaciones similares de CD20 circulante+Ki-67+Las células B se
realizaron en animales chinos a los que se administró vehículo,
Agotamiento de CD20+Ki-67+Células B después de la anticuerpo anti-CD79b no conjugado o ADC anti-CD79b (Figura 3D).
administración de ADC anti-CD22 o anti-CD79b en De manera similar a los animales a los que se les administró ADC
estudios de ADC anti-CD22, una depleción preferencial de CD20+Ki-67+Se observaron
Para evaluar la capacidad de los ADC anti-CD22 y anti-CD79b para células B el día 15 después de la administración de ADC anti-CD79b
reducir la proliferación de células B de mono cynomolgus, los niveles (mediana del 1,1 % del valor inicial para CD20+Ki-67+
de Ki-67 en sangre periférica+Se determinaron las células B. A los frente al 23,6 % del valor inicial para CD20+Ki-67-). No se observó
animales se les administró ADC anti-CD22, ADC anti-CD79b, los agotamiento preferencial el día 22. Por el contrario, no se observó
respectivos anticuerpos no conjugados o vehículo. agotamiento preferencial en animales a los que se les administró el
En monos cynomolgus, aunque el porcentaje de CD20+Ki-67+ anticuerpo anti-CD79b no conjugado o el vehículo en cualquier día.
Las células B en animales de origen indonesio fueron Además, el agotamiento preferencial de CD20-Ki-67+
ligeramente más altas que las de los animales de origen chino o no se observaron linfocitos no B en animales a los que se
mauriciano, el rango general de valores entre los orígenes del administró vehículo, anticuerpo anti-CD79b o ADC anti-CD79b
mono cynomolgus fue similar (Figura 3A y B). en mauriciano (datos no mostrados).

anti-CD22 Anti-CD79b
Vehículo Vehículo

A Ab anti-CD22 no conjugado (3 mg.kg-1)

Anti-CD22 ADC (3 mg.kg-1)
B Ab anti-CD79b no conjugado (3 mg.kg-1)
Anti-CD79b ADC (3 mg.kg-1)
200
Recuentos absolutos (% de BL)

200
Recuentos absolutos (% de BL)

160 160
Células B CD20+

CD20+Células B

120 120

80 80

40 40

0 0
- 10 0 10 20 30 40 50 - 10 0 10 20 30 40 50
Día Día

C Vehículo D Vehículo
Ab anti-CD22 no conjugado (3 mg.kg-1) Ab anti-CD79b no conjugado (3 mg.kg-1)
Recuentos absolutos (% de BL)

200 Anti-CD22 ADC (3 mg.kg-1) 200 Anti-CD79b ADC (3 mg.kg-1)

Recuentos absolutos (% de BL)

160 160
Células T CD3+

CD3+Células T

120 120

80 80

40 40

0 0
- 10 0 10 20 30 40 50 - 10 0 10 20 30 40 50
Día Día
= dosis

Figura 2
Agotamiento de CD20+Células B después de la administración de ADC anti-CD22 o anti-CD79b. Sangre periférica CD20+Células B (paneles A y B) o CD3+Células T (paneles C y D) en
animales a los que se les administró ADC anti-CD22 (paneles A y C) o anti-CD79b (paneles B y D) (norte =4); respectivos anticuerpos no conjugados (Ab) (norte =4) o vehículo (norte =4)
a lo largo del tiempo se presentan. Los datos presentados son recuentos absolutos medios de grupo expresados como porcentaje del valor inicial (% de BL) en cada punto de
tiempo. La línea de base se calculó como el valor promedio obtenido en dos puntos de tiempo previos a la dosis (mostrado). Las barras de error representan SEM. La flecha indica la
administración de las sustancias de prueba.

