Otros NDICE

tipos de separacin Cromatogrfica. Electroforesis. 1.CROMATOGRAFA DE FASE ENLAZADA 1

1.1 Aplicaciones al anlisis de alimentos 2. CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO 2.1 Aplicaciones de las resinas de intercambio inico a la cromatografa 2.2 Cromatografa inica basada en supresores 2.3 Aplicaciones al anlisis de alimentos 3. CROMATOGRAFA DE PAR INICO 3.1 Aplicaciones al anlisis de alimentos 4. CROMATOGRAFA DE FLUIDOS SUPERCRTICOS 4.1 Aplicaciones al anlisis de alimentos 5. CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN 5.1 Aplicaciones al anlisis de alimentos 6. FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS 6.1 Tipos de electroforesis 7. ELECTROFORESIS CAPILAR 7.1 Flujo electroosmtico 7.2 Instrumentacin 7.3 Inyeccin de la muestra 7.4 Modos de trabajo 14 7.5 Deteccin 8. TIPOS DE ELECTROFORESIS CAPILAR 8.1 Electroforesis capilar de zona (CZE) 8.2 Electroforesis capilar en gel (CGE) 8.3 Isotacoforesis capilar (CITP) 8.4 Isoelectroenfoque capilar (CIEF) 1 2 3 4 5 6 6 7 8 8 9 10 10 11 12 14 14 15 16 16 Roco Garca Prieto Ester Lana 16 Mateo 16 Lara Lpez Merino 1 1

NDICE
1.CROMATOGRAFA DE FASE ENLAZADA 1.1 Aplicaciones al anlisis de alimentos 2. CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO 2.1 Aplicaciones de las resinas de intercambio inico a la cromatografa 2.2 Cromatografa inica basada en supresores 2.3 Aplicaciones al anlisis de alimentos 3. CROMATOGRAFA DE PAR INICO 3.1 Aplicaciones al anlisis de alimentos 4. CROMATOGRAFA DE FLUIDOS SUPERCRTICOS 4.1 Aplicaciones al anlisis de alimentos 5. CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN 5.1 Aplicaciones al anlisis de alimentos 6. FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS 6.1 Tipos de electroforesis 7. ELECTROFORESIS CAPILAR 7.1 Flujo electroosmtico 7.2 Instrumentacin 7.3 Inyeccin de la muestra 7.4 Modos de trabajo 7.5 Deteccin 8. TIPOS DE ELECTROFORESIS CAPILAR 8.1 Electroforesis capilar de zona (CZE) 8.2 Electroforesis capilar en gel (CGE) 8.3 Isotacoforesis capilar (CITP) 8.4 Isoelectroenfoque capilar (CIEF) 8.5 Cromatografa capilar electrocintica micelar ((MEKC) 8.6 Aplicaciones al anlisis de alimentos 9. BIBLIOGRAFA 1 1 2 3 4 5 6 6 7 8 8 9 10 10 11 12 14 14 14 15 16 16 16 16 17 17 18 19

1. CROMATOGRAFA DE FASE ENLAZADA

La cromatografa de fase enlazada es un tipo de cromatografa de reparto, ha llegado a ser la ms utilizada de todos los procedimientos de cromatografa de lquidos. La cromatografa de reparto era al principio exclusivamente lquido-lquido; sin embargo, en la actualidad predominan los mtodos de fase enlazada, habiendo sido relegadas las separaciones lquido-lquido a ciertas aplicaciones especiales. La mayora de empaquetados de fase enlazada se preparan por reaccin de un organoclorosilano con los grupos OH formados en la superficie de las partculas de slice por hidrlisis por cido clorhdrico diluido caliente. El producto es un organosiloxano. La reaccin de un grupo SiOH situado en la superficie de una partcula se puede escribir como:

donde R es a menudo la cadena lineal del grupo octilo u octadecilo (C8 H17--o C18H37--). Otros grupos funcionales orgnicos que se pueden unir a la superficie de la slice son aminas alifticas, teres, nitrilos e hidrocarburos aromticos. As pues es posible disponer de una gama de fases estacionarias enlazadas de distinta polaridad. Los empaquetados de fase enlazada son significativamente ms estables que los de fase estacionaria retenida solo por fuerzas fsicas. En este ltimo caso hay que volver a recubrir peridicamente las superficies slidas, porque la fase estacionaria se va perdiendo gradualmente por disolucin en la fase mvil. Adems los empaquetados lquido-liquido no son adecuados para elucin por gradiente, debido, de nuevo, a inevitables prdidas de fase estacionaria por solubilizacin en la fase mvil. La desventaja principal de los empaquetados de fase enlazada es su capacidad de muestra algo limitada.

1.1 Aplicaciones al anlisis de alimentos

- Separar y determinar azcares libres en alimentacin. - Separar los steres de los lpidos en los alimentos. - Separar determinar y analizar aditivos. - Separar e identificar las vitaminas A y D en alimentos como aceite de hgado de - carne y pescado. - Separar e identificar las vitaminas A y D en productos lcteos. - Separar y determinar triglicridos. - Tiene muchas otras aplicaciones alimentarias en edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos...

2. CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

La cromatografa inica, cuya fase estacionaria es una resina de intercambio inico, es un procedimiento de separacin de iones de carga del mismo signo por elucin de una columna empaquetada con resina finamente dividida. Las resinas sintticas de intercambio inico son materiales polimricos de alto peso molecular que contienen muchos grupos funcionales inicos por molcula. Las resinas de intercambio catinico pueden ser de tipo cido fuerte, con grupos cido sulfnico (RSO3-H+), o de tipo cido dbil con grupos cido carboxlico (RCOOH); el primer tipo tiene mas aplicaciones. Las resinas de intercambio inico contienen grupos funcionales bsicos de amina unidos a la molcula polimrica. Los intercambiadores bsicos fuertes son aminas cuaternarias; los de tipo base dbil contienen aminas secundarias o terciarias. Una propiedad importante de todas las resinas de intercambio inico es que son prcticamente insolubles en medio acuoso. De este modo, cuando el intercambiador catinico se sumerje en una disolucin acuosa que contiene el catin M+, se establece rpidamente el siguiente equilibrio de intercambio entre slido y la fase en disolucin:

donde Mx+, es un catin y R representa la parte de la molcula de la resina que contiene un grupo cido sulfnico. El proceso anlogo en el que participa una resina tpica de intercambio aninico se puede escribir como:

donde Ax es un anin. Es una tcnica de alto poder resolutivo, ya que es capaz de separar molculas que presentan muy pocas diferencias de cargas.

2.1 Aplicaciones de las resinas de intercambio inico a la cromatografa

En cromatografa inica, los iones del analito se introducen en la cabeza de la columna empaquetada con una resina de intercambio inico adecuada. La elucin se lleva a cabo despus con una disolucin que contiene un in que compite con los iones de analito por los grupos cargados sobre la superficie de la resina. Por ejemplo se pueden separar aniones como cloruro, sulfato, fosfato y tiocianato utilizando una resina de intercambio aninico en su forma bsica. En esta aplicacin, la muestra se introduce en la cabeza de la columna, donde los aniones se retienen por la reaccin

La elucin se lleva a cabo luego con una disolucin diluida de una base, que invierte la reaccin anterior, liberando as a los aniones. Puesto que los cocientes de reparto de los aniones difieren entre si, durante la elucin tiene lugar su fraccionamiento. Uno de los aspectos atractivos de la cromatografa ionica es que la medida de la conductividad proporciona un mtodo general adecuado para determinar la concentracin de las especies eluidas. La cromatografa ionica con deteccin conductrimtrica de iones eluidos de la columna se describi por primera vez en 1975, y en la actualidad es una eficaz e importante tcnica de determinacin cuantitativa tanto de especies inorgnicas como de orgnicas cargadas. En la actualidad se usan dos tipos de cromatografa basadas en empaquetados de intercambio inico: cromatografa inica basada en supresor y de columna nica. Se diferencian por el mtodo usado para evitar que la conductividad del electrolito eluyente interfiera con la medida de la conductividad de los analitos.

2.2 Cromatografa inica basada en supresores

La columna supresora de eluyente esta empaquetada con una segunda resina de intercambio inico, que convierte de forma eficaz los iones del disolvente eluyente en una especie molecular poco ionizada, sin afectar la conductividad de los iones del analito. Actualmente se comercializan supresores de micromembrana que operan de forma continua. Por ejemplo, cuando se quiere eliminar carbonato o bicarbonato sdico, el eluyente pasa por encima de una serie de membranas ultrafinas de intercambio catinico, que lo separa de una corriente de disolucin regeneradora cida que fluye en direccin opuesta. Los iones sodio del eluyente se intercambian con los iones hidrgeno situados en la superficie interna de la membrana del intercambiador, y a continuacin migran a la otra superficie intercambindose con los iones hidrogeno del reactivo regenerador. Los iones hidrgeno de la disolucin regeneradora migran en direccin opuesta manteniendo as la neutralidad elctrica. La siguiente figura muestra dos aplicaciones de la cromatografa inica basada en una columna supresora y en deteccin conductimtrica. En los dos ejemplos, la concentracin de los iones es del orden de partes por milln; el tamao de muestra es 50uL en un caso y 20uL en el otro. El mtodo es particularmente importante para anlisis de aniones, porque no existe otro mtodo rpido y cmodo para analizar mezclas de este tipo.

1)F-(1,5 ppm) 2)-hidroxibutirato 3)Acetato 4)Glicolato 5)Butirato 6)Gluconato 7)-Hidroxivalerato 8)Formiato (5 ppm) 9)Valeriato

10)Piruvato 19)HPO2311)Monocloroacetato 20)SeO2312)BrO321)Br13)Cl- (3 ppm) 22)NO314)Galacturonato 23)SO2424)Oxalato 15)NO2- (5 ppm) 16)Glucuronato 25)SeO2417)Dicloroacetato 26)-Cetoglutarato 18)Trifloruroacetato 27)Fumarato

28)Ftalato 29)Oxalacetato 30)PO3431)AsO3432)CrO2433)Citrato 34)Isocitrato 35)cis-Aconitato 36)trans-aconitato

2.3 Aplicaciones al anlisis de alimentos

- Aislamiento de pectinas en algunas frutas y verduras. - Determinacin de la piridoxina en, cereales, leche y carnes. - Determinacin y separacin de cationes y/o aniones en el agua y - en otras bebidas, como la cerveza y el vino. - Recoleccin de trazas de elementos minerales, por ejemplo: Al, Si, Zn, Mn, Cu, B, Cr, F, I. - Anlisis de monosacridos, disacridos y polisacridos en leche y derivados, caf, - miel, zumos de fruta, vino, productos de repostera y hortalizas. - Separacin e identificacin de diferentes tipos de protenas.

