CAPITULO 3 Aminoacidos, péptidos y proteinas Las herramientas de auto-estudio que srven para practicar lo aprendido y reforza los conceptos presentados en este capitulo se encuentran disponibles en la red. Viste www macrnillaleatning.com/LehningerBiochemistry7e. 3.4 Estructura de proteinas: los procesos que tienen lugar en la estulay ejercen civersidad cast inagotable de funciones. En la exploracién de los mecanismos moleculares de un pro- eso biol6gico, el bioquimico debe estucliar, de manera casi inevitable, una 0 més proteinas. Las protenas son Jas macromoléculas bil6gicas mas abundantes ¥ estan presentes en todas las elulas y en todas las partes de la célula, Las proteinas también presenian una gran varie- dad; en una sola célula se pueden encontrar miles de protcinas diferentes. Siendo lo drbitros de las funcio- nes moleculares, las roteinas son los products finales més importantes de las rutas de informacién que se diseuten en la Parte Ill de este libro, Las proteinas son Jos instrumentos moleculares mediante los que se ‘expresa la informacion genética. 1a clave de la estructura de los miles de protetnas ‘iferentes se encuentra en unas subunidades monomé- ricas relativamente simples. Las proteinas de todos los organismnos, desde las bacterias ms simples al ser ‘humano, estén constnuidas a partir del mismo conjunto de 20 aminoficidos, Puesto que cada uno de estos arni- nodcidos tiene una cadena lateral propia que determina sus propicdades quimicas, se puede considerar a este srupo de 20 moléculas precursoras como el alfabeto en que esté escrito el lenguaje de la estructura proteica. ara generar una proteina determinada se unen aminoécidos de forma covalente en secuencia lincdles caracterstcas. Lo que resulta més extraordinario es aque las céulas puedan producir proteinas eon propieda- des y actividades muy diferentes uniendo ls mistmos 20, aminoécidos en multitud de combinaciones y secuen- cias diferentes. A partir de estos bloques estructurales Jos diferentes organismos pueden fabricar productos tan diversos como enimas, hormonas, anticuerpos, transportadores, Obras musculares, la proteina del cris” talino del ojo, plumas, telas de arafta, cuernos de rino- ceronte, protefnas de ia leche, antibiéticos, venenos de hhongos y una pléyade de otras sustanclas con activida- des bioldgicas distintas (Pig. 3-1). Los enzzimas son los. BR srt mas vara y spc de précticamente todas las reaccio— res celulares, los enzimas constituyen una de las claves: para comprender la quimica de la vida y son un punto de referencia para cualquier curso de bioquimica. La estructura y funcién de las proteinas constituye eltema de este capitulo y de los tres siguientes. Bripe- zamos con una descripeidn de las propiedades quimnicas fundamentales de los aminodcidos, los péptides y las protefnas. También consideraremos la manera en. que ‘un bioquimico trabaja con proteinas. 3.1 Aminoacidos Las proteinas son polimeros de aminodcidos, en los que cada residuo aminodeido esti unido al siguionte a tra- vés de un tipo especifico de enlace covalente. (Bi ténmni- no “residuo” refleja la pérdida de los elementos del agua cuando un aminodcido se une a otro.) Las proteinas se ‘pueden degradar (hidrolizar) hasta sus aminodcidos constituyentes mediante diversos métodos, por lo que los esturtos iniiales sobre las protofnas se centraron en los aminodcidos libres procedentes de las mismas. Veinte son los aminodcidos encontrados habitualmente en las proteins. El primer aminodcido descubierto fue la aspa- ‘agina en 1806, El titimo de los 20 que se encontré fue la ‘reonina, que no fue identificada hasta 1998. Todos los aminoscidos tienen nombres comuunes o triviales que, en. algunos casos, provienen de la fuente de la cual se aisla- ron inicialmente. La asparagina se encontré por primera vex en el esparrago y el dcido ghutamico se encontr6 en el sluten de trigo; la Urosina se aisié por primera vez del ‘queso (asi su nombre proviene del griego tyros, “queso”);, 7576 —_minoicides, péptids y proeinas FIGURA 3-1 Algnasfuncones de as protelas. (2) La luz pou pur la uclrnags el retado de une reacin en aueltervene a protein Lcfenay ATP, catalizace por el encima uciterasa (vase Rocuaér 13) (8) Los eitocios cntenen grandes catidades de a protena Wanspvtadoe de cxgena hemoglobina (€ La protena ue ‘aia, producide on todos los vertbrados. eo congener etic tual penepa del pele, escomas, curr, lana Rasy plumas. lino ¥ la glicina (del griego giykos, “duice”) se denominé de. ‘esta manera debido a su sabor dulce Los aminoacidos tienen caractersticas estructurales, comunes Los 20 aminodcidos estandar encontrados en las protef- ‘nas son @-aminodicidos. Todos tienen un grupo carboxi- Joy un grupo amino unidos al mismo atorno de carbono (el carbono a) (Fig. 8-2). Difieren entre ellos en sus ccadenas laterales, 0 grupos R, que varian en estructu- 1a, tamafio y carga eldetrica y que influyen en Ja solu lidadt en agua de los aminodeldos. Ademds aminodeidos existen muchos mAs que son res, Algunos de ellos son residuos que han sido modifica dos después de la sintesis de la protesna; otros se halla Dresentes en organismos vivos pero no como unidades constituyentes de las proteinas y dos més son casos espe- ciales que se encuentran en tan solo unas pocas protef- nas. A los aminodcidos estandar de las protefnas se les than asignado abreviaturas de tres letras y simbolos de luna sola letra (Tabla 3-1) que se utiizan para indicar de ‘manera abreviada la composicién y secuencia de aminos- cidos polimerizados en las proves, >> Convencié Clave: El codigo de tres letras es transpa- rente: las abreviaturas consisten generalmente en las tres primeras letras del nombre del aminoéeido. El c6di- 0 de una letra fue propuesto por Margaret Oakley Dayhoff, considerada por muchos como la fundadora del campo de la bioinformatica. El eddigo de una sola letra procede del intento de reducir el tamatio de los archivos de datos (en la era en que se usaban fchas agujereadas) utilizados para la descripcién de las secuencias de aminodcidos, Se disen6 para ser memmort- zada facilmente y la descripeién de su origen puede ser FIGURA 3-2 Estructura general de un sminodldo. Esa estructura es comin odes fos aramid, con