634 Revista británica de farmacología (2017)174628–640

 Farmacología de los ADC anti-CD22 y anti-CD79b BJP

figura 3
Porcentaje basal de Ki-67 en sangre periférica+Células B en monos cynomolgus de origen indonesio, chino y mauriciano. Porcentaje de sangre periférica CD20+Ki-67+
Células B expresadas como porcentaje del total de CD20+Se presentan las células B en monos cynomolgus. (A) Citograma representativo de CD20+Ki-67+Células B
bloqueadas por control de isotipo respectivo. (B) Diagrama de caja con la distribución animal individual dentro de cada origen animal. Las líneas superior, media e
inferior de cada cuadro representan el cuartil 75, la mediana y el cuartil 25 respectivamente. Porcentaje medio (DE), mediana y rango de CD20 en sangre periférica+
Ki-67+Se muestran las células B tabuladas por origen animal. (C) Dosis única iv de vehículo (panel izquierdo), 3 mg·kg-1ADC anti-CD22 (panel central), o 3 mg·kg-1Se
administraron anticuerpos anti-CD22 no conjugados (Ab) (panel derecho) a monos cynomolgus. Números absolutos de Ki-67+y Ki-67-Los linfocitos B se representan
como un porcentaje del valor medio previo a la dosis para cada animal (símbolos) el día 15 (panel superior) y el día 22 (panel inferior). Los recuadros muestran la
distribución de animales individuales dentro de cada grupo, donde las líneas superior, media e inferior representan el cuartil 75, la mediana y el cuartil 25
respectivamente. (D) Dosis única iv de vehículo (panel izquierdo), 3 mg·kg-1ADC anti-CD79b (panel central), o 3 mg·kg-1Se administraron anticuerpos anti-CD79b no
conjugados (Ab) (panel derecho) a monos cynomolgus. Números absolutos de Ki-67+y Ki-67-Los linfocitos B se representan como un porcentaje del valor medio previo a
la dosis para cada animal (símbolos) el día 15 (panel superior) y el día 22 (panel inferior). Los recuadros muestran la distribución de animales individuales dentro de
cada grupo, donde las líneas superior, media e inferior representan el cuartil 75, la mediana y el cuartil 25 respectivamente.

La evaluación histológica del bazo confirma el agotamiento de la proliferación de CD20+Ki-67+células B en circulación, se observó

agotamiento de los linfocitos GC en los estudios de una pérdida de GC dentro de los folículos linfoides esplénicos en todos los animales a

histopatología los que se administró ADC anti-CD22 (Figura 4A) o ADC anti-CD79b (Figura 4B). No se

Para determinar los efectos de los ADC anti-CD22 y anti-CD79b sobre observó una pérdida similar de GC dentro de los folículos linfoides esplénicos en

la proliferación de linfocitos en los tejidos, se realizó una evaluación animales a los que se les administró el vehículo de control. No se observó una
histológica del bazo de animales a los que se administró ADC anti- pérdida similar de GC dentro de los folículos linfoides esplénicos en animales a los
CD22, ADC anti-CD79b o vehículo. De acuerdo con lo observado que se les administró el vehículo de control.