3. CROMATOGRAFA DE PAR INICO

La cromatografa de par inico utiliza una columna de HPLC en fase inversa, en lugar de una columna de intercambio inico. Se utiliza para la separacin y determinacin de especies inicas.

Se compone de una fase mvil formada por un tampn que contiene un compuesto orgnico unido a un contrain. ste se aloja en la fase estacionaria (apolar), convirtindola eficazmente en un intercambiador inico. Cuando el analito pasa a travs de la columna, se puede unir a la fase estacionaria por atraccin electrosttica. El mecanismo de retencin es una mezcla de interacciones con fase inversa y de intercambio inico. La elucin de los pares inicos se consigue mediante una disolucin acuosa de metanol o de otro disolvente orgnico soluble en agua. La cromatografa de par inico es ms compleja que la cromatografa de fase inversa porque el equilibrio de la fase mvil con la fase estacionaria es lento; la separacin es ms sensible a variaciones de temperatura y de pH; adems la concentracin del compuesto orgnico de la fase mvil afecta a la separacin.

3.1 Aplicaciones al anlisis de alimentos

Determinar la sacarina por par inico-HPLC. Determinar el acesulfamo-K por par inico-HPLC. Separar e identificar compuestos inicos, cationes o aniones.

4. CROMATROGRAFA DE FLUIDOS SUPERCRTICOS

Un fluido supercrtico es una sustancia que est expuesta a temperaturas y presiones por encima de su temperatura1 y su presin2 crtica (Williams & Clifford, 2000). Estos fluidos supercrticos tienen interesantes propiedades: compresibilidad, homogeneidad y propiedades intermedias entre las que tiene en sus estados lquido y gaseoso. En relacin con las altas densidades de estos fluidos supercrticos, encontramos una interesante propiedad: la de disolver molculas grandes no voltiles. Adems los analitos disueltos pueden ser fcilmente recuperados al permitir que las disoluciones se equilibren con la atmsfera a temperaturas relativamente bajas. Esto es importante en el caso de analitos termolbiles. Tambin hay que tener en cuenta de que las difusividades de los solutos son un orden de magnitud mayor y las viscosidades un orden de magnitud menor que en lquidos. Sin olvidar que la mayora de los fluidos supercrticos son baratos, inocuos y no son txicos (Skoog et al., 2001). Estas propiedades, adems, se pueden controlar con la presin y la temperatura (Williams & Clifford, 2000). La cromatografa de fluidos supercrticos (SFC) es una tcnica hbrida entre la cromatografa de gases y la cromatografa de lquidos, combinando alguna de las mejores caractersticas de cada una de ellas. Es una tcnica importante de cromatografa en columna, con una gran aplicacin en laboratorios industriales, docentes y de control

La temperatura crtica de una sustancia es la temperatura por encima de la cual no puede existir en fase lquida independientemente de la presin (Skoog et al., 2001). 2 La presin de vapor de una sustancia a su temperatura crtica es su presin crtica (Skoog et al., 2001).

(Skoog et al., 2001). Se puede definir como la separacin de componentes orgnicos usando un fluido supercrtico como fase mvil (Williams & Clifford, 2000). Permite la separacin y determinacin de compuestos que no se manipulan bien con la cromatografa de gases ni con la cromatografa de lquidos. Las caractersticas que presentan estos compuestos son (Skoog et al., 2001): Compuestos no voltiles o trmicamente lbiles para los que la cromatografa de gases es inaplicable. Compuestos con grupos funcionales que no son detectables por las tcnicas espectroscpicas o electroqumicas empleadas en la cromatografa de lquidos.

Los equipos para este tipo de cromatografa son similares a los equipos de HPLC. Aunque en el caso de fluidos supercrticos es necesario un horno para mantener la columna a la temperatura deseada, e informando a su vez, de la temperatura de la fase mvil. Tambin es necesario un dispositivo de contrapresin, para mantener en la columna la presin deseada, convertir al fluido supercrtico en un gas y arrastrarlo al detector.

Las variaciones de presin tienen un efecto muy marcado sobre el factor de retencin; esto es consecuencia del incremento de densidad de la fase mvil paralelamente al incremento de presin. Al cambiar la densidad del fluido cambia el poder de solvatacin del disolvente de la fase mvil, al modificar la presin ejercida (Rousseac & Rousseac, 2003).

4.1 Aplicaciones al anlisis de alimentos

- Extraccin de cafena en caf instantneo (Dean et al., 2000), usando como fluido supercrtico para la extraccin el CO2.

- Extraccin de almidn de la crcuma y el jengibre (Braga et al., 2006), usando como fluido supercrtico para la extraccin el CO2.

5. CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN
La cromatografa de exclusin se basa en la diferencia de penetracin de las molculas de la muestra a travs de los poros de la fase estacionaria (Rousseac & Rousseac, 2003). Se aplica particularmente a especies de elevado peso molecular. Los rellenos para este tipo de cromatografa estn constituidos por pequeas partculas polimricas o de slice (ambas de una tamao en 5 y 10 m) que contienen una red de poros uniformes en los que pueden difundir las molculas de soluto y del disolvente. 8

Las molculas son atrapadas en los poros y eliminadas de la fase mvil. Las molculas que son ms grandes que el tamao medio de los poros son excluidas, no se retienen y son las primeras que eluyen. Las de menor tamao penetran, por lo que son atrapadas durante ms tiempo, siendo las ltimas en eluir. Las molculas de tamao intermedio, dependiendo de su tamao y forma, quedan retenidas ms o menos tiempo (Skoog et al., 2001).

Las partculas que rellenan la columna cromatogrfica son de dos tipos; partculas polimricas y partculas de slice (Skoog et al., 2001): Las partculas de slice confieren gran rigidez, facilitando el relleno y la utilizacin de presiones ms elevadas; adems da mayor estabilidad y permite usar, adems del agua, gran variedad de disolventes. Pero tienen gran tendencia a retener solutos por adsorcin y tendencia a catalizar la degradacin de las molculas del soluto. Las partculas polimricas, en principio, eran copolmeros de estirenodivinilbenceno entrecruzados. El tamao del poro se controla con el grado de entrecruzamiento de cadenas polimricas (la cantidad relativa de divinilbenceno). Pero estos geles son hidrofbicos y slo pueden usarse con fases mviles no acuosas. En la actualidad hay geles hidroflicos, pudiendo usar disolventes acuosos para la separacin de molculas grandes solubles en agua (como los azcares). Los mtodos de exclusin por tamao se dividen en cromatografa de filtracin sobre gel (la fase mvil es acuosa) y cromatografa de penetrabilidad sobre gel (la fase mvil es orgnica) (Rousseac & Rousseac, 2003).

5.1 Aplicaciones al anlisis de alimentos

- Esta tcnica se emplea en la separacin de protenas de alimentos, determinacin de glucosa y fructosa en zumos de fruta, etc.

- Determinacin de alrgenos en frutas (Zuidmeer et al., 2006).

6. FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS
La electroforesis es un mtodo de separacin de especies distintas basado en el diferente comportamiento de estas especies bajo la influencia de un campo elctrico aplicado. El potencial de corriente aplicado impulsa a los iones de la muestra a migrar hacia uno u otro de los electrodos: las molculas con una carga neta negativa se desplazarn hacia el nodo (electrodo positivo) y las molculas con una carga neta positiva migrarn hacia el ctodo (electrodo negativo). La velocidad de migracin de un in, v, en el seno de un campo elctrico, medida en cm s-1, es: v = e E siendo e la movilidad electrofortica del in, medida en cm2V-1s-1, y E la intensidad del campo elctrico medida en V cm-1. La movilidad electrofortica de un in es directamente proporcional a la fuerza elctrica del in e inversamente proporcional a los factores de retardo por rozamiento. La fuerza de retardo por rozamiento se determina en un in a partir de su tamao y de la viscosidad del medio en el que migra. Las separaciones por tanto se basan en las diferencias en la relacin carga-tamao entre los diferentes analitos presentes en la muestra; cuanto mayor sea esta relacin ms rpido migrar el in en el seno del campo elctrico. Para iones del mismo tamao, el de mayor carga elctrica migrar ms rpidamente. Para iones con la misma carga migrar ms aquel de menor tamao, ya que tendr una fuerza de retardo por rozamiento de menor valor. La resistencia del medio al paso del in tambin influir en su movilidad electrofortica, siendo sta menor cuanto mayor sea la viscosidad del medio. Para hacer una separacin efectiva es necesario mantener constantes las cargas de cada especie de iones, de manera que la relacin carga-tamao (y por tanto la velocidad de migracin) permanezcan en el intervalo ms estrecho posible. Asegurar que la carga se mantiene igual sobre cualquier cido o base quiere decir que las separaciones electroforticas requieren disoluciones tampn.

6.1 Tipos de electroforesis

Existen principalmente dos mtodos electroforticos ampliamente utilizados: la electroforesis convencional y la electroforesis capilar. La primera se lleva a cabo sobre papel o sobre un gel, en los que se aplica la muestra directamente. La disolucin tampn, que ser el medio conductivo, cubre la placa de papel o de gel. Seguidamente se aplica el potencial de corriente continua a travs de la placa. Cuando se considera que se han completado las separaciones se interrumpe el paso de la corriente y, si es necesario, las muestras se tien para visualizarlas.

