Karen L. Dopps Joun W. Austin Clostridium botulinum INTRODUCCION Desde el primer reconocimiento del botulismo como una enfermedad alimentaria a finales de los afios 1800 (36), ha sido una preocupacién importante tanto para los elaboradores de alimentos como también para los consumidores. Actual- ‘mente, se admiten cuatro clases de botulismo humano. El bo- tulismo producido por alimentos es originado por el consu- mo de alimentos contaminadas $BBEipretormads El botulismo infant ‘por la ingestin de esporas viables que germinan, colonizan, y Pproducen neurotoxina en el tracto intestinal de los nifios de menos de | afio de edad. El botulismo infantil fue diagnosti- ‘cado por primera vez en 1976 y en la actualidad es la forma de botulismo més frecuente en los Estados Unidos (22). El botulismo de las heridas resulta de Ja infeccién de una herida ‘con esporas de Clostridium botulinum, que crecen y produ cen neurotoxina en la herida. Si bien el botulismo de las he- ridas es raro, cada vez esti siendo més relacionado con el uso de agentes intravenosos (36a). La cuarta clase, no clasi- ficada, incluye casos de origen desconocido y casos adultos que se parecen al botulismo infantil. El botulismo animal, que aqui no seré revisado, afecta al ganado vacuno y a las aves de todo el mundo y se presenta en menor grado en las ‘ovejas, en los caballos, en los animales de zoo, y en otros varios animales (20). ‘Como consecuencia de la gravedad de Ia enfermedad, el botulismo es denunciado extensivamente, En los Estados ‘Unidos, en 1994, hubo 42 casos de botulismo producido por alimentos, 86 casos de botulismo infantil, y 11 casos de bo- tulismo de las heridas, todos ellos sin muertes (36a). En Ca- nada, en 1995, hubo 13 casos de botulismo transmitido por alimentos (que supusieron siete brotes), 1 caso de botulismo infantil, y ningiin caso de botulismo de las heridas (11a). CARACTERISTICAS DE C. BOTULINUM. Clasificacién ‘e C. botulinum es una bacteria anaerébica, de forma bacilar, espordgena (36). Al principio, todos tos organismos de los que se sabfa que produefan neurotoxina botulfnica eran incluidos en esta. ie (36). Enisten siete tipos de C. botulinum, a a dad serolégica de la neuro! tipos C y D producen el botulismo en los animales. Hasta ahora, no existe prueba directa alguna que relacione el tipo G con enfermedad. LLaespecie también se divide en cuatro grupos basados en diferencias fisiolégicas (Tabla 15.1) (36), como sigue: grupo I, todas las cepas del tipo A y las cepas proteoliticas de los tipos B y F; grupo II, todas las cepas del tipo Ey las cepas no proteoliticas de los tipos B y F; grupo ITT, cepas de los tipos Cy Dj y grupo IV, C. botulinum del tipo G, para el cual ha sido propuesta la denominacién nueva de C. argentinense (94). Esta agrupacién concuerda con los resultados de los estudios de la homologfa del DNA y con los estudios de 1a secuencia de genes del RNAr de 16S y de 23S (44-46, 74) ue ponen de manifiesto un grado elevado de parentesco en tre las cepas de cada grupo pero poco parentesco de los gru- pos entre sf (36). Las cepas del grupo I son proteoliticas y estén tipificadas por las cepas que producen neurotoxina de tipo A (36). La existiendo cre- - Tipicamente, en los cultivos son idos niveles elevados de neurotoxina (10° DLs ra~ ‘én/m! [1 DLs es la cantidad de neurotoxina necesaria para 301 Escaneado con CamScanner302 Microbiologia de tos alimentos ‘Tabla 15.1 Agrupamiento y caracterfsticas de las cepas de C. botulinurn*, Resultado de grupo: Caracteristica a Mm Ww Tipo(s) de neurotoxina GD G Temperatura de creciraiento (°C) Minima 1s ND Maxima . 40 37 pH mfnimo de crecimiento ND ND Cone. inhibidora de NaCl (%) ND ND ‘a, minima de crecimiento ND ND Diooe de las esporas (min) 01-09 08-1512 Daare de las esporas (min) ND ND * De la referencia 36. ND, no determinado(e) en 4 dias al 50% de los ratones inyectados)). Las minutos (el va- ar el 90% de la hibir el creci- ioc concen- jidad de agua (a,) nen una ycrece- . Las esporas estin ‘cepas del grupo II son or a'5,0ypor las concen- © por una a, por debajo organismos carecen de de los cultivos general- ipsina, enzima que activa neurotoxina. El grupo IIT incluye las cepas de los tipos C y D, que no licados en el botulismo humano pero producen bo ‘Sito Cosgenenen, han sido estudiadas con menor detalle. Estas cepas son no proteoliticas y crecen dpti- 'y solamente a temperaturas tan bajas como Las cepas del grupo I roducen neurotoxina de tipo G,crecen ipimacne a ern tuna temperatura mf- nima de crecimiento vez se observan esporas ienen ia medianamente baja, con valo- rmorresiste Estos cuatro grupos, més las cepas de C. butyricum y de C. barati que producen neurotoxin: grupos genémicos diferentes q (26). En este capitulo, el interés se centrard en los grupos Ty Il, ya que incluyen las cepas involucradas més frecuentemente en la enfermedad humana. Tolerancia a los métodos de conservacién La temperatura, el pH, la ay los conservadores afiadidos, y la presencia de otros microorga- rismos son los factores principales que controlan el creci- miento de C. botulinum en los alimentos. Hist6ricamente, las Investigaciones han fijado los Ifmites méximo y/o minimo de estos pardmetros que controlan el crecimiento de C. botuli- num (Tabla 15.1). Estos factores rara vez actéan indepen- dientemente; generalmente actéan al unfsono, teniendo con frecuencia efectos sinérgicos. Temperatura baja El almacenaje refrigerado se usa para impedir o