una inca A) eccepcin. (La ecepcn es la praia un aminoseide cio) EI gupo R 0 ‘cadena later! (pireu unio at r+ tno a (gis) es diferente pia cada amined, ceronte negro saiaje se encuentra en vas de eatin debide 2 la renci entenda en algunas partes det mundo de que el polio der ado de Su Cuero lene propedadesarodiacas. En relia, as pro- Dida quiicas del palo de easina de inacernte a son fren es del dean penn de vidos o de as vas humana. [Fuentes 2) Jel DahAlamy. (6) il Longeore/Scince Source. (e) Mary Cooke/ Animate Animale} tal estudiate. Lape thera letra del nombre el tninoeldo ‘es nice para seis de ellos (CHIMSV), por Je que se ulllzn decets mene como su shnbolo. Pannen’ coco iter fcidos (AGLET), i primera feta noes nica y oe asia Al aminoscid nds Gecuente en proteinas (por ejemplo, ial Oulu 1s ck Ge ir trees ROOT aque la lisina). Fin el caso de TION ctros cuatro, a letra utiliza: aes oneticamente suget- va en idioma inglés (RFYW: aRginina, Fenilalanina, tYrosina, tWipt6fano). £) resto fueron de asignacion: més dificil. Cuatro de ellos (DNEQ) recibieron letras Contenidas en sus nombres oSugerias por ells (asp Dico, asparagiNa, glutémEco, Q-tamina ~ por glutami- na). Restaba la lisina. De las pocas letras no usadas del alfabeto se escogié la K, que es la mas préxima a L. «¢ En todos los aminoscidos esténdar excepto la glici- ra, el carbono a esté unido a cuatro grupos diferentes: wun grupo carbosilo, un grupo amino, un grupo R y un ‘tomo de hidrégeno (Fig, -2; en la glicina el grupo R es ‘tre stomo de hidrégeno). El tomo de carbono a es, ppor tanto, un centro quiral. Debido al ordenamiento Tetraédrico de los orbitales de enlace alrededor del ‘tomo de carbono a, los cuatro grupos diferentes pue- den ocupar dos ordenamnientos diferentes en el espacio, poor Jo que los aminodeidos pueden aparecer en forma de dos estereoissmeros. Al ser imagenes especulares no superponibles entre si (Fig. 3-3), las dos formas cons- tituyen un tipo de estereoisémeros denomninados enan- ‘tiémeros (véase la Fig. 1-20). Todas las moléculas con, ‘un centro quiral son también épticamente activas, es decir, hacen girar el plano de la uz polarizada (véase el Recuadro 1-2). >> Convencién Clave: Se utilizan dos convenciones para Jdentificar los carbonos de un aminodcido, una practica ‘que puede generar confusién. Los carbonos adicionales, dde un grupo R, se designan cominmente 8, , 8, €, tc,Alanina Ala A. 8928 969 601 78 | Protina ProP 1151.98 10.96 6.48 52 | | Vatina vay uy age 962 597 66 Leucinn lev 131238880 598 a | Isoleucina Tel 131235988 602 ss | Motionine MetM «M9228 921 5m 18 23 | Grupos R | arométicon | | Fenialanina Phe F 165188 93 548 8 as | | Tirosina ‘Tyry 181 2,20 OAL 10,07 5,56 AB 32 Triptano TW 2M 238888 589-09 M4 | Grupos R polares sin earga Serina SerS 10522 9.5 565 08 68 ‘Treonina Thr T 119 iL 9,62 587 47 59 Cisteinar cysC 121198 1028 BIB 5078 19 | Asperaging == ASN 02/8) Sal 35 43 Glutamina amg CoB Qhstion 565 35 a | Grupos R cargados positivamente | Lisina LysK 146 218 8,95 10,63, 9,74 39 59 Histidina His H 155 182 917 6,00 759 32 23 Arainina AgR 174217 90412481078 51 Grupos R cargados negativamente Aspartate ApD 1391880803858 53 Giuramato Guz 721967 AH 63 “Los valores de, refer a ecu tly come so mumsran oa Fgura. Los elementos dl aqua (4 18) se estan cuando aminokcio ‘elrcomera aun ealsetcn. 2 “une escola que sombin a Mobley a idricldad d os gps Loe valores ran a ane bre (AG) de ranaterecia do cade Inter det rsrokcio deede un aaclarte artdbico a agua, Cte tarslerenca on evorabe 186-9, ver nega on sod pare emotes ‘con caver tral cargosa 9 put y deslvortie (4600, valor postiv anode) pare arinosisos cor casera irl spor as reba. ‘Vee o Cagto 17 Toredo de. Rey RF Doo Ma. Bit 67°16, 1902, ‘Pasorcia moda on més ce 1.150 proteins. Tormado de RF Doe en Prccton of Pte Sructue andthe Pncbes of Pen Conformation (GD. Fessren, od 599, Perum Poss, 1880, “Oighalmente once hiroptico consider le Facutncn on que un amino pare an a superci de un prea. Ondo ae le probes ‘parce a enuce ona Supercle le ge; wy ver en ldo a ue see Gadus part do su case rl e gupce Neon. “cist se clastic generate como poli a pesar de tne un nce do hicropata postvo. Eo efi la capacidad ow grupo suc para ‘ar como aac dab y para fomar races deMregene debe coro oxgene 8 rarSgeno, cempezardo a partir del carbono . Para la mayoria de Eta las demés moléculas orgénicas, los étomos de earbono temuncren simplemente «partir de un exten, dando “ont Eatin Shara Ja maxima prioridad (C-1) al carbono con el sustituyen- “Hy ty te que contenga el étomo de mayor nimero atémico sina Siguiendo esta tltima convencién, el grupo carboxilo de un aminoscido seria el C-1 y el carbono a serfa el En algunos casos, como en amincécidos con grupos cz, R heteroefclicos tales como la histidina, e sistema de78 incites, péptdsy roteinas amunoécidos se especifcan mediante ¢l sistema 0, 1 Fig. 3-4), basao en la configuacin abeoluta del 220 tar de tres carbonos sliceraldehido, una convencion propuesta por ail Fischer en 1881, scher sonocia Its grupos que rodean el tomo de carbono asimétrica del gliceraldehido pero tuvo que adivinar su canfigura- Cin aboot su redicign fue earecta, tal COm2 se fonfimé posteriomente por andi de faci de yeeeers sania fayos X), Para todos los compurstos quires os ext Teoisomeros que tienen una configuacin reacionada sae Con la del ticeraldehido se designan como 4 Tos i v2 tstereoismeros relacionados con el tgloealdehico se taiig—e nog designan come n. Los grupos funionales de la alana bn by Se hacen comer Con os de gliceralenico anes Anna snns aquellos que pueden interconvertirse mediante rescio- res eliza simples en un sto pao. Aste grupo car bolo dela -alanina ocupa in misma postin respect alcarbono qual que el grap aero del rlicerlde- io, puesto que un aldehide puede converse fici- mente Conidae) en un grupo caroxilo en in solo paso « Alton orig mediante una oxidacién. Histéricamente, las denomins FGURA 33 Eteeouomera los romioties (tos ote lames Lb ge tzaron para levorotatoro (que ire la (estmes ce oon orylae sana snimapnesespesans iz polarzada en el plano hacia la tamed) dextro Siumpuner enw anutsrwon (2 Doverncone ate. reavario (que gists us hac la derocba). ih embar