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7. ELECTROFORESIS CAPILAR
La electroforesis convencional es actualmente una tcnica de gran utilidad, la metodologa clsica usada durante muchos aos para separar especies complejas, de elevado peso molecular, de inters biolgico y bioqumico. Sin embargo, este tipo de separacin electrofortica es lenta, laboriosa y difcil de automatizar, y adems no proporciona resultados cuantitativos precisos. Debido a estos inconvenientes, a partir de la dcada de los ochenta comenz a desarrollarse un tipo de electroforesis ms rpida y con mejores resultados: la electroforesis capilar (EC). Esta tcnica est basada en la reduccin drstica de la seccin transversal del aparato de electroforesis, es decir, la separacin se realiza en el interior de un tubo capilar con un dimetro menor de 0.1 mm. Por qu se reduce la seccin transversal? De esta manera, la temperatura del lquido que transcurre a travs del capilar no va a aumentar si se aplica un potencial de corriente elevado (entre 20.000 y 60.000 V); esto se traduce en una separacin ms rpida (ya que la velocidad de migracin del in aumenta proporcionalmente al potencial aplicado, como indica la ecuacin v = e V/L ) y con una mejor resolucin. Por tanto, se pueden mantener voltajes ms altos con un bajo calentamiento de Joule (el calentamiento de Joule es el calor producido por la corriente elctrica). Otra ventaja adicional de la electroforesis capilar es que las especies separadas pueden detectarse directamente al aplicar el mtodo. Se obtiene una grfica de la respuesta en funcin del tiempo, llamada electroferograma (figura 7.1), en la que cada pico representa una especie qumica separada.

Figura 7.1 Se ha comentado anteriormente la mejora de la resolucin en la electroforesis capilar. Por resolucin se puede entender la capacidad de una tcnica o mtodo para separar dos componentes en una mezcla. En la electroforesis capilar se define de forma anloga a la cromatografa: R = Separacin del pico / Anchura media del pico La separacin entre los picos resulta de las diferencias en las movilidades electroforticas de las especies, y por tanto ser la anchura de la banda la que determine

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la mayor o menor resolucin del mtodo. El flujo electroosmtico, que se ver ms adelante, es el responsable de la disminucin de anchura de las bandas. Los electroferogramas tienen la misma apariencia general que los cromatogramas, por ello, la nomenclatura utilizada para describir la separacin de los picos o bandas en cromatografa se usa tambin para la electroforesis capilar. Sin embargo, la mayor diferencia es que la posicin de los picos se determina por las movilidades electroforticas de los iones y no por las diferencias en las interacciones con la fase estacionaria. De manera que la eficacia (o nmero de platos N) en electroforesis capilar vendra dada por: N = eV / 2D donde D es el coeficiente de difusin del soluto. Por tanto, para aumentar la eficacia N, y por tanto la resolucin, es necesario aumentar lo mximo posible el potencial elctrico V.

7.1 Flujo electroosmtico

Fundamento: Al aplicar una diferencia de potencial entre los extremos de un capilar que contiene un lquido, se constata que el lquido se mueve. Este movimiento se denomina flujo electroosmtico (FE). La velocidad del flujo es proporcional al potencial aplicado y a la viscosidad del tampn y depende de la carga en la superficie del capilar. La causa de la aparicin del flujo electroosmtico es la formacin de la doble capa elctrica. Bsicamente es una separacin de la carga inica, una segregacin de capas de iones que se acumulan en la interfase formada entre la superficie del capilar y la disolucin. Los capilares usados en electroforesis capilar suelen ser de slice fundida. A pH por encima de 3, la pared interna del capilar de slice presenta carga negativa debido a la desprotonacin de los grupos silanol (Si-OH) de la superficie. Los cationes de la disolucin formarn cerca de la superficie del capilar una primera capa interna, fija, en la que los cationes, inmviles, estn unidos fuertemente a la superficie del capilar. Una segunda capa, denominada capa mvil o difusa, formada tambin por cationes aunque unidos de manera ms dbil a la superficie del capilar, migrar hacia el ctodo (electrodo negativo) en presencia de un campo elctrico. El resto de la disolucin, mediante capilaridad, migrar a la misma velocidad y en la misma direccin, lo que producir un perfil de flujo plano, a diferencia de la cromatografa, que produce perfiles de flujo laminar (figura 7.2).

EC Figura 7.2

HPLC

La segregacin de las capas de iones produce un potencial en la superficie que disminuye cuando aumenta la distancia desde la superficie. Este potencial es grande en la capa fija, y su valor va disminuyendo conforme se adentra en la capa difusa. El punto clave es que donde termina la capa fija an existe un cierto potencial, llamado

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potencial zeta , que permitir el movimiento del fluido. La velocidad del flujo electroosmtico es proporcional a la diferencia de potencial e inversamente proporcional a la viscosidad del tampn. La velocidad del FE va a variar en funcin de los cambios que se produzcan en el tampn; por ejemplo, una variacin del pH del tampn origina un cambio en la ionizacin del capilar y un aumento de la concentracin del tampn da lugar a una disminucin del flujo electroosmtico. En general, cualquier alteracin en la disolucin que modifique la carga en la superficie del capilar, modifique la viscosidad del tampn o requiera un cambio en el potencial, altera la velocidad del FE. Como se ha comentado, el flujo electroosmtico da lugar a un perfil de flujo plano, lo que reduce significativamente el ensanchamiento de banda y por tanto, mejora la resolucin. Adems, la gran ventaja que presenta el FE es que la separacin electrofortica y la deteccin pueden realizarse a la vez para cationes y aniones. Sin el FE, o slo aniones, o slo cationes migraran hacia el detector. El in de carga opuesta migrara retrocediendo al final de la inyeccin, y los compuestos neutros se quedaran al final y se dispersaran por difusin. Con FE todas las especies pasan por el detector. Finalmente, la velocidad de un in en la electroforesis capilar vendr determinada por su velocidad electrofortica y por su velocidad de flujo electroosmtico: v = (e + feo) E En una electroforesis capilar en la que las especies migran hacia el ctodo, los iones negativos tendrn una movilidad electrofortica e negativa, y por tanto estos iones migrarn ms lentamente que los positivos. El resultado final en el electroferograma ser una serie de picos que indican el siguiente orden de elucin: primero los cationes ms rpidos, seguidos sucesivamente de los cationes ms lentos, todas las especies neutras en una nica zona, y finalmente los aniones ms lentos seguidos de los aniones ms rpidos (figura 7.3).

