UNIVERSIDAD AUTNOMA BENITO JUREZ DE OAXACA

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA II
PRCTICA N 1

<<< NEFELOMETRA>>> POR:

BARRIOS SANCHEZ EUSEBIO RAMREZ MORALES RAFAEL DE JESS RUIZ CRUZ RODRIGO EMMANUEL

QUINTO SEMESTRE GRUPO B

LIC. QUMICO FARMACETICO BILOGO

SEPTIEMBRE 2009
OAXACA DE JUREZ OAXACA

INTRODUCCIN
Los mtodos directos de cuantificacin de microorganismos permiten establecer la poblacin total de microorganismos existentes, tienen la ventaja de ser rpidos aunque no es posible diferenciar a las clulas vivas de las muertas. Entre estos mtodos tenemos la Nefelometra y Turbidimetra. Nefelometra: La nefelometra es un procedimiento analtico que se basa en la dispersin de la radiacin que atraviesan las partculas de materia. Cuando la luz atraviesa un medio transparente en el que existe una suspensin de partculas slidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia. La dispersin no supone la prdida neta de potencia radiante, solo es afectada la direccin de la propagacin, porque la intensidad de la radiacin es la misma en cualquier ngulo. La intensidad depende de: el nmero de partculas suspendidas, su tamao, su forma, los ndices refractivos de la partcula y del medio dispersante, y la longitud de onda de la radiacin dispersada. La relacin entre variables y es ms factible un tratamiento terico, pero debido a su complejidad raras veces se aplica a problemas analticos especficos. El procedimiento generalmente es emprico y slo se consideran 3 factores: 1. La concentracin: Mayor sea el nmero de partculas, mayor es la dispersin. 2. Tamao de la partcula: Factores como el pH, la velocidad y orden de la mezcla, concentracin de los reactivos, duracin del estado de reposo y la fuerza inica.

3. Longitud de onda: Generalmente las muestras se iluminan con luz blanca, pero si estn coloreadas, se debe escoger una porcin del espectro electromagntico en la que la absorcin del medio se reduzca al mnimo. En las muestras se agregan agentes tensoactivos (como gelatina), para prevenir la coagulacin del coloide. Slo se obtienen datos confiables si se controlan escrupulosamente las variables que afectan el tamao de partculas. Generalmente, nefelometra y Turbidimetra se utilizan en el anlisis de la calidad qumica del agua para determinar la claridad y para el control de los procesos de tratamiento. Turbidimetra: En una suspensin microbiana la cantidad de microorganismos esta directamente relacionada con la turbiedad o densidad ptica. La metodologa es til con suspensiones de densidad microbiana baja y con cultivos en donde los microorganismos son unicelulares y con un tamao de unos cuantos micrmetros, caractersticas que les permiten mantenerse suspendidos y homogneamente distribuidos; en tanto que con microorganismos de mayor tamao y con aquellos productores de polisacridos esta metodologa no es adecuada. Generalmente se emplean para medir las concentraciones especificas, de colonias bacterianas en algn medio de cultivo, as como la medicin de muchas protenas molecular. Diferencia Nefelometra Y Turbidimetra La eleccin entre uno de ambos mtodos reside en la dispersin de luz, si es extensa, es apropiado aplicar la Turbidimetra, en cambio si es mnima es apropiada la nefelometra. De la nefelometra se obtienen mejores resultados, utilizando as el principio de la dispersin luminosa

porque determina concentraciones de pocas partes por milln (ppm), con una precisin de 1 al 5%. La nefelometra se basa en la medicin de radiacin dispersa, en cambio la Turbidimetra en la medicin de la intensidad de un haz disminuido. El instrumento usado en la nefelometra, el nefelmetro se asemeja al fluormetro. En cambio en Turbidimetra se utiliza el turbidemetro que es un fotmetro de filtro.

OBJETIVOS
Conocimiento de mtodos turbidemetricos, as como, la preparacin del Nefelmetro de Mac Farland.