Revista británica de farmacología (2017)174628–640 635

 FK Fuh et al.
BJP
Farmacocinética de ADC anti-CD22 y
anti-CD79b en estudios de ADC
Para determinar el grado de exposición de los ADC y los anticuerpos
no conjugados, se midieron las concentraciones de anticuerpos en
suero en animales después de la administración iv de ADC anti-CD22
o anti-CD79b y sus respectivos anticuerpos no conjugados. Se
presentan las concentraciones séricas medias a lo largo del tiempo.
en la figura 5.
Las concentraciones séricas del anticuerpo no conjugado después
una única administración iv de anticuerpo anti-CD22 no conjugado o
anticuerpo total (anticuerpos totalmente conjugados, parcialmente
desconjugados y totalmente desconjugados) después de una única
administración iv de ADC anti-CD22 estaban en niveles máximos
inmediatamente después de la dosificación (Figura 5). Posteriormente, las
concentraciones disminuyeron con el tiempo de manera biexponencial
como se esperaba para un anticuerpo monoclonal terapéutico. Ninguno
de los animales a los que se administró vehículo tenía concentraciones
séricas medibles de anticuerpo anti-CD22 (datos no mostrados). La
exposición sistémica (AUCinf) del anticuerpo anti-CD22 no conjugado fue
aproximadamente dos veces mayor que la del anticuerpo total después
de la administración de ADC, y la Vss del anticuerpo no conjugado fue
aproximadamente dos veces menor que la del anticuerpo total después
de la administración de ADC (Tabla 1) . Estos datos sugieren un efecto
modesto de la conjugación de MMAE sobre la eliminación de anticuerpos;
al mismo nivel de dosis, el anticuerpo total después de la administración
iv de ADC se eliminó aproximadamente dos veces más rápido que el
anticuerpo no conjugado. La liquidación
Figura 4
Agotamiento de los centros germinales en tejidos linfoides de monos cynomolgus a los que se les administró ADC anti-CD22 o ADC anti-CD79b. (A) Sección de bazo
teñida con H&E representativa de animales a los que se administraron dosis únicas iv de vehículo (panel superior) o 6 mg·kg-1Se presenta el ADC anti-CD22 (panel
inferior) el día 8. (B) Sección de bazo teñida con H&E representativa de animales a los que se administraron cuatro dosis iv de vehículo (panel superior) o 5 mg·kg-1Se
presenta ADC anti-CD79b (panel inferior) el día 71 (7 días después de la cuarta dosis).
636 Revista británica de farmacología (2017)174628–640
(CL) del anticuerpo anti-CD22 no conjugado (Tabla 1) en el
estudio actual es típico y comparable con otros anticuerpos
monoclonales IgG1 en monos (Bumbaca Yadavet al., 2015).
Tanto los anticuerpos no conjugados como los totales
permanecieron detectables durante toda la duración del estudio
(hasta el día 44) (Figura 5A).
Al igual que con el anticuerpo anti-CD22, los perfiles farmacocinéticos
del anticuerpo no conjugado luego de una administración iv única de
anticuerpo anti-CD79b no conjugado y del anticuerpo total luego de una
administración iv única de ADC anti-CD79b fueron biexponenciales, como
se esperaba para un anticuerpo monoclonal terapéutico. (Figura 5B). La
exposición del anticuerpo anti-CD79b no conjugado también fue
ligeramente mayor que la del anticuerpo total después de la
administración de ADC. La Vss del anticuerpo anti-CD79b no conjugado
fue comparable con la del anticuerpo total; la Vss de los anticuerpos no
conjugados y totales se aproximó al volumen de plasma de un mono
(Davies y Morris, 1993), lo que sugiere que la mayoría de los anticuerpos
no conjugados y los anticuerpos totales se retuvieron en el
compartimiento central o de plasma después de una dosis única de 3
mg·kg-1ADC anti-CD79b o anti-CD79b no conjugado. El AUCinf para el
anticuerpo anti-CD79b no conjugado fue comparable con el del
anticuerpo total (Tabla 1). A diferencia del anticuerpo anti-CD22 (Figura
5A), los niveles de anticuerpos anti-CD79b no conjugados y anticuerpos
anti-CD79b totales estaban por debajo del nivel de detección después del
día 14 (Figura 5B). Esto sugiere que una mayor contribución de un
componente CL específico (mediado por células B)
 Farmacología de los ADC anti-CD22 y anti-CD79b BJP

Figura 5
La exposición sistémica del anticuerpo anti-CD22 es ligeramente superior a la del anticuerpo anti-CD79b. Concentraciones séricas medias (SD) de grupo de anticuerpos
después de una única administración iv de 3 mg·kg-1anticuerpo anti-CD22 no conjugado (Ab) o anti-CD22 ADC (A) o 3 mg·kg-1se presentan anticuerpos anti-CD79b no
conjugados o ADC anti-CD79b (B). La línea continua roja representa la concentración sérica del anticuerpo total (tanto conjugado como no conjugado) en animales a los
que se administró ADC. La línea discontinua negra representa la concentración sérica de anticuerpo no conjugado en animales a los que se administró el anticuerpo no
conjugado respectivo.