Figura 7.3 13

7.2 Instrumentacin
Capilar, generalmente de slice fundida, de dimetro entre 10 y 100 m y longitud de 40-100 cm. Recipientes depsito para el tampn y los electrodos. Tampn, rellenando el capilar y los recipientes. Electrodos de platino Fuente de alimentacin de alto voltaje (30 kV y 0.400 mA). Detector.

Figura 7.4

7.3 Inyeccin de la muestra

Debido a que el volumen de lquido que cabe en el capilar es de 4-5 L, el volumen de muestra introducido ha de ser del orden de nanolitros: esto implica una serie de dificultades al inyectar las muestras en el capilar. Existen varios mtodos: Inyeccin electrocintica: se retira del depsito del tampn uno de los extremos del capilar junto con el electrodo, y se colocan en un pequeo recipiente que contiene la muestra. Se aplica un potencial de corriente durante un tiempo, por lo que la muestra penetra en el capilar debido al flujo electroosmtico y a la migracin inica. Despus el extremo del capilar y el electrodo son introducidos de nuevo en el recipiente con la disolucin tampn. Inconvenientes: la muestra no es del todo representativa, ya que se introduce en el capilar ms cantidad de los iones ms mviles respecto a los ms lentos. Inyeccin por presin: el extremo del capilar se coloca momentneamente en un pequeo recipiente que contiene la muestra, y se utiliza una diferencia de presin para conducir la muestra al interior del capilar. Esta diferencia de presin proviene de aplicar vaco en el extremo del detector o de la aplicacin de presin en el recipiente que contiene la muestra, o bien se consigue por elevacin del extremo que contiene la muestra respecto al otro extremo. La inyeccin por presin no diferencia los iones segn su movilidad, por lo que no es discriminativa; sin embargo, no es posible utilizarla en capilares rellenos de gel.

7.4 Modos de trabajo

Cuando el nodo (electrodo positivo) se encuentra en el extremo de inyeccin del capilar se dice que se opera en modo normal. Si es el ctodo (electrodo negativo) el que se encuentra en el extremo de inyeccin entonces el modo es de polaridad inversa.

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Para invertir el sentido de flujo electroosmtico normal se puede aadir un tensoactivo catinico al tampn: el tensoactivo se adsorbe sobre la pared del capilar y hace que sta quede cargada positivamente, de manera que el flujo electroosmtico queda invertido (as, los aniones del tampn sern arrastrados hacia el ctodo ms rpidamente). Tambin es posible eliminar el flujo electroosmtico por recubrimiento de la pared interna del capilar con un reactivo que elimine los grupos silanol.

7.5 Deteccin
Los detectores son semejantes en diseo y funcin a los de HPLC. Los ms utilizados seran los detectores de absorbancia y de fluorescencia. o Mtodos de absorbancia. Se llevan a cabo directamente sobre el capilar, al que previamente se le ha eliminado el recubrimiento protector de poliimida que suelen llevar. La parte del capilar pelado hace las veces de celda de deteccin; se incide a la muestra con radiacin UV/ visible, y se detecta la absorbancia ejercida por la muestra. Este mtodo tambin se puede realizar de forma indirecta para detectar especies con poca absortividad molar. En este caso se incorpora un cromforo inico, y el detector recibe una seal constante. Al pasar un analito, ste desplaza al cromforo, y la seal detectada desciende. o Deteccin por fluorescencia. Muy sensible y selectivo al analizar especies fluorescentes. Su lmite de deteccin es de 10-17- 10-20 moles detectados. o Deteccin electroqumica. Se utilizan de dos tipos, la amperomtrica y la conductimtrica. La amperomtrica, al igual que en cromatografa, tiene una extensa aplicabilidad sobre muy diversos grupos funcionales; es sensible a analitos que se pueden oxidar o reducir en un electrodo. La deteccin conductimtrica es universal para especies cargadas, y tiene un lmite de deteccin de 1 x 10-16 moles de analito. o Deteccin por espectrometra de masas. El aparato electrofortico est acoplado a un espectrmetro de masas (figura 7.5). El efluente procedente del capilar pasa directamente a un dispositivo de ionizacin por electronebulizacin (bsicamente, consiste en aplicar un elevado potencial a la salida del capilar, creando un aerosol de gotas muy pequeas cargadas, que se irn evaporando para liberar iones gaseosos) y posteriormente los productos entran en el filtro de masas cuadrupolar para su anlisis. Este mtodo es muy usado para la determinacin de molculas grandes, entre las que incluimos protenas, fragmentos de DNA y pptidos. El lmite de deteccin para este mtodo es de 1 x 10-17 moles de analito.