FUNDAMENTO
Existen numerosos mtodos que permiten establecer el nmero de microorganismos en una muestra determinada, los resultados de este tipo de ensayos tienen mltiples aplicaciones. En general los ensayos de cuantificacin microbiana se agrupan en mtodos directos y mtodos indirectos.

PROCEDIMIENTO
Equipo, Material y Reactivos Necesarios MATERIALES Y REACTIVOS H2SO4 al 1% 250 ml. BaCl2 al 1% 250 ml.

10 tubos de ensaye con tapones de rosca.

DESARROLLO DE LA PRCTICA.
METODOLOGIA.

Antes de iniciar la prctica nos dimos a la tarea de verificar que cada tubo de ensaye a utilizar tuviera un tapn enrroscable para evitar el escurrimiento o derrame de la sustancia que contendr en su interior. A estos tubos se les agrego la cantidad sustancias sugeridas en la tabla siguiente. Tambin se llevo a cabo la preparacin de reactivos segn instrucciones del responsable del laboratorio. N DE TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ml HSO4 AL 1% 9.9 ml 9.8 ml 9.7 ml 9.6 ml 9.5 ml 9.4 ml 9.3 ml 9.2 ml 9.1 ml 9.0 ml ml BaCl2 al 1% 0.1 ml 0.2 ml 0.3 ml 0.4 ml 0.5 ml 0.6 ml 0.7 ml 0.8 ml 0.9 ml 1.0 ml de

CALCULOS Y REPORTE DE RESULTADOS.

Logramos obtener un buena turbidez que se notaba en ascenso desde el tuvo uno al tuvo diez en perfecto orden sin alterar ninguno de los tubos. N DE TUBO ml H2SO4 AL 1% ml BaCl2 al 1% Nmero aproximado de bacterias representadas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 9.9 ml 9.8 ml 9.7 ml 9.6 ml 9.5 ml 9.4 ml 9.3 ml 9.2 ml 9.1 ml 9.0 ml 0.1 ml 0.2 ml 0.3 ml 0.4 ml 0.5 ml 0.6 ml 0.7 ml 0.8 ml 0.9 ml 1.0 ml

INTERPRETACIN Y CONCLUSIONES
Dado a que no se prestaron las condiciones pertinentes para llegar una grata conclusin, solo podemos exponer que la elaboracin del nefelmetro, es

de decir de nuestros tubos patrn fue un xito, aunque esperamos que al ser utilizados satisfagan las necesidades requeridas.

ANEXOS
1.- Cules son los mtodos directos ms utilizados en recuento de Microorganismos?
Entre los mtodos principales de recuento de microrganismos podemos destacar: 1.- Las tcnicas de recuento microscpico de clulas sin fijar usando microscopa de contraste de fae. Para ello se cuenta el nmero de partculas en un volumen determinado usando una clula de Petroff-Hauser o de Neubauer (portaobjetos modificado en e que una rejilla nos permite conocer el volumen que estamos observando). El procedimiento es rpido y sencillo; pero no permite distinguir clulas vivas inmviles de clulas muertas. 2.- Contaje de partculas utilizando sistemas automticos del tipo Coulter Counter. La operacin de estos sistemas es sencilla (mtodo de empleo) y permite rpidamente determinar el nmero de patculas presentes en una suspesin y la distribucin de sus tamaos. El problema es que no distingue entree clulas vivas y muertas ni entre clulas y agregados de material insoluble presente en la suspensin del cultivo. 3.- Tcnicas de recuento en placa, basadas en colocar en un medio de cultuivo adecuado un volumen determinado de muestra. Cada una de las clulas aisladas dar lugar, despus de la incubacin correspondiente, a una colonia de forma que el nmero de estas nos permitir estimar el nmero de clulas presentes en la muestra plaqueada (sembrada). El sistema es fcil de utilizar en el caso de clulas aisladas (no sirve en el caso de hongos filamentosos, por ejemplo). Puede realizarse sembrando en superficie (extendiendo un volumen dado de muestra sobre el medio de cultivo slido) o en profundidad (mezclando

