DESARROLLO DE LA PRÁCTICA : 3.

Efecto de la
concentración de enzima sobre la actividad invertasa

Nombre de la asignatura: Biocatálisis

Nombre de la Unidad de UNIDAD II Cinética enzimática
Aprendizaje:

Nombre de la práctica o
Efecto de la concentración de enzima sobre la actividad invertasa
proyecto:
Duración (horas) :
Número: 3/6 3 horas
3
Resultado de * Describir el efecto de la concentración de la enzima invertasa durante un
aprendizaje: ensayo enzimático con concentraciones de sustrato conocidas.
Material Equipo
16 tubos de ensayo 100 x 10 mm Vortex
1 Micropipeta 5-100 µL y 100-1000 Espectrofotómetro
µL
1 Gradilla Centrifuga
6 Celdas para espectro Parrilla de calentamiento
1 probeta de 100 mL
1 Pinza para tubos de ensayo
10 tubos eppendorf
Puntas para micropipeta del
volumen específico
Requerimientos (Material 1 Termómetro Reactivos
o equipo): 1 Vaso de precipitados 250 mL y 1 Agua destilada
vaso de 500 mL
1 baño maría Sustrato (Solución de sacarosa 25
mM en buffer de acetatos 0.1 M pH
5.3)
Mechero con tripie y tela de asbesto Levadura de panificación
Pipeta volumétrica 1 mL y propipeta Reactivo A (Anexo 1)
1 Espátula y vidrio de reloj Reactivo B (Anexo 1)
Reactivo C (Anexo 1)
Reactivo de DNS (Anexo 2)

Actividades a desarrollar en la práctica:

Para determinar la actividad enzimática de invertasa el extracto enzimático se obtendrá de la levadura
Saccharomyces cerevisiae.
Pesar 1 g de levadura seca y añadir a 10 mL de agua destilada a 37ºC.
Homogenizar y colocar en tubos ependorf.
Centrifugar a 5000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante será considerado como el extracto crudo
enzimático (EE), y será utilizado para la cuantificación de la actividad.

Tomar 500 L del extracto enzimático (EE) y colocarlo en un tubo ependorf y agregar 500 L de agua, de
esta dilución tomar 500 L del EE y colocarlo en un tubo ependorf y agregar 500 L de agua, continuar
diluyendo hasta obtener una serie de 6 diluciones. (Nota el agua que se agrega deberá estar a 37 ºC).
5.- Las series con y sin diluciones se utilizaran como muestra para realizar el ensayo enzimático por
duplicado, de acuerdo a lo siguiente:
 Serie 1 (BLANCO) Tubo 1 Tubo 2

Sustrato 475 L 475 L

ECE sin dilución 25 L 25 L

DNS 1000 L 1000 L

La serie uno será el tubo blanco por lo que se debe de agregar inmediatamente DNS.

La serie 2 será el EE sin dilución

Serie 2 (EE sin Tubo 1 Tubo 2
dilución)
Sustrato 475 L 475 L

ECE 25 L 25 L

Serie 3 (EE 1:1) Tubo 1 Tubo 2

Sustrato 475 L 475 L

ECE 25 L 25 L

Continuar con las series 4, 5, 6, 7 y 8 como se indica en las tablas anteriores. Incubar las series a 40 ºC
durante 15 minutos.
Posteriormente se retiran y se agrega 1 ml de DNS a cada serie.
Todos los tubos que contienen DNS se colocan en agua en ebullición por 5 minutos, se retiran y se dejan
enfriar para su lectura.
Leer en espectrofotómetro a 540 nm calibrando con el tubo de la serie 1.
Utilizando la ecuación de la recta de la curva tipo de glucosa de la práctica 1, determinar los mg/mL de
glucosa liberados y con estos datos calcular la actividad enzimática considerando que una Unidad de
invertasa es definida como la cantidad de enzima necesaria para liberar un micromol de glucosa por minuto
bajo las condiciones de ensayo descritas.