para inhi- bir el crecimiento de C. botulinum. Han sido determinadas las temperaturas minimas que permiten el crecimiento, en gran jar el impacto de la refrigeracin a modo de ites ms bajos determinados son| ara el grupo 1 y3,3°C para el grupo II (36). Sin embargo, estos Limites son aplicables a pocas cepas y dependen de condicio- nes de crecimiento por otra parte éptimos. Prescindiendo de Ja temperatura minima de crecimiento real, en los organis- mos de los grupos I y Il, la produccién de neurotoxina gene- ralmente requiere semanas en los limites de temperatura més bajos. Las temperaturas de crecimiento éptimo estén entre 38) 40°C ‘para los organismos del grupo y entr para los organismos del grupo IL Inactivacién térmica El tratamiento térmico se usa para inactivar las esporas de C. botulinum y C. botulinum del grupo I, que son muy termorresistentes, son Jos organismos blanco de la mayorfa de los tratamientos tér- ‘micos. Los valores D varfan considerablemente en las cepas Escaneado con CamScannerClostridium botulinum de C. botulinum (49). Los valores D dependen de cémo son roducidas y tratadas las esporas, del medio de calentamien- to y del sistema de recuperacién (49). Las esporas de los ti- pos A y B son las mAs termorresistentes, teniendo valores La industria del enlatado ‘como patr6n para calcular los tratamientos térmicos. El valor z (el cambio de temperatura necesario para originar un cambio de 10 veces en el valor ‘D) para la mayorfa de las cepas resistentes es aproximadamente 10°C, valor que también ha sido adoptado como patrén, A pesar de las variaciones en los valores D y z, la adopcién de un tratamiento de 12 D como el tratamiento térmico mfnimo aplicado a los alimentos comerciales enlatados de acidez baja por la industria del enlatado, ha garantizado la producein de productos dignos de confianza (37), Las cepas del grupo II son considerablemente menos ter- morresistentes. que las del grupo I, pero la supervivencia de estas esporas en los productos pasteutiza- dos refrgerados es preocupante debido ass eapucad park ). Los valores Dyrrc en las ipo E en tampén de fosfato neutro general. ‘mente se encuentran en el intervalo de 0,2 a 0,1 min. En las cepas del tipo E, han sido indicados valores que varfan desde 0,15 hasta mas de 4,90 min, que dependen del menstruo de calentamiento, y del medio de recuperacién. Han sido publi- cadas varias reglamentaciones y pautas para la produccién exenta de peligro, para la distribucién, y para la venta de alimentos refrigerados de durabilidad prolongada (60). El ‘) fo que especifican que el envasado al vacio y el trata- miento térmico deben garantizar la destruceién de los orga- nismos vegetativos y reducir de modo importante el nime- to de los organismos psicrotrofos de C. botulinum. Las recomendaciones americanas de la Comisién Nacional Con- sultiva sobre Criterios Microbiol6gicos para los Alimentos icluyen investigaciones con aliment pH El pH mfnimo que permite el crecimiento dle C. botulinum del grupo para el grupo II, es aproximadament Deeste modo, muchas frutas y hortalizas son suficientemen- te Geidas para inhibir a C. botulinum mediante su pH solo, mientras que para conservar otros productos se usan acidulantes, El sustrato, la temperatura, Ia naturaleza del agen- (*)N.delT. Comisién Consultiva del Vacto, te acidulante, la presencia de conservadores, la ay, y el Ey, son todos los factores que influyen en la acidotolerancia de C. botulinum. Microorganismos acidotolerantes tales como las levaduras y los mohos pueden crecer en los productos Acidos y elevar el pH en su proximidad inmediata hasta un nivel que permite el crecimiento de C. botulinum. Este tam- bién es capaz de crecer en algunos alimentos acidificados si existe una equilibracién del pH excesivamente lenta, Salya, La sal (NaCl) es uno de Jos factores més importantes que controlan el crecimiento de C. botulinum en los alimentos. Actia principalmente reduciendo la a,. Consiguientemente, su concentracién en la fase acuosa, lamada concentracién de la salmuera (% de la salmuera = % de NaCl x 100/% de H,0 + % de NaCl), es decisiva. Las concentraciones de la salmuera limitantes del crecimiento son aproximadamente el 10% para el grupo I y el 5% para el grupo Il en condiciones por otra parte dptimas. Estas concentraciones se correspon- den perfectamente con la aw limitante de 0,94 para el grupo Ty de 0,97 para el grupo II en alimentos en los que el NaCles el principal agente rebajador de laa, El soluto utilizado para controlar Ia a,, puede influir en estos Ifmites. Generalmente, ¢l NaCl, el KCI, la glucosa, y la sacarosa manifiestan efectos parecidos, mientras que el glicerol permite el crecimiento en ay mas baja (37). La a, limitante puede ser elevada de modo importante por otros factores tales como la acidez aumenta- da ol uso de conservadores. Atmésfera y E, El envasado en atmésfera modificada (MAP) esta siendo utilizado cada vez mas para prolongar la vida comercial y para mejorar la calidad de los alimentos. El MAP ha sido una preocupacién por causa de las condiciones que podrian fa- vorecer el crecimiento de C. botulinum. Concretamente, la incidencia elevada de esporas del tipo E en el pescado (21) ha convertido en una preocupacién la inocuidad del pescado MAP. C. botulinum es capaz.de crecer y producit neurotoxina en el pescado MAP y, dependiendo de las condiciones, la neurotoxina puede hallarse presente antes de que el pescado se considere alterado (34, 71). Si