el

un volumen dado de muestra con el medio de cultivo antes que solidifique). Esta ltima opcin permite realizar el recuendto de microorganismos microaerfilos que no crecen bien en la superficie de las placas de cultivo. Para que el sistema de recuento en placa tenga validez estadstica, es necesario contar entre 30 y 300 colonias con objeto de disminuir el error de la medida. 4. Tcnicas turbidomtricas basadas en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los que crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las partculas en suspensin (clulas) y su medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un equipo similar al que se emplea en la medida de la absorbancia de luz por disoluciones coloreadas (colormetro, por ejemplo). Las medidas se hacen a una longitud de onda adecuada (normalmente en el entorno de 550 nm) y los valores se suelen denominar valores de densidad ptica. La limitacin de este sistema, por otra parte muy sencillo, es que no distingue clulas vivas de muerta y que normalmente no es capaz de detectar densidades celulares menores a 10.000 clulas por mililitro. 5.- Medida de peso seco. El sistema consiste en la filtracin del cultivo a travs de una membrana que retenga las clulas y su posterior desecacin hasta peso constant. El sistema, obviamente, no disferencia clulas vivas de muertas y su sensibilidad es limitada. 6.- Medida del ATP. Es una medida relativamente sencilla basada en la emisiin de luz por la luciferasa de lucirnaga (Photimus pyralis) en presencia de O2 y de ATP. De esta forma se puede medir la concentracin de ATP en un volumen dado de cultivo. Esta medida es interesante porque la concentracin de ATP decae rpidamente en las clulas muertas, de forma que esa medida indirecta detecta nicamenta las clulas vivas

2.- Qu es lo que representa UFC y cul es su importancia?

Unidades Formadoras de Colonias es un valor que indica el grado de contaminacin microbiolgica de un ambiente. Expresa el nmero relativo de

microorganismos de un taxn determinado en un volumen de un metro cbico de agua. UFC es el nmero mnimo de clulas separables sobre la superficie, o dentro, de un medio de agar semi-slido que da lugar al desarrollo de una colonia visible del orden de decenas de millones de clulas descendientes. Las UFC pueden ser pares, cadena o racimos, as como clulas individuales Unidad formadora de colonias. Una dilucin hecha con bacteria y agua peptonada se coloca en el plato de agar (Cuenta de plato agar para muestras alimenticias o Agar trypticase de soja para muestras clnicas) y expandida en el plato siguiendo este patrn.

Las "Unidades Formadoras de Colonias" (ufc) se miden en por mililitro).

(UFC

Unidades Formadoras de Colonias. El valor de UFC por metro cbico (UFC/m), indica el grado de contaminacin microbiolgica de un ambiente. Es un valor que expresa el nmero relativo de microorganismos de un taxn determinado en un volumen de un metro cbico de agua.

Las "Unidades Formadoras de Colonias" (ufc) de miden en diferentes volmenes, y uno de los ms usados para las analticas son ufc/100ml. Se encuentra esta medida en cualquier analtica para la potabilidad del agua.

3.- A que se refiere la tcnica del nmero ms probable?

EL MTODO DE NMERO MAS PROBABLE (NMP) es una estrategia efeciente de estimacin de densidades poblacionales especialmente cuando

una evaluacin cuantitativa de clulas individuales no es factible. La tcnica se basa en la determinacin de presencia o ausencia (pos o neg) en rplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Porlo tanto, un requisito importante de este mtodo es la necesidad de poder reconocer un atributo particular de la poblacin(es) en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrn de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabililstica. Algunas de las ventajas del NMP son: (i) la capacidad de estimar tamaos poblacionales basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo se puede determinar la densidad poblacional de organismos que pueden nodular leguminosas en una muestra de suelo usando el mtodo de infeccin de plantas, (ii) provee una recuperacin uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados, (iii) determina slo organismos vivos y activos metablicamente, y (iv) suele ser ms rpido e igual de confiable que los mtodos tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo, entre otros. En este ejercicio, se utilizar una variante de esta metodologa para estimar la densidad total de bacterias presentes en una muestra. El atributo particular a utilizarse ser la capacidad de microorganismos a formar colonias en medios slidos de crecimiento.

