ÁREA DE MICROBIOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA Y GEOLOGÍA

UNIVERSIDAD DE ALMERÍA

PATOLOGÍA MOLECULAR DE PLANTAS

GUION DE PRÁCTICAS
CURSO 2022-2023
ÍNDICE
1. ESTUDIO COMPARATIVO DE TÉCNICAS TRADICIONALES Y
MOLECULARES DESTINADO A LA DETECCIÓN Y EL DIAGNÓSTICO DE
VIRUS FITOPATÓGENOS...................................................................................................1

2. DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE PATOVARES DE BACTERIAS

FITOPATÓGENAS.................................................................................................................4

3.......DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE ESPECIES DE NEMATODOS MEDIANTE

TÉCNICAS MOLECULARES.............................................................................................11

4. HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICAS EN FITOPATOLOGÍA...........................15

5. ESTUDIO PRELIMINAR IN VITRO DE LA INTERACCIÓN PATÓGENO-

ANTAGONISTA....................................................................................................................17

6. BÚSQUEDA MOLECULAR DE AGENTES DE CONTROL BIOLÓGICO.............20

7. MÉTODOS DE INOCULACIÓN CON POTENCIALES AGENTES DE CONTROL

BIOLÓGICO (ACBs)............................................................................................................23
Patología Molecular Guion de prácticas

1. ESTUDIO COMPARATIVO DE TÉCNICAS TRADICIONALES Y

MOLECULARES DESTINADO A LA DETECCIÓN Y EL DIAGNÓSTICO DE
VIRUS FITOPATÓGENOS

FUNDAMENTO TEÓRICO

Durante la mayor parte del siglo pasado asistimos a la identificación y caracterización de un

número cada vez mayor de patógenos vegetales, con la ayuda de técnicas fundamentalmente
microscópicas, bioquímicas e inmunológicas, en un periodo que podríamos denominar
“Fitopatología descriptiva”. La posterior incorporación de la tecnología del ADN recombinante,
primero, y de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), después, revolucionaron no sólo
los procedimientos de identificación de fitopatógenos, sino la manera de abordar
experimentalmente aspectos básicos de la Patología de Plantas.

La agricultura del siglo XXI se enfrenta al reto de

aumentar la producción de alimentos y, además, hacerlo
empleando una menor superficie de cultivo e implicando
un menor impacto ambiental. En este contexto, es
fundamental la lucha contra las enfermedades de las
plantas, especialmente desde un punto de vista de
prevención y detección precoz.

El objetivo de esta práctica consiste en conocer y

comparar distintos métodos de identificación (tradicionales y modernos) para un agente
fitopatógeno de carácter vírico.

DESARROLLO PRÁCTICO

Material y medios necesarios

- Carborundum: carburo de silicio con estructura de diamante

- Plantas de tomate
- Micropipeta
- Puntas de pipeta
- Material vegetal sospechoso de ser portador del virus TYLCV
- Tampón de inoculación
- Bisturí
- Hisopo
1
Patología Molecular Guion de prácticas

- Microscopio

- Kit ELISA para virus TYLCV

Procedimiento

Infección del material vegetal

1. Tomar una muestra de material vegetal procedente de una planta potencialmente

infectada con TYLCV y macerar una pequeña cantidad (1 hoja) con tampón de
inoculación (aprox. 1mL).
2. Lesionar una planta de tomate sana empleando carborundum espolvoreado sobre la
superficie de las hojas, permitiendo herir la planta y posibilitando la entrada del virus
TYLCV encontrado en material vegetal infectado, empleando un hisopo para impregnar
la muestra sobre las lesiones de las hojas.
3. Mantener las plantas de tomate en cámara de incubación durante un plazo de 2-3
semanas, con riegos a demanda, hasta realizar las pruebas confirmativas de infección
por virus TYLCV, empleando un Kit ELISA específicamente destinado a ello.