bien se supone habitual- ‘mente que C. botulinum no es capaz.de crecer en los alimentos expuestos al O2, el Ex dé la mayoria de tales alimentos suele ser lo suficientemente bajo como para permiti su crecimien- 10 49). Las atmésferas iniciales que contenfan un 20% de O no retardaron la produceién de neurotoxina por C. botuli- ‘num en carne de cerdo inoculada comparada con muestras envasadas con el 100% de Nz, y algunas muestras téxicas contenfan un 15% de O; residual (56). El CO; se usa en el MAP para impedir la alteracién y para inhibir el crecimiento de microorganismos patégenos, pero el CO, puede estimular el crecimiento de C, botulinum (33). Los niveles iniciales del 15 al 30% de CO, no inhibieron a C. botulinum en la came Escaneado con CamScanner304 Microbiologia de los alimentos de cerdo inoculada; (57). Antes de usar las diferentes atmésfe- as, se debe investigar su seguridad con respecto a C. botuli- un C. botulinum crece dptimamente a un Byde=350 mV pero el correspondiente al crecimiento puede comenzat en ei tervalo de +30 a +250 mV (49). La presencia de otros facto. res inhibidores rebaja este limite superior. Una vez ha co. ‘menzado el crecimiento, el E, desciende répidamente, Conservadores En los productos cérnicos curados, el nitrito tiene varias funciones: una funcién importante cs la inkibicién de a bien los efectos sobre el color y el sabor son Consecuencias organolépticas importantes. Se desconoce el mecanismo exacto de la inhibicién botulfnica por el nit Sueficacia de alimentos curados el nitrito es agotado, y la rapidez del ago- tamiento depende de la formulacién del I producto, del pH, y del tiempo y de la temperatura durante el tratamiento y ai- macengje. Sin embargo, una contribucién importante del nitrito a la inhibicién de C. botulinum continda atin cuando ito ya no es detectable (37). El nitrito reacciona con varios constituyentes celulares y parece ser que inhibe a C. botulinum mediante mas de un mecanismo, que incluye la reaccién con protefnas ferrosulfuradas esenciales para in- hibir los sistemas productores de energia en el interior de la élula (49). La reaccién del nitrito, o del éxido nitrico, con Jas aminas secundarias existentes en las carnes para produ- cir nitrosaminas, algunas de las cuales son cancerfgenas, ha conducido a reglamentaciones que limitan la cantidad de nitrito usado. Los sorbatos, los parabenos, la nisina, los antioxidantes fendlicos, los polifosfatos, los ascorbatos, el EDTA, el ‘metabisulfito, los maleatos y fumaratos n-monoalqullicos, y Jos lactatos, también son activos contra i . El uso de humo natural o liquid ejerce en el peseado pero parece ficante en las carnes. ser que ej un efecto insigi Otros microorganismos El crecimiento de otros microorganismos en los alimentos jerce un efecto muy importante sobre el crecimiento de C. botulinuns (37, 49). Las levaduras y los mohos acidotole- antes pueden convertir al medio en més favorable para el crecimiento de C. botulinum (43). Otros microorganismos Pueden inhibir a C. botulinum roducir sustancias inhibidora: Las bacterias acidols ies: ‘ces de inhibirel crecimiento de C. botulinum en los productos | <@rmiGOSVen gran parte por reducir el pH pero también me- dante la produccién Ge bacterocinas (4, 64,67). Ea os Estados Unidos, el uso de bacterias acidoldcticas y un carbo- hhidrato fermentescible (proceso de Wisconsin) esté permiti- do para producir tocino entreverado con un nivel reducido dlenitrto (95). El erecimiento de otros microorganismos tam bién puede proteger a los consumidores por originarse una alteraci6n que determinarfa que fuese menos probable que se consumiese un producto t6xico. Inactivacién mediante irradiacién Es probable que las esporas de C. botulinum sean las es- poras de interés para la salud piiblica més resistentes a la radiacién. Los valores D (dosis de irradiacién necesarias para inactivar el 90% de la poblaciGn) de las cepas del grupo Ta temperaturas desde ~50 a -10°C estin comprendidos entre 2,0 y 4,5 kGy en los tampones y en los alimentos neutros (49). Las esporas del tipo E son s6lo ligeramente més sensi- bles, teniondo valores D comprendidos entre I y 2 kGy. La radappertizacién esté ideada para reducir en 12 ciclos logaritmicos el nimero de esporas viables de C. botulinum mis resistente a la radiacién, Cualquier tratamiento previo, Por ejemplo la presencia de O, el cambio de la temperatura de inradiacién, y los medios de irradiacién y recuperacién, influyen en los valores D de las esporas. En general, las es. poras son mis sensibles en Ia presencia de O, o de conser- antes y a temperaturas superiores a 20°C RESERVORIOS Existencia de C. botulinum en el medio. ambiente Comoguiera que la contaminacién de los alimentos de- pende en gran parte de la incidencia de C. botulinum en el ‘medio ambiente, en todo el mundo han sido realizadas mu- chas investigaciones sobre las esporas de C. botulinum. Los resultados demuestran que las esporas de C. botulinum se hallan presentes habitualmente en las tierras y en los sedi ‘Mentos, pero sus niimeros y sus tipos varfan en funcién de la ubicacién (Tabla 15.2) (20). En América del Norte, las esporas de C. botulinum estén distribuidas por todas partes, pero la carga de esporas varia considerablemente, de igual modo que varia el tipo predomi hante. En los Estados Unidos, las tierras al este de la eleva- cin de las Montatias Rocosas generalmente contienen espo- ras del tipo E de C. botulinum, Las esporas del