Figura 7.5

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8. TIPOS DE ELECTROFORESIS CAPILAR 8.1 Electroforesis capilar de zona (CZE)

Los fundamentos son los que se han comentado en los apartados anteriores. La composicin del tampn es constante en toda la zona de separacin, y los analitos se separarn en funcin de su movilidad, llevando todos (cationes, aniones y especies neutras) la misma direccin, debida al flujo electroosmtico. Anteriormente, para el anlisis de cationes se utilizaba fundamentalmente la espectroscopia de absorcin atmica, y para los aniones la cromatografa de intercambio inico. Sin embargo, los equipos ms econmicos, los menores requerimientos de muestra, la mayor rapidez y la mejor resolucin hacen de la electroforesis capilar el mtodo ms apropiado para separar estos analitos. La CZE puede tambin separar molculas de distintos tamaos (pesticidas, frmacos) siempre que sean molculas cargadas o puedan derivatizarse para dar un in.

8.2 Electroforesis capilar en gel (CGE)

En la electroforesis convencional se empezaron a usar geles para reducir la dispersin del analito debida a la difusin del propio analito y a la conveccin. Posteriormente se observ que el gel poda actuar de tamiz molecular, haciendo que las especies migrasen en grados diferentes segn su tamao y segn el tamao de poro del gel. Este tipo de separacin por tamaos es til para especies que tienen la misma carga pero diferente tamao. La CGE se lleva a cabo en una matriz formada por un polmero de acrilamida (poliacrilamida), que deja una serie de poros en los que se aloja el tampn y en los que se lleva a cabo la separacin. Tambin es posible realizar la CGE con geles de agarosa.

8.3 Isotacoforesis capilar (CITP)

En esta modalidad de electroforesis las bandas de los analitos migran todas a la misma velocidad. La muestra ha de inyectarse entre dos tampones: el frontal, que contiene los iones de mayor movilidad (esta movilidad ha de ser mayor que la de los componentes a analizar), y el terminal en el que van los iones de menor movilidad que los iones de la muestra. Este mtodo no puede utilizarse para separar a la vez aniones de cationes. En un principio, los iones migran a distintas velocidades, segn v = eE, y la diferencia en las velocidades de migracin da lugar a la separacin de los distintos analitos en bandas adyacentes, con la especie ms rpida situada en la banda ms prxima al tampn conductor y la especie ms lenta inmediatamente por delante del tampn terminal. Una vez que se han formado las bandas, todas se mueven a la misma velocidad. Esto ocurre porque el potencial se hace ms reducido para las bandas ms mviles y se hace ms intenso para las bandas ms lentas, de manera que la corriente es la misma en todas las zonas del tampn. Las separaciones entre bandas son ntidas. Si un soluto empieza a difundir a la banda prxima ms rpida, se encuentra con un campo

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ms bajo, lo cual reduce su velocidad hasta hacerle caer, de nuevo, en su banda original. Las diferentes bandas de analitos estn situadas a continuacin las unas de las otras, y no hay bandas de tampn entre ellas que las separen. El resultado no es un electroferograma con los distintos picos, sino un diagrama en funcin del tiempo con forma de escalera.

8.4 Isoelectroenfoque capilar (CIEF)

La separacin de los analitos en este caso est basada en sus diferentes puntos isoelctricos (la carga neta de la molcula es cero). Los analitos han de ser sustancias anfteras (sustancias que en disolucin son capaces tanto de ceder como de aceptar un protn, como aminocidos y protenas). La separacin se lleva a cabo en una mezcla de tampones cuyo pH vara a lo largo del sistema de separacin, es decir, se establece un gradiente de pH mediante la mezcla de tampones especiales denominados anfolitos, que son compuestos anfteros. Los analitos se disuelven en la mezcla de anfolitos y se introducen en el capilar. Uno de los extremos del capilar se introduce en una disolucin bsica, en la cual tambin se aloja el ctodo. El otro extremo del capilar se introduce en una disolucin cida que contiene el nodo. Al aplicar el voltaje, los protones migrarn desde el nodo hacia el ctodo, y los iones hidroxilo migrarn desde el ctodo hasta el nodo. De esta manera se establece el gradiente de pH. Cuando una molcula, bien sea un analito o bien un anfolito, tiene una carga negativa neta, entonces migrar hacia el nodo. Esta migracin se detiene cuando la molcula alcanza una zona del capilar en la que el pH es igual a su punto isoelctrico, es decir, la molcula tendr una carga neta cero en ese punto y dejar de migrar. El resultado es la separacin de los analitos en bandas estrechas, situadas en el valor de pH correspondiente a su punto isoelctrico. Estas separaciones, por tanto, no se basan en las diferentes velocidades de migracin de los analitos. Sin embargo, para poder visualizar el resultado de la separacin es necesario que las bandas ya enfocadas migren hacia el detector. La movilizacin de las bandas puede llevarse a cabo aplicando una diferencia de presin (al igual que se hace para cargar la muestra en el capilar) o cambiando la disolucin de uno de los dos compartimentos del electrodo.