Serra tetaninretu soak tyes ese ke ta retoecacia nan everson por ‘Sere lamin oe ponrcne (Dts eas conform decate Quese/Nuo necesria ls conveneién que ve muss enka isha id pope tra save ol sk tm wloa'gtums Figen 4 yan on Seas laghotee las fecispe cos Ext Wms ch poyesinG) im wpe an lw ecbagureadn aan. begins convene ce lacs, Tae pocoaam pac int pe lacy gem ener epetans Cees 8 is contract Wika hi aka Ne codnda hina cose eb Nee eee lees Oe Tremere oa Sond, ee peta na se etc eerste ce caniqcsneseananca ie Conve Se Peet re cun'ee al cocoms BS, queso letras griegas es ambiguo y se utiliza por ello la conven- utiliza en la nomenclatura sistemética de la quimica cain numérica. En aminodidos con cadena lateral vari-_gnginienyaue sesenbe oon mayor precain a config fmt, te cae cuitbcnn cber mirtnra's., "Seon ae ep measeaay col tan Ga Un coetn all continuacion de las letasgrcgas, La leucina tiene por (tase p19), tanto los carbonos di y d2 (véase la estructura en la Fig 25). a Para especificar la configuracién absoluta de los Los residuos aminoacidos de las proteinas son cuatro sustituyentes de los étomos de carbono asimétri- estereoisomeras L fos ae ha destraindo ura nomenclatwa especal Las Casi todos los. compuesto bogies con un centro oniguaconesabslutas de los antears sence yg qual se presenta a maraeza en una eon de a fons estereosGmerss, sa Ino lat. Los rescuos tminotcidos delay protenas son exchsivamente Ls. 500" 00" tai ‘ge yo tereoisomeros, Solo se han encontrado p-aminoscidos HOCH rec 0H ‘en unos pocos péptidos, generalmente pequefios, que 3,08 bon incluyen algunos péptidos de las paredes celulares bac- Glens -lceraaehido terianas y algunos antibioticos peptidicas. Es un hecho notable que todos los aminodclios de goo 00 las proteinas sean L-estereoisémeros. Cuando se farman titel te totin, compuestos quirales en reacciones quimmicas ordinarias, i i resultado es unw mezcla racémica de isémeros D yt, aoa ain Queson dfs de ditingury ls pr el quieo. Sin embargo, para los sistemas vivientes, los iscimeros v y L FIGURA 3:4 Relacionestriea de los esteresisimeros del slanina son tan diferentes como la mano derecha y la izquierda. con confguracin absoluta del y -gleraldeido. > estasomu- La formaci6n de subestructuras estables y repetidas en las de persecta los crboros estén alneados vertcamere con el las protefnas (Capftulo 4) requiere en general que los. tomo airs ene centr. Ls carbons de estas moléevasestinrume-_amminodcidos que las constituyen sean de una misma ‘aos emipezado con ls carbons aldehido ocaborio (ens), de 12 serie estereoquimica. Las céhulas son eapaces de sinte- 3y e ata a abso tl como se muesta Cuando x pretetan deel tizar especificamente los isémeros 1 de los aminoacids Ferma. el grupo R ce! sminado en ese caso grupo metlodelaae gracias a que los centros activos de los enaimas son. rin} est siempre debain del carbone a los -aminadcdoe sen lot ie asimgericos, lo que implica que las reacciones que cata. tienen € grape warino aa ieee lr o-ainaicidos os ae > Yam gean eatereoespectficas ‘en el atupe camino 8 cect<00- witn cine ate tune [ag eet eee | aot fee | eee HCH ACH ‘00 HCH a “| = g on tom ol FIGURA 3-5 Los 20 aminoScids eetindar de Ins protena, La tr rrulisesructurses muestan el esta ge fonizacdn qe predominn #| pH 70. Las partes no sombrendas son comune gaa todos ls aaa os las partes sonbresds en rojo son os rupos R.Aunave et gupo Los aminoacidos se pueden clasificarsegin su grupo R BI conocimiento de las propiedades quimicas de los aminodcidos esténdar es de vital importancia para la ‘coraprension dela bioquimica. E] tema se puede simpli- ficar agrupando los aminoscidos en cinco clases princi pales basadas en las propiedades de sus grupos R (Tabla 5-1), en especial su polaridad, o tendencia a intersc- clonar con el agua a pH biolégico (cerca de pH 7,0). La polaridad de los grupos R varia enormemente desde totalmente apolar o hidrofébico (insoluble en agua) @ altamente polar o hidrofilico (soluble en agua). Algunos: laminofecides son algo diffciles de caracterizar ono encar Jan perfectamente en ningtin grupo, en especial en los casos de glcina, histidine y cistefna. Su asignacién a uno u ofro grupo es, mas que absoluta, aproximada, Enla Figura 3-5 se mvesiran las estructuras de los 20 aminodcidos estdndar, y algunas de sus propiedades ‘se muestran en la Tabla 3-1. Dentro de cada clase exis- ‘ten gradaciones de polaridad, tamano y forma de los srupos R Rcd a itira so muestra sin carga, su pK, (wasn Taba 3) oa ‘que una traccén pequeta pero sgnfcatva ‘de esos grupos est car ‘da postiomente 4 9H 70. La forma prtorada dela Nt se rmuesr en porte superior el rico de sia 32. Grupos Rapolares alifaticos Los grupos R de esta clase de aminodcidos son apolares © hidrofbbicos. Las cadenas laterales de la alamina, valina, leucina ¢ isoleucina, tienden a agruparse entre sien las protefnas, estabilizando Jas estructuras protelcas a través de interacciones hidrofo- bicas. La glieina tiene la estructura més simple. Aunque se agrupa formalmente entre los aminodcidos apolares, su ‘muy pequetia cadena lateral no contribuye a efecto hidro- {ebico. La metionina, uno de los dos aminodcidos que contienen azufre, tiene un grupo titer apelar en su cade- na lateral. La profina tiene una cadena lateral alifética con luna estructura cictica distintiva. El grupo amino secunda- To (imino) de los residuos de prota tiene una conforma- ci6n rigida que reduce la flexbilidad estructural de las regiones polipeptidicas que contienen este aminodcido. Grupos R arométicos La fenilalanina, la tirosina y et ‘triptéfano, con sus cadenas laterales arométicas, son relativamente apolares (hidrofébicos). Todas ellas pue- den contribuir al efecto hidrofébico. El grupo hidroxilo de_ la tirosina puede formar puentes de hidrégeno y constitu| Una gran variedad de biomoléculas absorben luz a Tongitndes de onda caracteristicas, de la misma forma que el tript6fano absorbe luz a 280 nim (véase la Fig. 3-6), La medida de la absorciGn de la luz. mediante un espectrofotsmetro se utiliza para detectar e identifi- car moléculas y para calcular su concentracion en disolucién. La fraccién de la luz incidente absorbida por una disolucién a una longitud de onda