Practicas-micro.

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Fundamentos de Microbiología

1º Grado en Bioquímica

Facultad de Ciencias
Universidad de Málaga

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
 FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGÍA - PRÁCTICAS

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
Técnicas de esterilización y medios de cultivo
Esterilización
Esterilización: proceso de destrucción de todas las formas de vida. En sentido microbiológico, un objeto
está esteril cuando está libre de microorganismos. Se consigue por la exposición del material a tratar a
agentes letales físicos o químicos.

Muerte de un microorganismo: pérdida irreversible de la capacidad de reproducirse.

Métodos de esterilización
Agentes físicos
- Calor
Seco:
- Flameado
- Incineración

Reservados todos los derechos.

- Horno de esterilización: horno Pasteur (materiales estables al calor como vidrio, metal,
porcelana)
Húmedo:
- Vapor de agua saturado a presión: autoclave
- Tindalización
- Radiaciones
No ionizante
- Luz UV (240-280 nm)
- Lámparas germicidas (253,7 nm)
Ionizante
- Rayos gamma
- Rayos X

Agentes químicos

- Óxido de metileno: gases

- Glutaraldehído activado: solucione acuosas
- b-propiolactona: solución acuosa
- Formaldehído: solución acuosa o vapor

- Ác. inorgánicos (ácido ósmico)

- Ác. orgánico (ácido pícrico)
- Soluciones orgánicas (etanol 96º. alcohol-éter, metanol, formaldehído…)
- Sales metálicas

Filtración
Filtros de profundidad: láminas de fibras dispuestas al azar creando una especie de malla.
Filtros de membrana: compuesto de polímeros dispuestos de forma que dejan poros muy pequeños.

- Membranas filtrantes: líquidos termosensibles y termolábiles

- Sistemas de filtración por vacío
- Sistema de filtración por presión positiva, cartucho de filtración
- Filtros HEPA: filtros de alta eficiencia de retención de partículas de aire

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Forma de esterilización Material

Horno Pasteur Botella de vidrio vacía

Pipetas pasteur

Flameado Asa de Digralsky

Asa de siembra

Filtración por membrana Líquido termosensible

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Autoclave Agar nutritivo en botella de vidrio

Medios de cultivo
Todo sustrato óptimo para el crecimiento y/o mantenimiento de microorganismos en el laboratorio.

Un medio de cultivo es selectivo cuando tiene un agente selectivo (favorece el crecimiento de algunas
bacterias).
Un medio de cultivo es diferencial, crecen todas las bacterias pero muestran características diferentes.
Se consigue mediante el uso de sustratos de prueba (va acompañado de un indicador pH).

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Agente selectivo Sustrato prueba Indicador pH Indicador redox

•Sales biliares (inh G+) •Sacarosa ( -pH si •Azul timol •Azul de metileno
•Colorantes como azul ferm) •Purpura bromocresol •Cloruro de trifenil
violeta, verde brillante •Tiosulfato + citrato •Azul bromotimol tetrazolio
•Azida sódica Cinh férrico(precipita • Rojo fenol
citC) negro) •Rojo neutro
•Lactosa (pH básico)
•Cloruro de trifenil
tetrazolio
•Glucosa (pH ácido)

•Peptonas: quimiotrofo
•Triptosa: quimioheterótrofo
•Casaminoácidos: medio enriquecido

•NaCl: para la ósmosis (5g aprox)→ bacteria halófila: sobrevive con altas concentraciones de sal

•Se trata de un medio artificial si no lleva extracto o pepitonas

Medio diferencial/no, selectivo/no, definido/indefinido, artificial/natural/mixto,

sólido/semisólido/líquido

Características:
● Contener en su composición todos los elementos necesarios para cubrir los requerimiento
nutricionales de los microorganismos para los que el medio fue diseñado
● Poseer un pH, condiciones osmóticas y Eh dentro del margen de tolerancia del microorganismos
en cuestión
● Etséril y preservado de toda contaminación
● Recientemente preparado

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Componentes
● Agua
● Peptonas: hidrólisis química (ácida o alcalina) e hidrólisis enzimática. Nutrientes para la bacteria
● Infusiones y extractos
● Azúcares
- Fuentes de carbono y energía
- Sustrato de prueba

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● Sales minerales
- Para el mantenimiento de la presión osmótica NaCl 0.5%
- Tampones: fosfatos y carbonatos
● Indicadores de pH

● Indicadores de óxido-reducción: azul de metileno, cloruro de trifenil tetrazolio

● Agentes selectivos: colorantes, azida sódica, sales biliares, detergentes, NaCl, pH, antimicrobianos
● Suplementos

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● Agentes solidificantes
● Agentes reductores
● Agentes quelantes