tabla 1
Valores medios de grupo (SD) de parámetros farmacocinéticos para anticuerpos no conjugados o totales (Ab) después de una única administración iv de
anticuerpo anti-CD22 no conjugado, anticuerpo anti-CD79b no conjugado o los respectivos ADC a 3 mg·kg-1a los monos cynomolgus

anti-CD22 Anti-CD79b

Parámetros PK Ab no conjugado AB totales Ab no conjugado AB totales

Cmáximo(μg·mL-1) 95,8 3,00 80,6 7,39 82,5 4,93 98,3 13,4

ABCinf(μg·día-1·mL-1) 606 43,9 325 48.7 289 54.6 217 36.1
Vss(ml·kg-1) 51,8 1,59 80,0 14,9 45,7 3,36 43,1 3,02
CL(mL·día-1·kg-1) 4,97 0,352 9,39 1,46 10,6 1,86 14,2 2,60

a la CL total del anticuerpo anti-CD79b que la del anticuerpo anti-
CD22, y una caída significativa de la concentración en la fase
terminal probablemente se deba a la eliminación mediada por el
objetivo (Mager, 2006). Por lo tanto, la exposición sistémica del
anticuerpo anti-CD22 es mayor en comparación con el anticuerpo
anti-CD79b. La Cmax del anticuerpo total después de la
administración iv de ADC anti-CD22 y anti-CD79b y sus respectivos
anticuerpos no conjugados fue similar, lo que confirmó que todos
los animales recibieron la misma dosis y que la distribución inicial
del fármaco fue comparable (Tabla 1).
Actividad ADCC y CDC de anticuerpos
anti-CD22 y anti-huCD79b
Para determinar el papel de las funciones efectoras en el MOA de los
anticuerpos anti-CD22 y anti-huCD79b, se midieron el ADCC y el CDCin
vitro.La ADCC es una función efectora en la que los anticuerpos
específicos de antígeno dirigen las células efectoras del sistema
inmunitario innato para destruir las células diana que expresan el
antígeno. La CDC es un mecanismo de destrucción celular en el que se
produce la lisis celular dependiente del complemento debido a la unión
del anticuerpo al antígeno en la superficie celular y la posterior activación
de la vía del complemento.
Las curvas de dosis-respuesta de los experimentos ADCC
representativos se presentan en la Figura 6. Si bien el rituximab
(control positivo) demostró ADCC robusto en células BJAB, no
hubo ADCC aparente con anticuerpo anti-CD22, y solo ADCC
moderado con anticuerpo anti-huCD79b. Los anticuerpos anti-
CD22 y anti-huCD79b no tenían CDC detectables en células BJAB
con complemento humano o de conejo (datos no mostrados).
Discusión
El desarrollo de mAbs humanizados y totalmente humanos como agentes
terapéuticos para el tratamiento del cáncer ha mejorado enormemente
los resultados clínicos. Estas nuevas terapias proporcionan un enfoque
más dirigido y específico que la eliminación inespecífica de células en
proliferación a través de agentes quimioterapéuticos. El agotamiento de
las células malignas circulantes por anticuerpos dirigidos puede incluir
múltiples procesos fisiológicos en la sangre, incluida la opsonización
mediada por anticuerpos, ADCC y/o CDC. Sin embargo, es posible que los
anticuerpos que son efectivos en la circulación no siempre demuestren
una potencia similar en los tejidos, donde estos mecanismos pueden ser
menos efectivos de lo que son.