determina- dda esté relacionada con el espesor de la capa absor- Dente (paso Optico) y con la concentracién de la especie absorbente (Fig.1). Estas dos relaciones se ‘combinan en la ey de Lambert-Beer, wheat Intensidad ‘de la uz transmtida, el cociente 17, (el inwerso del cociente en la férmula) es la transitan- ia, € es el coeliciente de absorcin malar (en unida- des de litros por mal-centimetro), ¢ es la concentra- én de la especie absorbente (en moles por lito) ¥ | ends oi earl os com sik | | | | CT te el paso éptico de la muestra que absorbe la luz (en ccentimetros). La ley de Lambert-Beer supone que la, luz incidente es paralela y monocromética (de una ‘inica longitud de onda) y que las moéculas de disol- vente y de soluto estén orientadas al azar. La expre- sion log(i/f) se denomina absorbaneia y se designa por. Es importante hacer notar que cada milimetro ssucesivo de paso éptico de la sohicién absorbente en. tuna cubeta de 1,0 cm no absorbe una cantidad cons- tante sino una fracci6n constante de la luz que incide en 61, No obstante, con una capa absorbente de cami- | 10 Optico Ajo, la absorbancia A es direciamente | proporcional 1 la concentracién del soluto absor bente, | El coeficiente de absorci6n molar varia con la naturaleza del compuesto absorbente, el disolvente, la longitud de onda, y también con el pH si la especie absorbente de luz esté en equilibrio con un estado de | lonizacién que tiene diferentes propiedades de absor- bancia. letansidas Intact FIGURA 1 Componentes picinals de un deta esha spectolotémetro. Ura fuente de lr emite cde, ‘rarsmitida fen un amplo expecta. A continacte, «| rmonocromadertaleccioray varsne Lz de) a longitue de ond determnada. Le We rmonocromade pasa 2 avés dela muestra situaéo en una cabeta ce pao doco ys | BBscrbanca de a muesta log l/s pro" pvconal a la concentacse dela especie bsorbente. Lalu transmits se mie rmedinte un detector ye un grupo funcioral importante en algunos eres. La ‘irosina y el triptfano son significativamente més polares (que la fenlalanina debido al grupo hidroxilo de la trasina ¥¥ al nitrégeno del anilloind6lico del triptofano. El triptofano y la trosina, y en mucho menor grado Ja fenilalanina, absorben la luz ultravioleta (Fig. 3-6; ‘yéase también el Recuadro 3-1). Esto explica la fuerte absorbancia de la luz caracteristica de la mayoria de las protefnas a una longitud de onda de 280 nm, propiedad aprovechada por los investigadores en la caracteriza~ ‘id de las protefnas, Grupos Rpolares sin carga Los grupos R de estos aminos- cidos son mas solubes en agua, ohdrficos, que los de FIGURA 3-6 Absorbncia dels ur ultraviolet polos eminaeldos sromiticos. Comparacion de los espectos de absorcin de luz dels amino arom tptéfano, eosin yfendalanina a pH 60. Los aminodcios eatin presents en canidades euimolres (10? m) en ‘andcones dértias La absercdn de a uz pore ittno es cuatro veces mayer gv a df trong una longi de ends de 280 em. Obsénese que el moma de sbeorarcis tanto para al plana coma or la teosna with cacano a una long de orca de 260 rem La Asotin de luz por la fentanina aneaimerte conibuye poco ts bropicadesespectoscépcas eas poteas, Jos aminodcidos apolares, debido a que contienen grupos funcionales que forman puentes de hidrégeno con el agua. En esta clase de aminosicidos se incluyen la seri- na, treonina, cisteina, asparagina y glutamina. La polaridad de la serina y treonina proviene de sus grupos hidroxiloy la dela asparagina y glutamina de sus grupos: Tipttane Absorbancis Taosina ‘ong donde (amee £ cs com Bs bh ie S FIGURA 3-7 Formacién reversible de un puete distr por oxda- clin de dos moléculs de clstena. os puerts duu ene rescucs| (os Cyseabizan in etuctra de muchas peatetas, ‘amido. La cisteina es un caso especial porque su polari- dad, aportada por el grupo sulfhidrilo, es muy discreta. La cistefna es un écido débil y puede establecer enlaces, de hidrégeno déblles eon el oxigeno o el nitrogen. Laasparagina y la glutamina son las amidas de otros dos aminoscidos que también se encuentran en las pro- teinas, aspartato y glutamato, respectivamente, a los. ue se hidrolizan fécilmente por dcido o base. La cistet na se oxida fécilmente formando un aminodcio diméri- co unido covalenterente llamado elstima, en el que dos ‘moléeulas 0 residuos de cisteina estén unidos a través de un enlace disulfuro (Pig. 9-7). Los residuos unidos por un enlace disulfuro son fuertemente hidrofobicos (@polares). Los enlaces disulfuro desempetian un papel especial en la estructura de muchas proteinas al formar tuniones covalentes entre partes de p. mol proteina 0 entre dos cadenas protect i eps ais poSieaits hid ixpiece és hidrofficas son aquellos que estén cargados posit va 0 negativamente. Las arninodcidos en los que los grupos R tienen una carga neta positiva a pH 7,0 son la Aisina, que tiene un grupo amino primazio adicional en Ja posicion ¢ de su cadena alifftica; la arginina, que tiene un grupo guanidinio cargado positivamente; y la Inistidina que contiene un grupo imidazolaromatico, Al ser el Gnico aminodcido comin que pose una cadens lateral ionizable con un pK, préximo ala neutralkda, la Fistidina tanto puede estar cargada positivamente (forma protonada) como no tener carga a pH 7,0. Los residuos de His facilitan muchas reacciones catalizadas por enzimas al servir de dadores/aceptores de protones Grupos Rcargados negativamente écidos) Los dos ami- nodcides que tienen grupos R con une canga neta nega liva a pH 7,0 son el aspartato y el glutamato, cada uno de los cuales tiene un segundo grupo carboxilo. Los aminodcidos no estindar tienen también importantes funciones ‘Ademas de los 20 aminodeidos estindar, las proteinas pueden contener residuos creados por modificacion de los residuos estandar ya incorporados a un polipéptido (Pig, 9-8a). Entre los aminodcidos no esténdar estén la 4-hidroxiprotina, que es un derivado de la protina y la G-hidroxilisina, derivada de la lisina. La primera se encuentra en la pared celular de plantas y ambas se encuentran en el coligeno, una proteina fibrosa del tj- do conjuntivo, La 6-N-metil-lisina es un constitayente 3.1 Aminoids 81 de la miosina, una protetna contréctil del misculo. Otro aminoseido no estdndar importante es el --earboxigha- ‘tamato que se encuentra en la proteina protrombina {que interviene en la coagulacién de la sangre, asi como en ciertas otras proteinas que unen Ca¥ como parte de ssu funcién bioldgica. Més compleja es la deamosina, ‘que es un derivado de cuatro residuos diferentes de Lys, {¥ que se encuentra en la protefna fibrosa elastina. La selenocisteina y la pirrolisina son dos casos especiales. Estos resicuos raros no son el resultado de ‘una modificacién postsintética, sino que san introduci- ddos durante la sintesis de proteinas gracias a una adap- tacién poco frecuente del cédigo genético descrito en el apftulo 27. La selenocistefna contiene selenio en lugar del azure de la cisteina. La selenocisteina, que de hecho proviene de la serina, se encuentra en sélo unas pocas proteinas conocidas. La pirrolisina se encuentra en un Jimitado némero de proteinas de varias arqueas metano- sgénicas (productoras de metano) y en una bacteria; desempeha su funcién en la biosintesis de metano. ‘Algunos de los residuos aminodcidos de una protes- na pueden ser modificados de forma transitoria para alterar la funcion de la proteina. La adicién de grupos fosforilo, metilo, acetilo, adenililo, ADP-ribosilo u otros ‘a aminoécidos especificos puede aumentar o disminuir la actividad de la proteina (Fig, 3-80). La fosforlacién, es una modificacion reguladora muy comin. La estrate- ia reguladora consistente en la modificaci6n covalente de proteinas se discute con mas detalle en el Capftulo 6 ‘Se han encontrado alrededor de otros 300 amminosci- las células. Tieren funciones diversas pero no for de protefnas, La ornitina y la citrulina (Fig. ‘merecen mencién especial porque son intermedia Tos clave (metabolitos) en la biosintesis de la arginina (Capitulo 22) y en el ciclo de la urea (Capitulo 18). Los aminodcdes pueden actuar coma dcidos y como bases Los grupos amino yearboxlo de os aminofcidos, junto ‘con los grupos R ionizables de algunos aminodcidos, actdan come feidos y bases débiles. Cuando un aminod- cido sin grupo R ionizable se disuelve en agua a pH reutro, se encuentra en solucén en forma de io dipo- lar, o zwitterion (en aleman “ion hibrido”), que puede actuar como Acido o como base (Pig. 3-9). Las sustan- las con esta naturaeza dual son anfteras y, a men do, se denominan anfolites, (de “electroltos anit ros"). Un c-aminodcide sencillo monoarminico y mono- carboxtico, tal como la alanina, es un acido diprtico cuando eats totalmente protonado; ene doe grupos ‘grupo —COOH y el grupo —NH;, que se pueden liberar protones: 4 aa) . tt —co0n 2 a-f-coo Le es coo" cop Ne Me mts 4 ° _ Los aminodcidos tienen curvas de ttulaci6n caractersticas La titulacién écido-base implica la adicién o eliminacién gradual de protones (Capftulo 2). La Figura 3-10 ‘muestra la curva de titulaciOn de la forma diprotica de la glicina, Los dos grupos ionizables de la glicina, el82 Aninads epi yroteas ei 0 ch-c1-c00- coo ola % Fostoserina 4 Noone a saicoy chery omc c00™ 0 fo-ti-g4-c00 re ee $l, ‘SHideoxilsina eee. i C-NMR O4 CHG C00 ob ok pongo oh 4 tee vmetins ae «00 j eno CH-COO™ ‘000 —Li+—c,cH-C00" ~ NHS : Corborightamete ete Meitorgining ae Hie Elf COO tao oh by wh soy acta ° nc=0-b—c4y—cH-cH-c00- ohn | Cos MSO —G-cOo- ma, Sobrocstena grat) 0F eH —Gc00" 3 om, ‘ome wQRetion rr ~ ? Rage Onse On OH © Adeitrosina Praline Haft-Cy—CHy—CHyCH-COO™ FIGURA 3-8 Aminodcidos no esténdar. (3) Algunas aminodccs no estindar encontrados en sroteas. La mayoria powenen de minodcidosestndar. (Observes a uso ermano de mimes 2 de letvas greg en 1s nombres e ets esvuctas prs ett Carlos tomes de carbone teas) Los grupos furcionals extra ovkdos 2 wavs de reacciones de modiicotn se muestian € ro. La desmesina se forma a pati de cur resides de Ls, oe ‘at esqulte crbenaot etn ombrendos evr sl) L2 Selencisteia y la pirlia en excepcones esos dos amines dos se aaden duante Ia sitesi protic rormal mediante una ‘roanstn alate expeilicde del ign gentica esdnder excita ene Capitulo 27, Arbos se encertran en un ndrere muy equero de proteras. () Modtiaconesrevesbes de aminase es inpticadas en a eguicén e actividd de proteins, La 08 forilacin esa mocticacéneoalenterequadora més hecurte (2) mitra y ctrolna, qe no 2 encuentran en proteins, sonnterme > Convencién Clave: Cuando se escribe la secuencia de un péptido, polipéptido o proteina, el extremo ami- nocterminal se coloca a la izquierds y el extremo car- boxilo-terminal a la derecha. La secu inquierda a derecha empezando por el no-terminal. Aunque la hidrOlisis de un enlace peptidico es una reaccidn exorgénica, so tiene lugar lentamente debido 4 sualta encraia de activacin (véase lap. 28). Bn con- secuencia, los enlaces peptidicas de las proteinas son ‘muy estables, con una vida media (t,) de alrededor de 7 afios en la mayoria de condiciones intraceluares Los peptidos pueden dstinguirse por su comportamiento de ionizacén Los peptides contienen tan solo un grupo amino y un grupo a-carboxilo libres, uno en cada extremo de la cadena (Pig. 9-15). Estos grupos se ionizan de la misma manera que lo hacen en los amninoscidos libres. Los grupos c-amino y a-carboxilo de todos los aminod- cides no terminales estin unidos covalentemente en forma de enlaces peplidcos, que no se jonzan y, por tanto, no contribuyer al comportamiento total aido-ba- se dels péptidos, No obstarte, los grupos R de algunos aminaficidos pueden jonizarse (Tabla 8-1), y contxibu- yen en un péptido a las propiedades acido-base globales de la molécula (Fig. 3-15). Por tanto, puede predecirse el comportamiento acido-base de un péptido a partir de sus gripes a-amino y a-carborilo libres y de la natura leza y mimero de sus grupos R ionzabies. ‘A igual que los aminoécidos libres, oe péptidos tienen curvas de titulaeion caracterisicas y pH isocléc- tricos (pl) caracteristicos en los que no sufren despla- zamiento en un campo eléctrico. Estas propiedades se aprovechan en algunas de las técnicas uillzadas para on 0 pony ae pene “Siri: tes ones FIGURA 3-14 B pentapépi serigictiresdalaileucna, 0 Ser-ly- TyrAlaLau © SOYAL Los pépidos se nombranerpezanco por ee du amino-terminal que, po convencin, a6 sia ly gids Los races pepiskos se muesvansomtreados es op pio y los grupos Renwoi. separar