tipo A predominan en el déste de los Estados Unidos. En general, el tipo E se encuentra rara vez y solamente en lugares himedos © lluviosos, Sin embargo, ei tipo E predomina, y se encuen tran niimeros elevados en la zona que rodea los Grandes La- £05, especialmente en tomo a Bahia Verde de Lago Michigan, y en las zonas costeras de Washington y Alaska. La distribu. Cién de los tipos en la costa del Pacifico cambia con la alti- Escaneado con CamScannerClostridium botulinum 305 Tabla 15.2 _Incidencia de C. botulinum en tieras y sedimentos* Tamato —-Muestras qi i ipo (% detipos identifica ee dela positivas MPN ital sat cat muestra (g) — % he A BO CD E F Estados Unidos Orientales, terra 10 c— fie ee Bahia Verde, sedimento 1 7 1.280 0 0 0 100 0 i 1 4 660 0 0 0 100 ° 4 50 6 Geo 100 ° ° 0 retaia, costa, sedimento 2 4 1B 30 100 ° Holande, ers 5 2500 2 46 2 0 ra 8 28 8 Je, Mar Caspo, sedinento 2 7 an) 8 0 92 ° Sinkang, Cure, dea 10 7 2500047 2 9 2 0 Hokkaido, terra 5-10 4 > 4 0 o wai fon se eis Fo Ors ee Bri era 5 35 a6 852 7 2» ° 7 Paraguay, era 5 24 1s ° 4 ° 1 fica del Sut, terra 30 3 1 0 100 0 ° 0 Tailandia, sedimento 10 3 eae 0 3 7 0 Nueva Zelanda, sedimento 20 35 4 0 0100 o 0 * De ta referencia 20. MPN, ndmero més probable. tud; al sur de os 36°N, los tipos predominantes cambian del | En el hemisferio meridional, han sido realizados me- EalAyalB. En Europa, los resultados de las investigaciones demues~ tran que el tipo B predomina en los ambientes terrestres de Gran Bretaita, Irlanda, Islandia, Dinamarca, y Suiza y en los ambientes acusticos del Reino Unido. Los brotes de enfer- medad también confirman su predominio en Espafia, Portu- gal, Italia, Francia, Bélgica, Alemania, Polonia, Hungria y en las antiguas Checoslovaquia y Yugoslavia. La mayorfa de Jas cepas europeas del tipo B son no proteoliticas. El tipo B es el serotipo predominante en otros ambientes acuéticos, encontrandose los nimeros mds elevados en las aguas escan- dinavas, particularmente en el Sound y Kattegat, entre Dina ‘marca y Suecia, En la antigua URSS, también predominan las esporas del tipo E excepto en la zona central, donde pre- dominan las esporas del tipo B. ‘Los estudios de Asia indican nimeros més bajos, con las ‘excepciones de una incidencia elevada de las esporas del tipo E en tomo al Mar Caspio y de una incidencia elevada de todos los tipos en el distrito de Sinkiang de China, En Japén, a incidencia de las esporas del tipo Es elevada en las zonas septentrionales, mientras que el tipo C predomina en otras zonas. En las zonas tropicales de Asia, los tipos Cy D susti- tuyen al tipo E como tipo predominante en los ambientes acusticos, nos estudios. Las esporas del tipo A predominan en las tierras de Brasil y Argentina, pero I6s tipos B, C, E, y G también se hallan presentes. En Paraguay cl tipo de espo- za predominante fue el F, seguido de los tipos A y C. En Africa, han sido realizados pocos estudios, pero uno reali zado después de un brote de botulismo por el tipo A en- contré esporas del tipo C en la tierra de Kenia, En Africa del Sur, se encontraron esporas de! tipo B en Ia tierra, mientras que en el sedimento se encontraron esporas del tipo D. En Indonesia, predominan los tipos C y D, pero también han sido identificados los tipos A, B, y E. En ‘Australia y Nueva Zelanda, la incidencia ambiental es muy baja, encontréndose esporas tanto del tipo A como del tipo B. En resumen las esporas del tipo A predominan en tas tierras del oeste de los Estados Unidos, en el Reino Uni- do, y en gran parte de la Europa continental. Casi todas las cepas americanas del tipo B son proteoliticas, mien- tras que las cepas europeas son no proteoliticas. El tipo E predomina en las regiones septentrionales y en la mayor parte de las regiones acuaticas templadas y en sus entornos. LLos tipos C y D se encuentran més frecuentemente en los ambientes més célidos. Escaneado con CamScanner306 ___ Microbiologia de los alimentos Tabla 15.3 Incidencia de esporas de C, botulinum en tos alimentos*. Tamano dela Muestras Tipots) Producto Origen ‘muestra (g) _pasitivas % + MPNAg identificado(s) ‘Trozos de pescado blanco eviscerado Grandes Lagos 10 2 14 EC Lenguado congelado envasado al vacio Océano Atlintico 15 10 70 E Pescado de roca adobado California 10 100 2.400 AE Salmén Alaska 24.36 100 190 rN Pescado envasado al vacto Viking Bank 2 6 EB ‘Salmén shumado Dinamarca 20 2 0,9 jum) y produ- cen esporas de centrales a terminales, elipsoidales 0 cilindri- ‘cas que no distienden los esporangios (12). Estas especies de Bacillus esporulan fécilmente después de 2 a 3 dias en la mayoria de los medios, y B. cereus y B. thuringiensis pier- den su movilidad durante las primeras fases de la esporula- cién, Las cuatro especies pueden ser diferenciadas utilizan- do los criterios de la Tabla 17.1, RESERVORIOS B. cereus est muy difundido en la naturaleza, aisléndose frecuentement crecimiento (32). A partir de es ifunde facilmente a ‘Mediante medio natural ) Sinota Caos re ada, le difundir después a otros alimentos, por ¥ (32). Los 343 Escaneado con CamScanner344 _" Microbiologia de los alimentos ‘Tabla 17.4 para Ia diferenciacién de las cuatro especies de Bacillus emparentadas ccercanamente. Inclusion Morfologta de Sensibilidad eristalina Expecie las colonias —Hemélisis. —-Movilidad~—apenicilina paraesporal B. cereus Blanca + + Z az B.anthracis ‘Blanca - + : B. thuringiensis Blanca/gtis + + = + B.mycoldes —_Rizoide w ei : problemas en la