Clasificación de los medios de cultivo

Según su composición química
- Definidos o sintéticos: conocemos sus componentes exactos
- Indefinidos o complejos: hay mezcla en alguno de sus componentes

Según el origen de sus componentes

- Artificiales
- Naturales
- Mixtos

Según su estado físico

- Líquido o caldo: agar < 5g
- Semisólido: agar 5-10g
- Sólido: agar > 10g

Según su uso o aplicación

- Comunes
- Especiales
- Medios enriquecidos
- Medios selectivos
- Medios diferenciales
- Medios de prueba
- Medio de recuento
- Medio de caracterización bacteriana
- Medio de mantenimiento

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Aislamiento, cultivo y cuantificación de microorganismos

Obtención de cultivos puros (cultivos axénicos)
Aislamiento: separación de un microorganismos determinado de los otros microorganismos que pueden
coexistir con el mismo en una determinada muestra.
Cultivo: crecimiento de las poblaciones microbianas en ambientes artificiales (medios de cultivo) en el
laboratorio.

Cultivo de microorganismos

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Requerimientos nutricionales y condiciones físico-químicas

● Utilizar recipientes y medios de cultivo estériles y protegidos de contaminación

● Trabajar en ambiente aséptico
● Utilizar instrumentos de siembra estériles

Aislamiento en medios sólidos

Colonia: población de microorganismos visible macroscópicamente desarrollada en medio sólido

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Técnicas de aislamiento en medio sólido
Siembra por estrías en placa
En medio con verde brillante y sales biliares: aislamiento de bacterias gramnegativas
- Dilución por arrastre
Diseminación en placa
Permite el aislamiento y cuantificación de bacterias viables
- Diluciones decimales seriadas
Vertido en placa
Con un precalentamiento: aislamiento y cuantificación de bacterias esporuladas

Aislamiento de microorganismos específicos

Aislamiento directo
Empleando medios de cultivo sólidos selectivos y/o diferenciales

Enriquecimiento
Empleo de caldos selectivos

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Pretratamiento
Utilización de agentes físico microbicidas

Cuantificación de microorganismos: recuento de viables

Recuento directo en placa

Observación de microorganismos
Colorantes
Colorante: sustancia química orgánica de naturaleza variable capaz de teñir sustancias (generalmente de

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tipo orgánico) con las que se ponen en contacto.

Grupos en la molécula de colorante

Cromóforo: aporta el color
Auxcromo: comunica el color

Clasificación de los colorantes

- Según el grado de ionización
- Ácidos: poder del colorante radica en un anión (-)
- Básicos: poder del colorante radica en un catión (+)
- Neutros: sales de colorante ácido y básico
- Según el origen y constitución química del cromatóforo
- Naturales: azul de metileno, safranina, cristal violeta
- Artificiales: amoxicilina, carmín, orceína

Mordientes
Mordiente: sustancia química sin poder colorante que actúa como “intermediario” o “puente” de unión
entre el colorante y determinadas estructuras de la célula posibilitando así su coloración. También pueden
actuar alterando el constituyente celular de forma que ésta pueda teñirse. Refuerzan la acción del
colorante.

Tinción microbiológica
1. Extensión
2. Desecación
3. FIjación
4. Tinción

Clasificación de las tinciones

Según el número de colorantes
- Simple: solo un colorante
- Combinada: más de un colorante
Atendiendo al uso de mordientes
- Directa: ausencia de mordiente
- Indirecta: uso de mordiente

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Diferencial de célula: permite distinguir tipos de célula

Diferencial de estructura: permite distinguir estructurales celulares
Negativa: tinción del medio de suspensión
Metacromática: estructura a visualizar se tiñe de color distinto al colorante
Impregnación: precipitación de sales metálicas
Vital: tinción de células vivas

Tinción de Gram: método de Hucker

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Se trata de una tinción doble, indirecta y diferencial.

Clasificación de endosporas
Según su morfología
- Esféricas

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- Ovales
En función de su tamaño
- Deformantes (clostridiales)
- No deformantes
(plectridiales)
En función de su posición
- Centrales
- Subterminales
- Terminales

Tinción de endosporas: método de Schaeffer-Fulton

Tinción doble, directa y diferencial de estructuras

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Estudio de características metabólicas confines de identificación

Taxonomía bacteriana
Clasificación: organización de los organismos en grupos taxonómicos en base a sus similaridades y
relaciones
Nomenclatura: asignación de nombres a los grupos taxonómicos formados
Identificación: proceso de inclusión de un nuevo aislado bacteriano en ui de los grupos taxonómicos
previamente establecidos

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Identificación bacteriana
- Características morfológicas
- Características culturales
- Características fisiológicas
- Características metabólicas
Medios de caracterización (medios de pruebas bioquímicas)

Pruebas bioquímicas
Sistemas indicadores de actividades metabólicas
- Variaciones de pH (indicadores de pH)
- Aparición de productos específicos (reactivos externos o en el medio)

Reservados todos los derechos.

