Universidad Técnica de Ambato

Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos y Biotecnología

Carrera de Biotecnología
Laboratorio de Biotecnología Biomédica

I. TEMA DE LA UNIDAD:
Aplicaciones de la bioingeniería en medicina

II. ACTIVIDAD
Aislamiento de células madre embrionarias de pollo para el desarrollo de un cultivo celular
primario y posterior obtención de un tejido aviar específico.

III. Introducción:

Las células madre embrionarias (ES) se aislaron a principios de 1980 de ratón (mESC) y a
finales de 1990 de primates y humanos. Estas células presentan la propiedad única de
autorrenovación y la capacidad de generar descendencia diferenciada de todos los linajes
embrionarios tanto in vitro como in vivo.

En el caso de especies aviares como el pollo, también se pude aislar células madre
embrionarias (cESC) y cultivarlas a largo plazo a partir de células blastodérmicas tempranas.
Las células cESC se pueden mantener en condiciones de cultivo específicas y se caracterizan
en función de su morfología, características bioquímicas, potencial de diferenciación in
vitro y propiedades morfogenéticas in vivo.

Las células madre embrionarias pueden dar origen a cualquier tejido del organismo en
cuestión, siempre y cuando estas cuenten con todas las condiciones adecuadas para su
crecimiento y diferenciación.

IV. Objetivos:
- Aislar de células madre embrionarias de pollo para el desarrollo de un cultivo celular
primario y posterior obtención de un tejido aviar específico.

V. Equipos, materiales y recursos

- 4 Huevos por grupo: huevos fértiles recién puestos y recolectados. Los huevos se pueden
almacenar a 16 °C durante 2 a 5 días antes de procesarlos. Los huevos de las cepas de carne
de pollo proporcionan una derivación más eficiente de las células cES en comparación con
las cepas de puesta de huevos.

- Platos Petri desechables de 100 mm (4 por grupo)

- Anillos de papel filtro estériles
- Pinzas de disección (idealmente curvas)
- Asa o palillo
- Tubos Eppendorf de 1.5 ml estériles
- Micropipetas de 1ml, 200 µl y 10 µl estériles
- Puntas de micropipeta de 1ml, 200 µl y 10 µl estériles
- Hielo
- Microscopio
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- Hemocitómetro
- Azul de tripano
- Centrífuga

VI. Actividades por desarrollar

Actividad práctica:

Recolección de blastodermos
- Desinfectar los huevos con una solución de hipoclorito de sodio al 0.5% y luego limpiar
con etanol al 70% .
- Rompa la cáscara cuidadosamente y separe la clara y la yema con cuidado mientras el
embrión se encuentra en la superficie de la yema.

- Distribuya las cuatro yemas en dos platos Petri desechables de 100 mm, con el embrión
colocado directamente hacia arriba.
- Use para cada yema un pequeño anillo perforado de papel filtro estéril para eliminar el
exceso de clara en la superficie del embrión.
- Luego coloque un nuevo anillo de papel en la superficie de la yema con las pinzas de
disección, en el pequeño orificio que rodea el embrión.

- Después de 1 a 3 minutos (dependiendo de la sequedad de la atmósfera del laboratorio)

para permitir que el papel se adhiera a la superficie, realice 3 a 4 pequeñas incisiones
alrededor del anillo.

- Tome rápidamente el anillo de papel que lleva el embrión en su centro con las pequeñas
pinzas de disección curvas.
- Sumérjalo con cuidado en PBS frío teniendo cuidado de introducir el anillo verticalmente
a la superficie del líquido para evitar que el embrión se desprenda.
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- Coloque todos los anillos con el lado de la yema hacia arriba en el PBS

Preparación de células blastodérmicas

- Transfiera los anillos con los embriones a un plato nuevo con PBS fresco y frío.
- Retire suavemente el exceso de yema con el asa o palillo, teniendo cuidado de mantener
el embrión en el anillo de papel. Una vez limpio, el embrión se coloca en otro plato nuevo
que contiene PBS.

- Separe el embrión con una punta de pipeta de 1 ml del anillo de papel y colóquelo en 0,25
ml de PBS en un tubo Eppendorf (idealmente sería medio completo ESA PM).

- Disociar las células mecánicamente mediante varios pipeteos suaves hacia arriba y hacia
abajo.
- Mantener los tubos a 4 grados centígrados.

Análisis de las características de las células

- Tomar una o dos gotas del tubo que contiene el PBS y células y observar bajo el
microscopio.
- Verificar que el PBS solo contiene células

Análisis de la viabilidad celular

- Prepara una solución 1:1 de PBS + células con azul de tripano y mezclar suavemente hasta
observar una coloración homogénea.
- Colocar 10 µl de la solución anterior en el hemocitómetro y proceder a determinar el
número de células obtenidas (de acuerdo a la consulta que realizó en actividades previas)
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- Calcular el número de células viables
- En caso de que exista un elevado número de células que dificulte su conteo, proceder a
diluir la muestra y contar nuevamente.
- En caso de que el número de células en el hemocitómetro sea muy bajo, proceder a
concentrar la solución con ayuda de una centrífuga
- Realizar el conteo cada 30 minutos hasta la finalización de la hora de clase
- Realizar el último conteo 24 horas después o cuanto tenga acceso al laboratorio

Actividad teórica:

- ¿Cuáles son los componentes de medio completo ESA PM para el cultivo de células madre
embrionarias de pollo?
- ¿Por qué razón es importante la capa alimentadora (alimentador STO inactivado/
inactivated STO feeder) para el cultivo de células madre embrionarias y de qué están
constituidas?
- ¿Cuáles es la temperatura y porcentaje de CO2 que se requieren para el cultivo de células
madre embrionarias de pollo? Justificar las razones.
- Busque una imagen de cómo se observarían las de células madre embrionarias de pollo
una vez que estas hayan sido cultivadas adecuadamente y que se hayan adherido al medio.
- Decida a que tejido quisiera diferenciar las células madre embrionarias de pollo aisladas
en esta práctica. Investigue el medio de cultivo, factores y condiciones necesarias para su
obtención.
- Finalmente realice un esquema gráfico de todo el proceso: desde el aislamiento de células
hasta la obtención del tejido diferenciado (combine la práctica y lo teórico)

VII. Resultados
Reportar los resultados de la actividad práctica y teórica