leche y en los productos lécteos son origina~ dos por B. cereus que se propaga desde la tierra y la hierba a la ubre de las vacas y a la leche fresca. Gracias a la esporulacién, las esporas de B. cereus sobreviven a la pasteurizacién y, tras germinaci6n, las células estén libres de competicién con otras células vegetativas (5). Segtin la bi- bliografia clésica (12), B. cereus es incapaz de crecer a tem- peraturas por debajo de 10°C y no es capaz de crecer nien la Teche ni en los productos lécteos conservados a temperatures comprendidas entre 4 y 8°C. Sin embargo, las cepas psicrotrofas que se han originado son capaces de crecer a ‘emperaturas tan bajas como las comprendidas entre 4 y 6°C (17, 20, 44). Ademés del arroz y las especias, los productos licteos se hallan entre los alimentos contaminados més fre~ ‘cuentemente con B. cereus. Se dice que la especie B. thuringiensis, emparentada ‘cercanamente, produce enterotoxina (13, 35) y se ha com- probado que produce enfermedad transmitida por alimentos ‘en voluntarios humanos (35). Esta caracteristica se puede convertir en un problema grave, ya que el rociado de este ‘organismo para proteger las cosechas contra los ataques de los insectos ha pasado a ser habitual en varios paises. Re~ cientemente se informé de que B. thuringiensis habia origi- nado un brote de enfermedad transmitida por alimentos (31), ‘embargo, puesto que las técnicas usadas normalmente para la confirmacién de B. cereus no diferenciarfan los dos corganismos (Tabla 17.1), es posible que se hayan dado bro- tes que no hayan sido identificados. Para garantizar el rocia- do sin peligro con B. thuringiensis, el organismo que se utili- ce debe ser incapaz de producir enterotoxina(s). BROTES PRODUCIDOS POR ALIMENTOS. ‘Segtin ya ha sido apuntado, el ntimero de brotes de enfer- ‘medad alimentaria debidos a B. cereus esté sumramente subes- timado tanto en la bibliografia como en las estadisticas oficia~ les. La raz6n principal de esto es la duracién relativamente ‘corta de ambos tipos de enfermedades (generalmente <24 h); asimismo, la enfermedad alimentaria producida por la leche puede afectar s6lo a unas pocas personas en muchas viviendas xy de este modo podria no ser considerada un brote. Otro factor puede ser que muchos bebedores de leche estén protegidos parcialmente contra este tipo de enfermedad alimentaria gra- jas al 5: Haciael final de su vida comer- cial, la leche contiene con frecuencia suficientes células de B. cereus para provocar enfermedad alimentaria, dado que las. ‘cepas producen una gran cantidad de enterotoxina. Sin embar~ 0, B. cereus es capaz en sabores desagradables que podrfan limitar el consumo del producto que contiene grandes cantidades del organismo. El tipo dominante de enfermedad producida por B. cereus es diferente de un pais a otro. En Japén, el tipo entérico es denunciado con una frecuencia aproximadamente 10 veces mayor que el tipo diarreico (36), mientras que en Europa y en Amética del Norte el tipo diarreico es denunciado mas frecuentemente (1, 32). Esta variacién probablemente es de- bida a diferencias en los habitos de comer, aunque se dice que la leche ha originado por lo menos un brote importante del tipo emético en Japén (36). Varios informes indican que algunos enfermos han padecido simulténeamente ambos pos de enfermedad alimentaria por B. cereus (32). Es asimis- mo evidente que algunas cepas de B. cereus tienen Ia capaci- dad de producir ambos tipos de toxinas (20, 32) Los paises se diferencian en cuanto a sus procedimientos de denuncia de las enfermedades alimentarias y por consi- guiente es dificil compararel ntimero de brotes de paises dis- 10s. Los porcentajes de los brotes denunciados y de los casos atribuidos a B. cereus en Japén, América del Norte, y Europa, varfan desde aproximadamente el 1 hasta el 22% de los brotes y desde aproximadamente el 0,7 al 33% de los casos (informes de periodos distintos entre 1960 y 1992) (1, 32). El mayor nfimero de brotes y casos denunciados co- rrespondi6 a Holanda y a Noruega. En estos dos paises rela- tivamente pequefios, la enfermedad alimentaria por B. cereus ha sido un objetivo de las autoridades dedicadas a la investi- ‘gacién y al control de los alimentos. Sin embargo, en compa- racién con muchos paises, Noruega estérelativamente exen- tade brotes de Salmonella spp. y de Campylobacter spp. (I), Escaneado con CamScannerBacillus cereus 345 Tabla 17.2 Caracteristicas de los dos tipos de enfermedad causados por B. cereus* Caractertstica Diarreica Dosis infecciosa (cé1ulas) Toxina producida Tipo de toxina Periodo de incubacién (h) ‘Duracién de la enfermedad (h) Sintomas Protefna 8-16 (a veces >24) 12-24 (a veces varios dfas) a veces nduseas Alimentos implicados muy frecuentemente © Weteos * De las referencias 18, 19, 32, 36, y 42, las dos causas de enfermedad alimentaria denunciadas més frecuentemente en el Reino Unido (40). CARACTERISTICAS DE LA ENFERMEDAD ‘Segiin ha sido indicado, existen dos tipos de enfermedad aliment 9 B. cereus. El pris es causado por una toxit seta g es isms que el segundo tipo, causado por enterotoxina(s), produce diarrea (32). En tun ntimero reducido de casos, los enfermos han manifestado sintomas de ambos tipos de enfermedad (32), probablemente como resultado de la produccién de ambos tipos de toxinas. Ha habido cierta polémica acerca de si la(s) enterotoxinas(s) pueden encontrarse preformadas en los alimentos y producir tuna intoxicaci6n. Esto es