Revista británica de farmacología (2017)174628–640 637

 FK Fuh et al.
BJP
Figura 6
Actividad ADCC de anticuerpos anti-CD22 y anti-huCD79b. El anticuerpo anti-CD22, el anticuerpo anti-huCD79b y el rituximab (control positivo) fueron evaluados por su
capacidad para inducir ADCC en BJAB humano. Cada figura representa los resultados de tres experimentos independientes realizados con cada anticuerpo usando
células mononucleares de sangre periférica de diferentes donantes. El % de ADCC se representó frente a la concentración de anticuerpos y los datos se ajustaron con
un modelo de cuatro parámetros.
en sangre (Townsendet al.,2010). Por ejemplo, el rituximab puede agotar
las células B circulantes a niveles casi indetectables en los días
posteriores a la administración. Por el contrario, las células B en los
tejidos se agotan de manera menos eficiente y pueden requerir más
tiempo para el agotamiento máximo (Maloneyet al.,1997; Thurlingset al.,
2008).
La conjugación de agentes citotóxicos con mAb puede
aumentar aún más la eficacia tanto de los mAb como de los
agentes citotóxicos. El componente mAb de un ADC administra
un agente citotóxico al tejido maligno dirigiéndose
específicamente a las células malignas. Como consecuencia, la
concentración del agente citotóxico en las células malignas
aumenta y conduce a un aumento de la potencia. Esto supera
tanto la falta de especificidad de los agentes citotóxicos como la
potencia limitada de los anticuerpos terapéuticos solos.
Además, este enfoque dirigido reduce potencialmente los
efectos sistémicos no específicos de los agentes citotóxicos al
disminuir su acceso a los tejidos normales. Aprovechamos este
concepto al conjugar un potente agente citotóxico con
anticuerpos dirigidos contra CD22 y CD79b en las células B. Al
unirse a CD22 o CD79b,
Demostramos que los ADC anti-CD22 y anti-CD79b atacan y
eliminan específicamente las células B en la sangre y el tejido
del mono cynomolgus a niveles de dosis que fueron bien
tolerados. El agotamiento inicial de las células B en la sangre fue
comparable entre los ADC y los respectivos anticuerpos no
conjugados y probablemente estuvo mediado por la
opsonización del anticuerpo.
El mayor agotamiento de las células B por el anticuerpo anti-CD79b no
conjugado (~75 % de reducción en comparación con el valor inicial) en
comparación con el anticuerpo anti-CD22 no conjugado (~50 % de reducción en
comparación con el valor inicial) probablemente esté relacionado con múltiples
factores que aún no se conocen por completo. Aunque la exposición sistémica
general de anti-CD79b no conjugado es aproximadamente dos veces menor
que la de anti-CD22 no conjugado, las concentraciones máximas iniciales (C
máximo) de los dos anticuerpos no conjugados fueron similares; por lo tanto, es
menos probable que la diferencia
638 Revista británica de farmacología (2017)174628–640
del agotamiento inicial de B se debe a la diferencia de exposición de
los dos anticuerpos no conjugados. El mayorin vitroLa ADCC
observada con el primero y/o la señalización a través de CD79b
pueden ser factores contribuyentes (Figura 6).
No se espera que los ADC anti-CD22 y anti-CD79b afecten a las
células madre hematopoyéticas en proliferación, ya que estas células no
expresan CD22 o CD79b. Esto está respaldado por la rápida recuperación
de las células B en circulación después de la eliminación de los ADC, lo
que sugiere que el grupo de células madre permaneció imperturbable.
Además, de acuerdo con la especificidad de los anticuerpos, los niveles
de células T y NK proliferantes y no proliferantes no se vieron afectados.
Los ADC anti-CD22 y anti-CD79b mediaron una mayor duración
del agotamiento de las células B en la sangre en comparación con
los anticuerpos no conjugados. Este efecto se logró a pesar de la
exposición general más baja en suero sistémico de los ADC,
caracterizada por concentraciones séricas totales de anticuerpos,
que sus respectivos anticuerpos no conjugados, lo que sugiere que
la diferencia en los efectos farmacodinámicos entre el ADC y los
anticuerpos no conjugados estuvo mediada por un MOA diferencial,
en lugar de solo la exposición. El agotamiento prolongado de las
células B se caracterizó por el agotamiento preferencial de la
proliferación de Ki-67+células B. El agotamiento preferencial de la
proliferación de Ki-67+en comparación con Ki-67 no proliferante-No
se observaron células B el día 22, momento en el que la mayoría de
los ADC se habían eliminado.
Antes del inicio de los estudios farmacodinámicos,
farmacocinético/
la unión
de los anticuerpos anti-CD22 y anti-CD79b a las células B del
mono cynomolgus se confirmó mediante citometría de flujo.