8.5 Cromatografa electrocintica capilar micelar (MEKC)

Este mtodo, que combina la cromatografa y la electroforesis capilar, permite la separacin de molculas no cargadas. Es necesario aadir un elemento tensioactivo en concentraciones lo suficientemente grandes como para que forme micelas. Las micelas se forman en disolucin acuosa cuando la concentracin de sustancias tensioactivas, que tienen una cadena larga hidrocarbonada y un grupo inico, se incrementa por encima de un valor denominado concentracin crtica micelar (CMC). Las micelas formadas constituyen una segunda fase que alojan en su interior los compuestos no polares. El tensioactivo ms utilizado es el dodecil sulfato sdico (SDS). La superficie de una micela de SDS posee una elevada carga negativa, por lo que las micelas y los compuestos apolares que lleven en el interior tendrn una movilidad electrofortica alta

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y se desplazarn hacia el nodo. Pero la velocidad del flujo electroosmtico del tampn hacia el electrodo negativo ser mucho ms alta, lo que provoca que las micelas tambin se muevan hacia el ctodo, aunque a una velocidad mucho menor que la del resto de la disolucin. Por tanto, el orden de aparicin en el detector ser primero los analitos de la muestra que sean polares (solubles en el tampn) y tras ellos, bastante separadas, las micelas que contienen los compuestos no polares, El mecanismo de separacin depende de las diferencias de los coeficientes de distribucin de los analitos entre la fase mvil acuosa y la fase pseudoestacionaria hidrocarbonada.

8.6 Aplicaciones al anlisis de alimentos

Anlisis de biopolmeros en los alimentos: - Determinacin de protenas de la leche (casenas, -lactoalbminas, lactoglobulinas). - Anlisis de protenas del trigo. - Determinacin de carbohidratos por CZE con deteccin amperomtrica mediante electrodo de cobre (glucosa y fructosa en bebidas de cola). - Determinacin de oligosacridos mediante CZE (rafinosa, estaquiosa y verbascosa de semillas de leguminosas). Anlisis del color/sabor de los alimentos: - Determinacin de colorantes sintticos mediante CITP (muestras de diversos alimentos slidos: puddings, golosinas) - Anlisis de los flavonoides de la caa de azcar mediante CZE. - Separacin de los cidos del lpulo que dan amargor mediante CZE y MEKC (cidos y de extracto de lpulo comercial). Anlisis de compuestos orgnicos en alimentos: - Determinacin del total de vitamina C en frutas mediante CZE (muestras de zumo de naranja). - Determinacin cuantitativa de cafena en bebidas mediante CE (muestras de caf, t, cola y cacao). - Comparacin cuantitativa de la CZE con la HPLC para la determinacin de aditivos en alimentos (cafena, aspartamo y cido benzoico en refrescos). - Determinacin cuantitativa de propionato en pan mediante CZE. Anlisis de iones inorgnicos: - Anlisis cualitativo de aniones presentes en cerveza, salsa de soja, t y caf. - Determinacin semicuantitativa de calcio, sodio, cloruros, fosfatos y citratos en muestras de leche.

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9. BIBLIOGRAFA
Braga MEM, Moreschi SRM, Meireles MAA. Effects of supercritical fluid extraction on Curcuma longa L. and Zingiber officinale R. starches. Carbohydrate Polymers, 2006; 63: 340-346. Dean JR, Liu B, Ludkin E. Supercritical fluid extraction of caffeine from instant coffe. En: Supercritical fluids. Methods and protocols. Williams JR, Clifford AA (eds). Totowa, New Jersey: Humana Press. 2000. Douglas A. Skoog, Donald M. West. Qumica Analtica 4 ed. McGraw-Hill. Madrid. Par JR, Blanger, JMR (Editors). Instrumental Methods in Food Analysis. Elsevir Science B.V. 1997. Chapter 9: Capillary Electrophoresis: principles and applications. Sally Swedberg. Rousseac F, Rousseac A. Anlisis Qumico. Mtodos y tcnicas instrumentales modernas. Madrid: Mc Graw Hill / Interamericana de Espaa. 2003. Rubinson KA, Rubinson A. Anlisis instrumental. Ed. Pearson Education, SA. Madrid 2001. Skoog, D.A, West, D.M and Holler, F.J. Fundamentos de Qumica Analtica 4 ed. Revert, S.A. (1997). Skoog DA, Holler FJ, Nieman TA. Principios de anlisis instrumental. Quinta edicin. Madrid: Mc Graw Hill / Interamericana de Espaa. 2001. Williams JR, Clifford AA. Supercritical fluids. Methods and protocols. Totowa, New Jersey: Humana Press. 2000. Zuidmeer L, van Leeuwen WA, Budde IK, Breiteneder H, Mills C, Sancho AI, Meulenbroek EJ, van de Weg E, Gilissen L, Ferreira F, HoffmannSommergruber K, van Ree R. Allergenicity assessment of apple cultivars: hurdles in quantifying labile fruit allergens. International Archives of Allergy and Immunology. 2006; 141(3): 230-240.

Otras fuentes:
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apqui m-an-instr-14/skoog/30.html http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apqui m-an-instr-14/harris/c26c.html

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