improbable porque el perfodo de incubacién es excesivamente largo (> 6 h; promedio, 12 h) 82), y las investigaciones en modelos experimentales han revelado que Ia(s) enterotoxina(s) se degrada(n) en el tracto intestinal antes de que Hegue(n) al fleon (19). Las investiga- ciones han revelado que Ia(s) enterotoxina(s) se puede(n) en- contrar preformada(s) en los alimentos; sin embargo, el nti mero de células de B. cereus existentes en el alimento que contiene enterotoxina preformada es por lo menos 2 érdenes de magnitud més elevado que el necesario para producir en- fermedad alimentaria (16, 17, 19). Estos productos serian con- siderados alterados y ya no aceptables para el consumidor, En Ia Tabla 17.2 se oftecen las caracterfsticas de los dos pos de enfermedad alimentaria por B. cereus. Dos brotes recientes en Noruega fueron relacionados con el consumo de estofado. La dosis infecciosa se caleulé en 10*a 10° células, De las 17 personas afectadas, 3 estuvieron hospitalizadas, | durante 3 semanas (18). El comienzo de los sintomas en las tres personas hospitalizadas fue transcurri- das mas de 24 h después del consumo del estofado. El segun- do brote, en febrero de 1995, involueré a 152 casos en los En el intestino delgado del hospedador Dolor abdominal, diarrea acuosa, Sindrome emético 10*-10* (por g) Preformada en alimentos Péptido ciclico 0,5-5 6-24 Néuseas, mito, malestar (a veces seguido de diarrea, ;debidos a la produccién de otra enterotoxina’) Arroz frito y cocido, pasta, pasteleriatallarines competidores del campeonato de esqui junior noruego (22). Los alletas j6venes (de 16 a 19 afios) tuvieron los sintomas ‘ms graves, mientras que los entrenadores y los érbitros no resultaron afectados. En algunos enfermos, el tiempo para el ‘comienzo de los sfntomas fue més de 24 horas, y la duracién de la enfermedad fue desde 2 a varios dias. Quizé algunas cepas de B. cereus colonizan en el intestino delgado de algu- nos enfermos y producen sintomas més graves por producir, enterotoxina en el sitio de colonizacién. DOSIS INFECCIOSA Y POBLACIONES, SENSIBLES Después del primer brote diarreico reconocido de enfer- medad alimentaria por B. cereus en Oslo (causado por salsa de vainilla contaminada), Hauge aislé la bacteria, la cultive hasta conseguir una concentracién de 4 x 10° células por ml, y bebi6 200 ml de este cultivo bacteriano (25), Después de ‘aproximadamente 13 h, manifest6 dolor abdominal y una dia- ‘rea acuosa que duré unas 8 horas. La dosis infecciosa fue aproximadamente 8 x 10 células. Investigaciones posterio- res de alimentos incriminados relacionados con el brote re- velaron recuentos de B. cereus que variaban desde 200 hasta 10° células/g (o ml) (18, 19, 26, 32), variando las dosis infec- ciosas calculadas desde 5 x 10* hasta 10" células por g. Las dosis infecciosas pueden variar desde aproximadamente 10° hasta 10° células viables 0 esporas por g, debido en parte a Jas grandes diferencias en las cantidades de enterotoxina pro- ducida por las diferentes cepas (19). Por consiguiente, el mento que contiene més de 10* células de B. cereus por g puede no estar exento de peligro para el consumo. Poco se sabe acerca de las poblaciones sensibles, pero los sintomas més graves han sido relacionados con los atletas J6venes (< 19 afios de edad) y personas mayores (> 60 afios de edad) (18, 22). Escaneado con CamScanner‘Tabla 17.3 Propiedades de la toxina emética ceredli Determinacién Propiedad o actividad Masa molecular Estructura . Punto isoeléctrico ..... Antigénica 2.5 ease Actividad biol6gica en primates vivos. .. Receptor ...... Pruebas de asa de fleon (conejo, Citotéxica ..... Células HEp-2 ‘Termoestabilidad Estabilidad al pH ‘ Efecto de proteolisis (tripsina, pepsina) Toxina producida Produccién . rat6n). 1,2kDa Péptido en forma de Sin carga eléctrica No (?) Vémito 5-HT, (estimulacién del vago aferente) Ninguna No ss : ‘i vacuolizacién pbablemente de modo illo enzimético) "De tas referencias 2, 4, 32, 36, 37. FACTORES DE VIRULENCIA Y MECANISMOS DE PATOGENICIDAD Los dos tipos de enfermedad alimentaria debidaa B. cereus son causados por toxinas muy diferentes. La toxina emética, que produce vémito, ha sido aislada y caracterizada recien- temente (2), mientras que la enfermedad diarreica puede ser causada por més de una enterotoxina (10, 11, 19, 23, 32, 39, 41, 42). La toxina emética La toxina emética sélo product emesis (Vomit), ysues- tructura ha sido engafiosa porque hasta hace poco tiempo el Uinico método de detecci6n existente implicaba alos primates (28, 32). La observacién reciente de que la toxina podria ser identificada en las células HEp-2 (actividad de vacuolizaci6n) (28) condujo al aislamiento y a la caracterizacién de su es- tructura (2). Aunque ha habido alguna duda respecto de la relaci6n entre la toxina emética y el factor de vacuolizacién (36, 38), en Ia actualidad se ha confirmando que son la mis- ma oxina (4, 37). La toxina emética, llamada ceretilida, consta de una estructura en anillo de tres repeticiones de cuatro tér- ‘minos amino y/o oxiécidos: [D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val]. Esta estructura anular (dodecadepsipéptido) tiene una masa molecular de 1,2 kDa y esté emparentada cercanamente con el ion6foro de potasio valinomicina (2). La via biosintética y el mecanismo de accién de la toxina emética son al presente indefinidos, aunque recientemente se ha determinado que la toxina estimula la via aferente del vago por unin al