- Desaparición del sustrato presente en el medio
- Adicionar sustratos para enzimas específicas

Prueba de citocromo-oxidasa
Objetivo: determinar la presencia de la enzima citocromo-oxidasa. Cataliza la reducción del citocromo c
reducido por el oxígeno.

violeta
Reactivo: tetrametil-p-fenilendiamina

Prueba de la catalasa
EN PLACA PETRI
Objetivo: determinar la presencia de la catalasa.
Cataliza la descomposición del agua oxigenada.
En bacterias anaerobias facultativas y aerobias. NO en Streptococcus.

Prueba positiva si efervece sobre la bacteria.

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Prueba de óxido-fermentación (O/F)

DOS TUBOS UNO CON PARAFINA Y OTRO NO

Objetivo: determinar el metabolismo oxidativo o fermentativo de la
glucosa.

básico, neutro, ácido

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Resultado positivo si se presentan amarillos. Negativos si son verdes
o azules.

Destapado / Tapado
Amarillo +/ amarillo +: metabolismo fermentataivo
Azu-ver - / azu-ver - : no degrada el azúcar
Azu-ver - / amarillo +: metabolismo fermentativo
Amarillo +/ azu-ver - : metabolismo oxidativo

Prueba de Kligler
TUBO DE ENSAYO CON AGAR INCLINADO

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Lengüeta: oxida
Columna: fermenta
Glucosa Lactosa Sulfídrico Oxígeno

Se fermenta Se fermenta Positivo: se observa Positivo:

Lengüeta un color negro. observación de
No se fermenta No se fermenta burbujas en el
Precipitado de medio de cultivo
Se fermenta Se fermenta sulfuro de hierro
Columna
No se fermenta No se fermenta

Prueba de la lisina descarboxilasa (LDC)

ÚNICO TUBO CON PARAFINA

Objetivo: capacidad de descarboxilar la

lisina

Morado → Amarillo: acida el medio

+ : morado, hace uso de la lisina,
regresa al pH neutro
- : amarillo, no sa pectonas y el pH
no cambia

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Prueba de la producción de indol

TUBO LARGO SIN PARAFINA

+ : rosa, uso de indol
- : amarillo

Prueba de la reducción del nitrato

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FASE I:
+ : hay nitrito en el medio (NO2-)
- : no hay nitrito
FASE II: añadir polvo de zinc a la de resultado negativo
+ (reducción asimilatoria): no hay gas en la campana
+ (reducción desasimilatoria): hay gas en la campana de Durham (N2)
- : hay nitrato, el tubo no contiene la nitrasa

Prueba de la hidrólisis del Tween-80 (lipasa)

Objetivo: detectar la presencia de la enzima lipasa. Degrada el

Tween-80 liberando ácido oleico.

+: metaboliza el lípido→ oleato cálcico → halo de precipitado

fluorescente

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Prueba de la hidrólisis del almidón (amilasa)

Objetivo: presencia de la enzima extracelular α-amilasa

+ : halo no coloreado alrededor del crecimiento bacteriano,

resto teñido de color azul oscuro → ausencia de almidón que
ha sido hidrolizado

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*Se añaden gotas de lugol

Prueba de la hidrólisis de la caseína (caseinolisis)

Objetivo: determinar la capacidad de una bacteria de hidrolizar la caseína

de la leche

+ :halo transparente alrededor del crecimiento bacteriano → la caseína se

ha hidrolizado

Reservados todos los derechos.

*Tiene un pigmento fluorescente

Antibiograma
Agente microbiano: producto químico que tiene un efecto microbicida o microbiostático sobre
un grupo más o menos amplio de microorganismos.

Evaluación de la actividad antimicrobiana

Determinación del espectro de acción
Determinación del patrón de resistencia
Ralización de un antibiograma

Técnica de difusión con discos

Carga: cantidad de antimicrobiano en el disco

Medio de cultivo: agar Mueller Hinton
Preparación del inóculo bacteriano: turbidez ajustada con solución salina esteril mediante la
escala de McFarland

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Mecanismo de acción
1. Inóculo bacteriano
2. Siembra en las placas con un hisopo de algodón (inoculación uniforme)
3. Colocación de discos: a unos 1.5 cm del borde y entre ellos espacio
4. Lectura de los resultados: medida del diámetro de las zonas de inhibición completa del
crecimiento bacteriano al milímetro más cercano
5. Interpretación de los resultados: comparación del diámetro con las tablas

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interpretativas para dar un resultado dentro de las tres categorías (resistente, sensible,
resistencia intermedia)

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La cepa bacteriana Nombre de la bacteria presenta categoría a antibiótico. Es categoría a
antibiótico. Además tiene categoría a antibiótico.

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