4.-Citar ejemplos de mtodos para recuento microscpico

Recuento microscpico:

Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de microbiologa. Para estos recuentos se utilizan generalmente cmaras de recuentos, aunque tambin pueden realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y transparentadas o teidas con colorantes fluorescentes (Naranja de acridina). La mayor dificultad del recuento en cmara es obtener reproducibilidad en el llenado de la cmara con lquido. Otra dificultad es la adsorcin de las clulas en las superficies del vidrio, incluyendo pipetas. Esta adsorcin es crtica en el proceso de dilucin de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de alta fuerza inica (solucin fisiolgica o medios mnimos sin fuente de carbono). Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksley y la de PetroffHausser. La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersin, aunque la mayora de los recuentos se realizan con objetivos secos. Una de las mayores ventajas del recuento microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de los objetos contados.

Cmara de recuento de Petroff-Hausser

Tipo de cuadro

Area [cm2]

Volumen [ml]

Factor [1/Volumen]

Cuadrado total Cuadrado grande Cuadrado pequeo

1.00 x 10-2 4.00 x 10-4 2.50 x 10-5

2.00 x 10-5 8.00 x 10-7 5.00 x 10-8

5.00 x 104 1.25 x 106 2.00 x 107

1/Dilucin: Inversa de la dilucin utilizada para llenar la cmara de recuento. Nmero de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cmara que se utilizaron para contar un el nmero de bacterias. Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la cmara. Depende del tipo de cuadrado en donde se realiz el recuento. Por ejemplo, cada cuadrado pequeo tiene un volumen de 5 x 10-8 ml (50 m x 50 m x 20 m = 5 x 104 m3 = 5 x 10-8 ml)

Recuento electrnico: Los contadores electrnicos permiten realizar recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y microorganismos filamentosos o miceliares. Estos instrumentos constan bsicamente de dos compartimientos comunicados a travs de un pequeo conducto. En ambos compartimientos hay electrodos que miden la resistencia elctrica del sistema, y como el orificio del conducto es muy pequeo y su resistencia es muy alta, la resistencia elctrica de cada compartimiento es independiente. El principio de

funcionamiento de estos instrumentos es el que se explica a continuacin. Un volumen fijo de una suspensin bacteriana es forzada a pasar desde un compartimiento al otro a travs del pequeo conducto, en un muy breve intervalo de tiempo. Cuando un microorganismo pasa al nuevo compartimiento, la resistencia de ste se incrementa debido a que la conductividad de la clula es menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y contados. Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. Ciertas bacterias muy pequeas producen cambios en la resistencia que son comparables al "ruido" generado por la turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio. No pueden medirse clulas que formen filamentos o agregados o soluciones muy concentradas de microorganismos, debido a que el pasaje de ms de una clula en un breve perodo de tiempo va a ser tomado como una clula ms grande. Es comn la obstruccin del orificio por microorganismos muy grandes.

REFERENCIAS
BIBLIOGRAFIA BASICA: ATLAS R.M. MICROBIOLOGIA FUNDAMENTOS Y APLICACIONES EDITORIAL CECSA

INGRHAM J. L. Y G. A. INGRHAM INTRODUCCIN A LA MICROBIOLOGIUA I Y II EDITORIAL REVERTE S.A. PRESCOTT-HARLEY-KLEIN MICROBIOLOGIA EDITORIAL Mc GRAW HILL

MADIGAN, MT., J. M. MARTINKO Y J. PARKER BIOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS 8 EDICION PRENTICE HALL IBERIA ESPAA PELCZAR Y COL. MICROBIOLOGIA GENERAL EDITORIAL Mc GRAW HILL