receptor 5-HT, (4), Se desconoce si la toxina es un producto génico modificado o si es producida enzimaticamente por modifica- cién de componentes del medio de crecimiento. Sin embar- go, teniendo en cuenta la estructura de la ceretilida, es més probable que sea un péptido sintetizado enziméticamente y no un producto génico. Anteriormente se suponfa que la toxina emética era un lipido (19, 32), probablemente debido al cardcter hidréfobo de la ceretilida. Ahora que se conoce su estuctura, no resulta sorprendente que no sea antigénica o resistente al calor, al pH 0 a la protestisis (32) (Tabla 17.3). Enterotoxinas El ntimero de enterotoxinas formadas por B. cereus y sus propiedades han sido discutidos durante muchos afios (19, 32, 39, 41, 42). La clonacién de genes y los estudios de secuenciado han revelado que B. cereus produce al menos dos enterotoxinas diferentes (3, 27). Sin embargo, no existen pruebas de que la llamada enterotoxina T (3) produzca en- fermedad. ‘Aunque es posible que en la enfermedad alimentaria por B. cereus estén implicadas varias protefnas, probablemente sea responsable del sintoma principal un solo tipo de enterotoxina (8, 10, 19, 32, 39, 41). Sin embargo, se desco- noce si la enterotoxicidad es debida a una protefna tinica oa una enterotoxina de varios componentes (8, 10, 19, 23, 39, 41), Aunque la estructura de la enterotoxina no es evidente, des clave una protefna cuyo gen ha sido clonado y secuenciado recientemente. La proteina tiene una masa ‘molecular de 38 kDa lo mismo que una proteina madura (344 aminoécidos), una vez es separado un péptido de sefiales de 31 aminodcidos (27). En nuestro Laboratorio, mediante la prueba de! «Western blot» («immunoblot») con enterotoxina Escaneado con CamScanner350 __Microbiologfa de los alimentos, 1 rok EactinnlrtScanenscoeanat GaTCGTICACTCGGONTCCATSTANTATIAGCTACGEAAAAACCORGTGTSTTOTAG HIGRANGAOTENGETTCARC "GOTCGTECNGTCGGGATCCATETANTATTRGCTA Sng tet hE tast hate tanttustartetntertbaiecn darts Ooo 1. BanSaano1'hconGTAACTCGAAATTCAAACTNGCATTAANAGTCARANTACGTCAGATAGTAATGAAATCTTAAAAACGCCAGATOCT Se ena o Unt cx tn cava! MMOs nine ster Ghat atu eLx. isa. SorGaAATTACRFINGCAGGACGTOCTTACTIAGANGTTGGGAATAATGAAATTIATGAAGTAFTCEAATCACCTTGGAGCEGAGCAGAC TE DE ML DOA Tt YA TN DL GQ YE Th 8 8D 271. TADGIAGAAIACRARGAGOATAAAGAACATTTAGACOCAACAATCTATCCAATAAATGATCTAGGACAAENTGRAMINPTAGTGANGAT eS KE VIS VP SEL DAY DY tH DY AEE 361, PEahoTeccOrTGGTAGCAGTAAAGANGTANTAAGCOTAGCATCTGAACTCGNTGCTOTEATTGCTACATECACGRTEACGCAGRAATA ReT EA DAR EUS SPOS 6a 02% 6 5585 1 QF x © 451. ATARATTEAAGCGTTAGCTAGACCOTGGTTACCACCAGTTECAGAAAGCGTATATTIACAAGACTIACATGCAATTERGRTCARAGAN RN kre er bo A TV al 2 DQ: Ro Qa GT Pb, s bp 41 CentGcoCGAAAGAAAAGAAACCATTACAAGCAACAGTTGGTCTACTAGATCRGECTGAATTACANTCAERAACACCRTTAACKETAGAT PRD eR UAV ER So) GY 6k 8 fF lg 3 Vv 4 DV ALR 621 ATTAGTAAAGACGGACACOTAGCGGTCTTCTCANGCCCAGGCTACGGAAANTCAACATICTTACAATCAGTCOTTATGGATGTAGCTCGT Cus PEM DH VY LV DLC TN Gt LP LK OL PH VA D a1 SxcenmactecoaAGeNPTTGCATGTGTATTTAGTCGACCTIGGAACRARTGGTCTTCTACCCTTGARAGGAT#ACCTCATOTAGCGGAT TERrOE SER Co K FY ERE TEM RNR KR LL S © a1 RcGAPTACGATTGATGAATCTGAARANTGTTTAAACTTTCTTGAAAGATTAACTCHAGRAATOAARAATCOTAAACGATTATTAAGTGAA POU RN TERY SEM EO K 2 2 82 Tt er DMX DAY 901. TATGACOTTGCAAATATTGAAATGTATGARAAGGCRAGCOGGAAAGARATAGCACATATTATTATTOCANTCGACRATTATGATGCAGTA REA RP TES Fox Mo 1y MQ \2,V DO 1A SE, GF War oP Se V 991, RAAGRAGCGAAGTCTATGAAAGCTTUAAATCTAMPTATGGAAATMGTCCOAGATGGTGCAAGTTAGGAATICTATTCTTCTATGTE FFYF GG 1081 TTCTTTTACTTCGGCGGATAA Figura 17.3 Nucleétido y secuencias de aminofcidos deducidas correspondientes a la regién ‘que codifica la enterotoxina T, segtn fueron determinados por Agata eral. (2) to de la enterotoxina en las asas de fleon en 10 minutos después de la inyeccién (32). La enterotoxina de B. cereus ‘es por lo menos 100 veces més potente que Ia enterotoxna de Clostridium perfringens (19, 21), y actia independien- temente de los cationes divalentes (19). Aunque las enterotoxinas de B. cereus y de C. perfringens rompen la membrana de las células epiteliales, sus mecanismos de accién son diferentes (19). ‘Otra toxina, la enterotoxina T, que esta compuesta de una sola protefna, tiene una masa molecular de 41 kDa y fue iden- tificada recientemente por Agata et al. (3). La enterotoxina T es diferente a cualquiera de las protefnas conocidas anterior- ‘mente asociadas con la enterotoxina de varios componentes descrita antes, Hasta tanto no se sepa mas acerca de la activi- dad bioldgica y variacién de cepa en la produccién de esta enterotoxina, su importancia en Ia enfermedad alimenta debida a B. cereus es dudosa. La enterotoxina T ha sido clonada yy secuenciada, mostréndose en la Figura 17.3 las secuencias de nucledtidos y aminodcidos. La enterotoxina T tiene una homologfa limitada con el componente B de la hemolisina BL (Fig. 17.4). Todavia se tiene que determinar si las zonas de homologfa tienen alguna importancia biol6gica. Otras toxinas Han sido descritas otras protefnas con actividad de enterotoxina (32), pero poco se sabe acerca de sus propieda- des. Se dice que una proteina parecida a la enterotoxina tenia tuna masa molecular de aproximadamente 57 kDa (32). Es posible que la proteina mas pequefia sea la misma que la des- crita anteriormente. La espora ee seen peels cy fermedad alimentaria, ya que es més hidréfoba que cual- quiera de las dems esporas de Bacillus spp., lo que le per- mite adherirse a varios tipos de superficies (29, 30). Por