Anticuerpo anti-CD22 unido selectivamente a células B de
animales de Indonesia o Mauricio. Por el contrario, la unión a
células B de animales chinos o camboyanos fue limitada. El
análisis de secuencia preliminar del gen CD22 en animales
chinos e indonesios no indicó diferencias de magnitud suficiente
para explicar estas diferencias. Por lo tanto, la selectividad de
unión observada del anticuerpo anti-CD22 puede deberse a una
modificación postraduccional
 Farmacología de los ADC anti-CD22 y anti-CD79b
de CD22 en la superficie de las células B. Esta unión específica de origen
del anticuerpo anti-CD22 parecía ser específica de los monos
cynomolgus, ya que la unión del anticuerpo anti-CD22 a las células B de
sangre periférica de donantes humanos sanos no reveló tal especificidad.
Anticuerpo anti-CD22 unido a CD20+Células B de los 157 donantes (datos
no mostrados). No se observó una unión específica de origen similar con
anti-CD79b, que se unía a las células B de animales de todos los orígenes
a niveles comparables.
El agotamiento específico de las células B en proliferación
respalda el valor terapéutico potencial de estos ADC, ya que los
datos publicados apuntan a la importancia del agente citotóxico
conjugado para una eficacia óptima. El epratuzumab, un
anticuerpo anti-CD22 no conjugado, requiere altos niveles de
dosis para ser eficaz (Leonardet al.,2004). Rituximab, un
anticuerpo anti-CD20 no internalizado, requiere un ADCC
robusto para ser eficaz. Por el contrario, los ADC anti-CD22 y
anti-CD79b aprovechan la internalización y posterior liberación
del agente citotóxico para mejorar la eficacia. Como indican los
estudios en modelos de xenoinjertos, los mecanismos
independientes de los fármacos no son suficientes para mediar
la eficacia en sí mismos (Liet al.,2013).
La progresión exitosa de las terapias desde los estudios clínicos
de fase III hasta la aprobación de comercialización ha disminuido a
solo ~50 % en los últimos años (Arrowsmith, 2011; Arrowsmith y
Miller, 2013). Esta tasa de deserción se ha atribuido en gran medida
a la falta de eficacia y destaca la necesidad de comprender la MOA y
la actividad farmacológica en las primeras etapas de desarrollo
(Cooket al.,2014). Los ADC anti-CD22 y anti-CD79b fueron efectivos
en modelos de xenoinjerto de ratón (Dornanet al., 2009; Polsonet al.,
2010). Se dirigen específicamente a las células B en proliferación
tanto en la sangre como en el tejido en monos cynomolgus a un
nivel de dosis que fue bien tolerado. Estos hallazgos aumentan
nuestra confianza en la eficacia potencial de los ADC anti-CD22 y
anti-CD79b en humanos.
La farmacología y el MOA de los ADC anti-CD22 y antihuCD79b
los convierten en tratamientos prometedores para el tratamiento
del LNH. Los ADC anti-CD22 y anti-huCD79b se dirigen a Ki-67+
Células B en tejidos linfoides y en circulación. Por lo tanto, estos ADC
podrían dirigirse de manera efectiva a las células B malignas en
proliferación en el LNH y ofrecer un perfil de riesgo-beneficio más
favorable que los agentes quimioterapéuticos tradicionales. De
hecho, los resultados de los estudios clínicos de Fase I con anti-
CD22-MMAE (identificador de ClinicalTrial.gov, NCT01209130) y
antihuCD79b-MMAE (identificador de ClinicalTrial.gov,
NCT01290549) en pacientes con LNH en recaída/refractario
mostraron perfiles de seguridad aceptables, PK y anti -actividad
tumoral (Palanca-Wessels et al.,2015; Advaníet al.,2016).
Agradecimientos
Los autores agradecen el apoyo financiero de Genentech,
miembro del Grupo Roche, para estos estudios. Nos gustaría
agradecer a Dale Stevens y Amy Oldendrop por proporcionar
soporte de monitor de estudio para los estudios de ADC anti-
CD22 y anti-CD79b. También nos gustaría agradecer a Kathy
Howell, Olivia Hwang y Clarissa David y Sock-Cheng Lewin-Koh
por su ayuda con el análisis de citometría de flujo. Finalmente,
nos gustaría agradecer a Seattle Genetics por su tecnología en
la conjugación de auristatina.
BJP
Contribuciones de autor
Todos los autores enumerados contribuyeron al diseño, investigación,
redacción y aprobación final del trabajo. Cada uno de ellos acepta ser
responsable de todos los aspectos del trabajo.
Conflicto de intereses
Todos los autores son empleados actuales o pasados de Genentech,
Inc., un miembro del Grupo Roche.
Declaración de transparencia y
rigor científico
EsteDeclaraciónreconoce que este documento se adhiere a los principios
de informes transparentes y rigor científico de la investigación preclínica
recomendados por las agencias de financiación, los editores y otras
organizaciones comprometidas con la investigación de apoyo.
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