Evaluación del estado sanitario de las plantas

1. Realizar, una vez superado el tiempo de incubación, la evaluación del estado sanitario
de las plantas de tomate mediante la utilización de una escala del 1 al 4 (1- sana, 2-
amarilleamiento, 3- marchitez general, 4- muerte).
2. Describir de un modo lo más detallado posible, todos los síntomas observables en las
plantas ensayadas, respecto a los controles usados en el experimento (plantas sanas sin
infectar).
3. Comparar los síntomas detectados con los esperables respecto a los desarrollados por
el agente fitopatógeno empleado.

Realización de técnica ELISA para confirmación de infección por virus de la cuchara

(TYLCV)

1. Aplicación del anticuerpo policlonal (PAB). Diluir PAB 1:200 del vial en tampón de
revestimiento. Añadir 0,1 mL de esta solución al pocillo, incubar durante 4 horas a 37
C. Posteriormente lavar 4 veces con tampón de lavado el pocillo.
2. Aplicación de la muestra. Preparar las muestras en dilución 1:20 en tampón Loewe III.
Macerar 0,5 g de material vegetal infectado en 1mL de Tampón Loewe empleando una

2
Patología Molecular Guion de prácticas

bolsa hermética (zip) y, posteriormente, conservándolo en eppendorf. (Los controles se

diluyen en 1.1 mL de tampón Loewe III). Añadir 0,1 mL de esta solución al pocillo,
incubar durante toda la noche a 4 C. Posteriormente lavar 4 veces con tampón de
lavado el pocillo.
3. Aplicación del anticuerpo monoclonal (MAB). Diluir MAB 1:200 del vial en tampón de
conjugado/muestra. Añadir 0,1 mL de esta solución al pocillo, incubar durante 2 horas a
37 C. Posteriormente lavar 4 veces con tampón de lavado el pocillo.
4. Aplicación del AP-conjugado rata-anti-ratón. Diluir el rata-anti-ratón-AP-conjugado
1:200 del vial en tampón de conjugado/muestra. Añadir 0,1 mL de esta solución al
pocillo, incubar durante 2 horas a 37 C. Posteriormente lavar 4 veces con tampón de
lavado el pocillo.
5. Ensayo enzimático. Añadir a cada pocillo 0,2 mL la solución de sustrato, incubar
durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente se puede realizar lectura
visual o con espectrofotómetro a 405 nm. Los controles positivos y negativos marcan la
intensidad de color para cada resultado.

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Patología Molecular Guion de prácticas

2. DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE PATOVARES DE BACTERIAS

FITOPATÓGENAS

FUNDAMENTO TEÓRICO

Algunos agentes fitopatógenos que pueden aparecer en los cultivos ocasionan unos efectos
tan adversos y con una alta capacidad de propagación a través del material vegetal infectado a
otros cultivos, que se han de tomar medidas de contención especiales para evitar su
proliferación. Son los llamados patógenos de cuarentena. En estos casos, la legislación actual
marca de forma muy definida todos los protocolos de actuación para tratar con este tipo de
agentes infecciosos. En estas prácticas se va a trabajar en la detección e identificación de la
bacteria Ralstonia solanacearum, conocida anteriormente como Pseudomonas
solanacearum, agente causal de la podredumbre parda en los tubérculos de patata y de la
marchitez bacteriana en las plantas de patata, tomate y otras especies de solanáceas.
Representa una grave amenaza para las producciones de estos cultivos, siendo algunos de
los síntomas más evidentes:

- Aspecto flácido de las hojas más jóvenes.

- En condiciones favorables, se produce
epinastia (crecimiento más fuerte en la
superficie superior que en la inferior de una
planta, provocando que una parte de la
planta, como una hoja, se curve hacia abajo)
y marchitamiento de un lado de la planta o
de toda ella, lo que desemboca en un
colapso total de la planta en pocos días.
- En condiciones menos favorables, se
produce un menor marchitamiento, pero
pueden surgir numerosas raíces adventicias
del tallo.
- En ocasiones se observan estrías húmedas desde la base del tallo, lo que demuestra la
existencia de necrosis en el sistema vascular.
- Al cortar transversalmente el tallo, los tejidos vasculares que presentan una
decoloración parda exudan gotas de líquido bacteriano blanco o amarillento.