péptidos y protelnas, como veremos posterior. mente en este capitulo. Debe ponerse de relieve que el valor del pK, de un grupo R ionizable puede cambiar ‘algo cuando ‘un amminodcido se convierte en el residuo dde un péptido. La pérdida de carga en los grupos a-car- bosilo y a-amino, las interacciones con otros grupos R del péptido, y otras condiciones del entomo pueden afectar al pK, Los valores de pi, para los grupes R que ‘se muestran en la Tabla 3+] pueden ser una guia til para deducir ol intervalo de pH en que un determinado ‘grupo se jonizaré, pero no pueden aplicarse estricta- mente a los aminodcides que pasar 2 formar parte de un éptido, lipéptidos biolégicamente activos uma gran variedad de composicién ytamafio Noes posible generalizar acerca de las masas molecula- res de los péptidos y protefnas biolégicamente activos ‘en relacidn con su funcién. La longitud de los péptidos naturales varia entre dos smninodeidos ¥ muchos miles de residuos. incluso los péptidos més pequeiios pueden tener efectos bioléglcamente importantes. Considere poor ejemplo el dipéptido sintético comercial -aspar- fibofenilalanina met éster, un edulcorante artifical ‘mais conocido como aspartamo o NutraSweet. Ae Hcy Ge Gxnet~eH4-coo ont we oy ti ont fe te dotcom foo FIGURA 3-15 Alanutamigisina. Fsteteranétto tiene un ‘rupo e-amino libre, un grupe a- p13 Desoots det, se observa las xoteinasdstrudas ao largo delaciente de pH de acuerdo Con sus valores e FIGURA 3-20 Eatoque scldtrio. Ete tree separa las potlnas segin sus puntos seléctcos Se clac una mela de peoeinas sobre uaa de gl ae comiare un gradients de oH inmovitzade. Apicanéo un camgo ecco, as paras ean en ely se desplazan rasa scant un pH eauialeie a su Racuerde ave carp ala de ura proteins es roar vidad enzimatica), se determina independientemente Ia cantidad total de proteina y el cociente de los dos valores da la actividad especifca. La activided y la pro- {ena total generalmente dismtinuyen en cada paso. La actividad disminuye porque siempre se produce alguna Dérdida debido a inactivacidn oa interacciones no épti- mas con los materiales cromato con of rmoléculas de la disolucion. La proteina Porque el objetivo es elininar tanta pr dao no especifica como sea posible. En un paso de purificacién exitoso, la pérdida de proteina no especif- ca es mucho mayor que la perdida de actividad; por tanto, aun cuando la actividad total disminuye, la acti- vidad especifica aumente. Los datos se recogen Tinak mente on una tabla de purificacion similar ala Tabla 8.5. Generalmente se considera que una proteina ¢3 ‘Pura cuando pasos adiclonales de purficaciin no con- siguen aumentar su actividad especifica y euando slo se puede detectar una especie protelca (mediante elec- troforesis, por ejemplo) En el caso de protelnas que no sean enzimas se requieren otros métodos de cuantifeacin. Las protet- ras de transporte pueden determinarse por su unién a 1a molécula que transportan, y las hormonas y las toxi- zs por los efectos bioligicos que producen; por ejem- Plo, las hormonas de crecimiento estimulan el creci- rmiento de ciertas dlulas en eultvo, Algunas proteinas estructuraes representan una fraccion tan grande de la masa tisuar que pucden extraerve y purificarse fil mente sin necesidad de un ensayo funcional. Los meévo- ddos son tan variados como las propias proteinas. RESUMEN 3.3 Tabajar con proteinas Las proteinas se separan y purifican en base a dife- rencias en gus propiedades. Las proteinas se pueden pprecipitar selectivamente mediante cambios en el pH o en la temperatura y en especial mediante la adicién de iertas sales. Bxiste una amplia gama de métodos cro- ‘matogréficos que explota las diferencias de tamafo, 3.3Teabajarconproenas 95 Muesta ce prtena| Separacin de as proterasen lapreera dimers en ura tha deeieedante enfoaue iortbtneo 6 “Separacion de as proteus teniasegunda mens en ‘on gel ge palcriomide SOS pl decrecere FIGURA 3-21 Blecvoforecebidmenslonl 12 proteinase sean ‘mero mediante erioque selético en una fine tia de ga. A ont+ ruscn Se etiende el gel ornate sobre un eaguco 8 rancias ce avril alls ns renin en masa olacle lon Junta de proteins se repre oe este moco en as dos cransones. Cor ‘sta lécrica se pueden separary resoher miles de proteras. Ponder ‘ecortarae el gl as manchas individuals de cave poten © lent cars mediante espectomeiria ce mas (vane le Figs. 230 y 3-30. (fuente: Cortes de Ase! Mogk, de A. Magk eal, EMBO 1 186534 1998, Fig, 70 afinidad de union, carga y otras propiedades. Entre estos métodos se incluyen la cromatogralia de inter- cambio i6nico, de exclusion molecutar, te afinidad y la cromatografialiquida de alta resolucién, Laclectroforesis separa proteinas en base a su masa xy su carga. La electroforesis en gel con SDS y el enfoque Isoeléctrico se pueden utilizar por separado © combina- ‘dos para obtener una mejor resolucién, Todos los procedimientos de purificacion requierei lun método para cuantificar o distinguir la proteina de interés en presencia do otras proteinas. La purificacién96 Amino, péptiosy proteins FIGURA 3-22 Actividad frente a actividad expats Se puede us- ‘ara dlerenca entre estos do terns conseranco os recientes con eancis. Amos cntenen el mismo nine de carcass, pro candadesclrentes de cancas de ots eSleres Sse considera que Iss ceanicasrepesentan proteins, ambos recpietescontienen la msm tivo ortna representa rls caicas ras. No obstarie segundo reciente tere un actvgad expecta mayer debido 2 ase Ingenio rojas Sen ua raccén mucho mayor dle puede seguirse mediante et ensayo de la actividad specifica 3.4 Estructura de proteinas: estructura primaria La purificacidn de una proteina es gen solo el preludio de una diseecién biog de su estructura y funcién. :Qué es lo que hace que una proteina sea un enzima, otra una hormona, otra una hroteina estructural y otra un anticuerpo? {Como se Aiferencian quimicamente? Las diferencias més obvias son estructurales, ¥ es de estructura de proteinas de lo que hablaremos ahora. La estructura de moléculas grandes como las pro- teinas puede describirse segtin varios niveles de com- plejidad ordenados en una especie de jerarqufa concep- tual. Normalmente se definen cuatro niveles de estruc- (ura de las