consiguiente, es dificil eliminarla del material durante la limpieza. Las esporas de B. cereus también poseen apéndi- ces y/o pelos (5, 30) que estén implicados, al menos en par- te, en la adherencia (30). Estas propiedades de adherencia no s6lo permiten que las esporas resistan los procedimien- tos normales de desinfecci6n, y de este modo contaminan los alimentos durante su tratamiento, sino que también coadyuvan en la fijacién a las células epiteliales. Las inves- tigaciones han demostrado que las esporas de B. cereus son capaces de adherirse a células Caco-2en cultivo y que estas propiedades estén relacionadas con su hidrofobicidad y posiblemente con sus apéndices (Sa). a adherencia de las esporas a células epiteliales seguida de germinaci6n y de produccién de enterotoxina puede explicar los perfodos de incubaci6n prolongados que se observan en algunos brotes relacionados con alimentos (18, 19). Escaneado con CamScannerEnterotoxina T 149 ATAGTAATGAAA acinatneecateororo ee ML. Componente B Bacillus cereus 351 HTT cdl ore vA Adbcatbeabtnokntt 976 Figura 17.4 Homologia en la secueneia nucleotidica entre el componente B (de Is Fig. 17.1) y la eenterotoxina T (de la Fig. 17.3) Métodos comerciales para la identificacion de las toxinas de B. cereus No existe ningtin dispositivo comercial para la identifica- ‘cidn de la toxina emética cerestida, Sin embargo, existen dos dispositivos comerciales para la identificacién de la enterotoxina de B. cereus. Uno de ellos es un dispositivo de aglutinacién pasiva inversa con particulas de latex (Oxoid) basado en el componente atéxico (L2) del complejo de la enterotoxina (11, 20). Este componente ha sido identificado mediante andlisis de «Western blot» (16) y secuenciado de Jos aminocidos N-terminales de la protefna usada como tes- tigo en el dispositivo (11, 23). Algunos brotes relacionados ‘con cepas que producen grandes cantidades de enterotoxina, nno producen esta proteina y, por consiguiente, tiene un valor Timitado en la identificacion de Ta enterotoxina (20, 22). Christiansson (16) también ha demostrado que la cantidad de toxina detectada por este dispositivo no esté correlacionada con Ia citotoxicidad. El segundo dispositivo para la identificaci6n de la entero toxina B. cereus, un método de la prucba de inmunoabso Tigada a enzimas ideado por Tecra (Roseville, Australia), esti bbasado en las protefnas que no son tOxicas (11). Ladominan- te de las dos proteinas ha sido secuenciada en los aminodci- dos N-terminales, y no se encontré homologéa alguna con ninguna proteina conocida de B. cereus (11). Sin embargo, ‘Christianson (16) determin6 que la proteina identificada por el dispositivo Tecra se correlacionaba con la citotoxicidad. Ninguno de los dos dispositivos identifica especifieamente Inenterotoxina de B. cereus. (Véase Apéndice). OBSERVACIONES FINALES B. cereus es un habitante normal de la tierra y es aislado frecuentemente en una diversidad de alimentos, que inclu- yen las hortalizas, los productos lécteos, y Ia carne. Produ Ze una enfermedad alimentaria de tipo diarreico 0 emético {que cada vez es mis importante en e] mundo industrializado. El tipo diarreico de enfermedad es ms predominante en el hemisferio occidental, mientras que el tipo emético es mas predominante en Jap6n. Los postres, los platos de carne, y Tos productos lécteos son los alimentos relacionados més frecuentemente con Ia enfermedad diarreica, mientras que elarroz es el vehiculo més habitual de 1a enfermedad emé- tica, Ha sido aislada una toxina emética de B. cereus pero to- davia tiene que ser caractetizada. Han sido identificados al menos dos tipos de enterotoxinas de B. cereus, aunque la implicaciGn de laenterotoxina T en Ja enfermedad alimentaria todavia tiene que ser determinada. La toxina mejor caracteri- zada es la hemolitica y est compuesta de tres protefnas. ‘Algunas cepas de B. cereus son psicrotrofas y capaces de crecer a temperatura de refrigeracién. Estas variantes susci- tan preocupacién acerca de Ia seguridad de los alimentos cocidos refrigerados de vida comercial prolongada. Proba~ blemente la enfermedad slimentaria debida 2 B. cereus es ‘sumamente infradenunciada porque sus s{ntomas relativamen- te benignos son de duracién corta. Sin embargo, el interés de Jos consumidores por los alimentos precocinados refrigera- dos de vida comercial prolongada puede conducir a produc- tos muy apropiados para la supervivencia, paral crecimicn- to, y para la formacién de la toxina de B. cereus. Tales alimentos podrian aumentar la importancia de B. cereus como ppat6geno transmitido por alimentos. Apéndice Dos artculos recientes (Granum et al, FEMS Microbiol. Lert. 1a: 145-149, 1996; Lund y Granum, FEMS. Microbiol. Ler. 141: 151-136, 1996) han setialado que B. cereus produce otra emterotoxina anhemolftica de tres componentes. Uno de los SSimponentes deste complejoes idcntficado porel dispositive Tecra Referencias 1, Aas, Na B. Gondrosen, and G. La ‘gian Food Control Authority’s Report on Food Associated Diseases in 1990, SNT report 3. Norwegian Food Control Authority, Ost. 2. Agata, Ny M. Mori, M. Ohta, S. Suwan, I. Ohtani, and ‘M.Isobe. 1994. A novel dodecadepsipeptide, cereulide, iso- lated from Bacillus cereus causes vacuote formation in HEP-2 cells. FEMS Microbiol. Lett. 121:31-34. 3. Agata, N.,M. Ohta, ¥. Arakawa, and M. Mori. 1995. The beeT gene of Bacillus cereus encodes an enterotoxic pro~ tein, Microbiology 141: 983-988. Escaneado con CamScanner