proteinas (Pig. 3-23). La estructara pri- ‘maria es una descripcion de todos los enlaces covalen- tes (prinoipalmonte enlaces peptidicos ¥ puentes disul- furo) que unen los aminodcidos de una cadena polipep- tidiea. Bl elemento més importante de lt estructura FIGURA 3-23 Nivaes de estructura de Ios protainae Ls ects primane conse © una secvencia de amnocdosuridos ene st 2 ands de eriaces pepiscos e inchiye les puantes suture que ext. politico resuitarte puede estar evolago en undoes de estretra secundaria ales coma une hbice a. La hice es una pate dels este ‘ura teins oe palipéeio pega, oct es.en# mismo una de lag abides ue funstuyen la estructura cuaternria de we roteine ultsubunidad, én este caso le hemoglobin. [Fuente PB 1D IHGA, Rd ington eal, J Mot Bot 22855), 1982, ice Reso primaria es la sacuencia de los residuos aminodcidos. La estructura secundaria se reflere a disposiciones uy estables de los residuos aminodeidos que dan lugar 4 patrones estructurales recurrentes. La estructura, terciaria describe todos los aspectos del plegamiento tridimensional de un polipéptido. Cuando una proteina, posee dos o mas subunidades polipeptidicas, su dispost- cién en el espacio se denomina estrnetura euaterna- ria. Nuestra exploracion de las protefnas incluira final mente las complejas maguinas proteicas compuestas ‘por docenas y hasta miles de subunidades. En lo que resta de capitulo nos concentraremos en la estructura, primaria; los niveles superiores de estructura se discu- ten en el Capitulo 4 Las diferencias en la estructura primaria pueden ser especialmente infortnativas, Cada protefna tiene un ndimero y secuencia caractertsticos de residuos aminog- cidos. Como veremos en el Capftulo 4, la estructura primaria de una protelna determina la forma en que se pliega en una estructura tridimensional tinica y ésta, a su vez, determina la funciGn de la proteina. Considess- rremos en primer higar datos erapirices sobre Ia estrecha, relacidn entre secuencia de amninodcidos y funcién pro- teica, para continuar deseribiendo e6mo se determina la secuencia de aminoécidos; finalmento, describiremos. los usos que se puede dar a esta informacion, La funcién de una proteina depende de su secuencia de aminoacidos tes; el ser humano tiene unos. ~20,000 san un miimero muy superior de protef- diferentes (mediante procesos geneticos descritos en la Parte 1 de este libro). En ambos eas0s, cada tipo de protefna tiene una secuencia de aminodcidos dnkea ue le confiere una estructura tridimensional particular. Esta estructura es la que a su vez le confiere una fun- cig tinica, Algunas observaciones sencillas dustran la impor: tancia de la estructura primaria, 0 la secuencia de ami- nofcidos de una proteina. Primero, tal coma ya heros visto, proteinas con funciones diferentes siempre tienen secuencias de aminodcidos diferentes. En segundo lugar, se han correlacionado miles de enfermedades enéticas humanas con la produceién de proteinas defectunsas. £2 defecto puede ir desile un tnico cambio en la secuencia de aminascidos (como en la anernia (Se bacteria Escherichia coli produce més de 3.000 structure interna structure tercaia Cadena poipetines Suis encamadasfacforme,descritaen el Capftulo 5) aa elminacion ce tuna parte mayor de la cadena plipeptdica (como en la truyora de casos de dstofia museuar de Duchenne una elminacion de Ura gran porcin del gen que codif- ‘ala proteina dstofna da gar ala produce de na proteina mas corae inactive). Finalmente, al comparar Proteina con fucioneseiniares do diferente especi fncontraros que ests protenas tienen a menido Seuencias de aminaiciossinaares, Rela, portato, evident, ia ma elacin eisente ene la estructara Primaria de una proteinay su funion ia sequela de ainoscidos de wa protetra gest fda abeolvtamente, es decir, es invarable pra una protetnaconcreta” No, es posible cierta flexi, Se faleala que entre el 20 ye % de las protenas ama: nat son pollmérfleas, quo presenian sccvencias de turinoscios varables entre la. poblacion. humana, Muchas de esias varaciones de secuencia no tienen ringin efecto, o muy poco, sobre la func de a ro- tein, Ademds, proteins que evan aeabo una func Similar en especies dstarves evoluiamente pueden difeirde manera mportanteenelamat goal yen la pecan de srinosioa ‘A pesar de que la secuencia de amindcidos puede vatiar‘consderablemente en algunas reglones de la tstructura primar sin afectar a a funn bile, a snavoria de protenas contienenregioneserciles que ton csencialen pera su funcon y cays secumncia 6 fncventra, por tao, consereada, Esta faccn de secuerca iia vara de proteina a protein, lo gue Complica la tare ce relaconarsecienysocon ta tridimensional estructura con fun antes de poder profundizar en este probiera, txaminar de qué forma se oie Ia infermacign sobre la secuencia Se ha determinado la secuencia de aminoécidos de millones de protenas _Dos importantes descubrimientos que tuvieron lugar en 1959 fueron de importancia crucial en la historia de la Diogusmica. En aquel ano James D. Watson y Francis Crick dedujeron la estructura en doble hélice del DNA ¥ propusieron la base estructural para explicar su precisa replcacién (Capitolo 8). Su propuestaaclaré la realidad molecular que estaba detrés de la dea de gen. En aquel mismo afto, Frederick Sanger resolvi6 la secuencia de amincécidos de las eadenas polipeptiicas de la hormo- na insulina (Fig. 3-24), sorprendiendo a muchos inves- tigacores que habian crefdo durante mucho tiempo que 1a determinacidn de la seeuencia de aminodcidos de un polipéptido seria una tarea sumamente diffe. Muy pronto result evidente que la secuerca de nuclestidos del DNA y la secuencia de aminodcidos de las proteinas estaban, dle atin modo, relacionadas. Tan sclo una écada ‘después de estos descubrimientos. se habia determina el c6digo genstico que relaciona la secucn cia nycleotidica del DNA con la secuencia de artinosci- dos de las moléculas proteicas (Capitulo 27). Las secueneias de aminodcidos de as prteinas se obtienen ahora més frocuentemente de manera indieeta a partir de las secuencias de DNA contenidas en bases de datos -genémicos. Sin embargo, uns serie de técnicas deriva das de los métodos tradicionales de secuenciacién de 3.4 Bstructura de proteias:estracur primara 7 polipéptides siguen ocupando un lugar importante en la Quimica de protefnas. A continuacién resumimos el método tradicional y mencionamos algunas de las técri- cas derivadas del mismo. La quimica de proteinas se enrquece con métodos dervadas dela secuenciacin clésica de polipéptidos ‘Los métodos utilizados en la década de 1950 por Fred Sanger para determinar la secuencia de la proteina insulina se resumen, de manera actualizada, en la Figura 3-25. Pocas protcinas se secuencian de esta forma hoy en dia, al menos si nos referimos a la totali- dad dela secuencia. Como se ha dicho antes, es posible predeci la secuencia de una proteina@ partir dela det sen que la codifia, y esta informacién esté disponible en las cada vez més completas bases de datos genri- cas. Sin embargo, estos protocolos tradicionales de secuenciacién han generado una rica gama de herra- ‘mientas bioquimicas, y en casi todos los pasos de la Figura 3-25 se emplean métodos que son ampliamente ulizados, a menuclo en contextos bien diferentes. Frederick Sanger 1918-2013 [Sources UP/Conbis-Betimarn } ‘Segiin el esquema tradicional de secuenciacion de proteinas grandes, se determinaba en primer hugar la identidad del residuo amino-terminal mediante marcaje. El grupo a-amino del extremo amino-terminal puede ‘marearse con 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (FDNB), clo- rruro de dansilo 0 cloruro de dabsilo (Fig. 8-26). EL proceso de secuenciacién quimico propiamente dicho se basa en el proceso en dos fases desarrollado por Pehr Edman (Fig. 3-27). Elmétodo de la degra- dacién de Edman, marca y elimina sdlo el residuo amino-terminal de un péptido, dejando el resto de enia- ces peptidicos intactos, Se hace reaccionar el péptido con ferilisotiocianato en condiciones alealinas suaves, Cotas 14ficrvendfaasrra.enen—coo- cota rsirovaytbosvenyrdegoreyrngcoo- FIGURA 3-24 Seco de mics de iS e Genco orcs ens pr ee as as Cena) des rin nt as ara ce perc y cca oar Slave a any (tates98 Aminosdos pptiosy proteins Jo que convierve el aminodeido amino-terminal en un aducto feniltiocarbamotlo (PTC). El enlace peptidico contiguo al aducto de PTC se rompe a continuacién ‘mediante reaccin en dcido triuoroacético anhidro, (que conileva la eliminacién del aminogcido amino-ter- ‘minal en forma de un derivado anilinotiazolinona. El aminodcido modificado se extrae con disolventes orgé- nicos, se convierte en un derivado més estable, feniltio- Nidantoina, mediante tratamiento con una disolucion acuosa de cido, y, finalmente, se identifica. El uso de reacciones secuenciales Nevadas a cabo primero on condiciones basicas y a continuacién en condiciones acidicas proporeiona un control sabre todo el proceso ada una de las reacclones del amminodicido amino-ter- ‘minal puede completarse practicamente en su totalidad sin afectar a ninguno de los demés enlaces del péptido. El proceso se repite hasta, normalmente, la identifica- ‘i6n de unos 40 residuos secuenciales de aminoscido. Las reacciones de la degradacién’de Edman se han automatizado. Para determinar la secuencia de proteinas grandes, Jos primeros investigadores que desarrollaron protoco- Jos de secuenciacidn tuvieron que disetar métodos para ‘liminar los enlaces disulfuro y para trocear las protef- zs en fragmentos mAs pequefios de forma precisa. En Ja Figura 3-28 se esquematizan dos métodos utilizados ppara romper enlaces disulfuro de manera irreversible. ‘Los enaimas denominados proteasas catalizan la rotu- ra hidrolitica de los enlaces peptidicos. Algunas protea- ‘a5 cortan solamente los enlaces pepifdicos adyacentes 2 residuos aminoscidos especificos (Tabla _ ‘tanto, fragmentan una cadena poli; predecible y reproducible, Varios reactivos”q ‘ambien corian los enlaces peptidicos adyacentes a resi ‘dus especificos. Entre las proteasas, el enzima digest vo tripsina cataliza la hidrélisis de tan s6lo aquellos enlaces peptidicos en los que el grupo carboxilo esta proporcionado por un residuo de Lys o Arg, indepen- ddientemente de la longitud o secuencia de aminoscidos. de la cadena. Un polipéptido con tres residuos de Lys y/o Arg dard lugar normalmente a cuatro péptidos més Pequefos al ser cortado por la tripsina. Ademés, todos. excepto uno tendrén una Lys 0 Arg como carboxilo-er- ‘minal. La eleceién de un reactivo para romper la protef- na en péptidos més pequefios puede beneficiarse de la sdeterminacién previa de la composicién de aminoscidos de la protein entera tratada con dcido para reducizla a sus aminodcidos constituyentes. La tripsina sblo seria de utilidad en protefnas con un niimero significativo de residuos Lys o Arg. En el método clésico de secuenciacién se procede- via a cortar la proveina dos veces, usando cada vez una proteasa 0 un reactivo quimico diferentes, de manera ‘gue los extremos de los fragments fueran diferentes, tH on 0, To FONG Cru de drailo Proton 6% Sedetermns ol amino: terminal (que reaccions con FDNB).tneta otc hy ura lin ie Sedeterminael contenido senaminoscios medarte Idris cid). Se {eleccionan los centvos peraromoe (aiger) 2 Sceuerie segue Presence reskuos ‘ans eneos, sseareteer = f— Feeaoseny ncn 1, DOGGANYLVLLAGPTRSGTMR. 2. AQGAFNPSCGVIQHAWIKMWILAAGTE 53 GGPVIATYEQOGSTSRYAPK 4 QGYASULAIEFTR rer ari seta erin con rae ‘Snel pune ace epi), Seordenan os tos péstos mediante slapamientos con secvencas de ppldes ables or digestion de {n protencon un reactive eferente como eo ‘wemr de candgeno ole qumetripina. FIGURA 3-25 Secuenciacion directa de protenas. Los proceiienios 29u dscrits son les desaraldos pr Fred Sanger pra secvenci 2 Instn. y han sido usados desputs para maples crotenas. (FON es Muor-24-ntrabencens (vase el tro yla Fe 326) Se purificarfan y secuenciarfan ambas colecciones de {ragmentos ¥ se podria determinar el orden en que cada {fragmento aparece en la proteina original examinando Jas solapamientos de secuencia entre los dos conjuntos de fragmentos. onsiderando incluso que ya no se utilizan para secuenciar proteinas enteras, los métodos tradicionales de secuenciaciGn son todavia utiles en el laboratorio. La secuerciacién de algunos aminodeidos desde el extre- loro de dabsto FFIGURA 3-26 Reactivos usados para la modifiacn del grupo a-umine termina