El objetivo de esta práctica será conocer y poner en funcionamiento los protocolos de

actuación marcados en la legislación actual para la detección de este agente patógeno sobre
plantas de tomate portadoras de esta infección.
4
Patología Molecular Guion de prácticas

DESARROLLO PRÁCTICO

Material y medios necesarios

- Medio de cultivo para Ralstonia solanacearum

- Kit de PCR con cebadores adecuados para Ralstonia solanacearum
- Termociclador
- Enzimas de restricción
- Agarosa
- Agua destilada estéril
- Portaobjetos
- Cristal violeta
- Lugol
- Safranina
- Alcohol
- Peróxido de hidrógeno y tiras reactivas para detección de citocromo oxidasa
- Microscopio
- Cubeta de electroforesis
- Fuente de alimentación
- Plantas de tomate infectadas con Ralstonia solanacearum
- Bisturí
- Botes con 50 ml de agua destilada estéril

Procedimiento

Infección del material vegetal

- Realizar cortes en el tallo de una planta sana de tomate, empleando un bisturí o una
aguja, permitiendo realizar aperturas artíficiales (heridas) que posibiliten la entrada de
Ralstonia solanacearum y, por tanto, la infección de la planta.
- Preparar una suspensión de Ralstonia solanacearum en agua destilada estéril a partir
de medio fresco que contenga este patógeno, empleando el asa de platino, ajustando
el inóculo a un tubo de referencia de 1 en la escala McFarland.
- Inocular las plantas sanas, previamente lesionadas, aplicando la suspensión de
Ralstonia solanacearum sobre las heridas del tallo utilizando una micropipeta.

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Patología Molecular Guion de prácticas

(BOE 074 de 27/03/2007 Sec 1 Pag 13152 a 13190 - BOE.es)

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Patología Molecular Guion de prácticas

Evaluación del estado sanitario de las plantas

1. Realizar, una vez superado el tiempo de incubación, la evaluación del estado sanitario de
las plantas de tomate mediante la utilización de una escala del 1 al 4 (1- sana, 2-
amarilleamiento, 3- marchitez general, 4- muerte).

2. Describir de un modo lo más detallado posible, todos los síntomas observables en las
plantas ensayadas, respecto a los controles usados en el experimento (plantas sanas sin
infectar).

3. Comparar los síntomas detectados con los esperables respecto a los desarrollados por el
agente fitopatógeno empleado.

Prueba de exudación del tallo

1. Cortar el tallo justo por encima del nivel del suelo.

2. Suspender la superficie del corte en un tubo de agua limpia.
3. Observar si se produce la característica exudación espontánea de
hilos de flujo bacteriano de los haces vasculares cortados unos
minutos después.

Identificación preliminar

1. Para aislar el patógeno, se coge exudado bacteriano o secciones de tejido decolorado de

los haces vasculares del tejido de la planta.
2. Realizar una suspensión del material vegetal potencialmente infectado en 25-50 mL de
agua destilada estéril, agitar durante 5-10 minutos a 70 rpm y, posteriormente, dejar en
reposo durante unos minutos.
3. Preparar diluciones decimales seriadas de la suspensión inicial.
4. Sembrar 100 L de la suspensión de las diluciones en un medio favorable para el
crecimiento de este tipo de fitopatógeno (YM o YDC).
5. Incubar las placas entre 2-6 días a 28 C.

En un medio nutritivo general, los aislados virulentos de R. solanacearum desarrollan

colonias de color blanco nacarado, planas, irregulares y fluidas, que con frecuencia
presentan los verticilos característicos en el centro. En YDC, las colonias de R. solanacearum

7
Patología Molecular Guion de prácticas

se observan amarillas (Figura). En medios más específicos, las formas avirulentas de R.

solanacearum forman colonias butirosas pequeñas, redondas y no fluidas, que son
completamente blancas. En los medios de tretrazolio de Kelman y SMSA, los verticilos son
de color rojo sangre. Las formas avirulentas de R. solanacearum forman colonias butirosas
pequeñas, redondas y no fluidas, que son totalmente de color rojo oscuro.

Crecimiento de Ralstonia solanacearum en medio YDC. Colonias color amarillento.

Pruebas bioquímicas adicionales

1. Realizar una tinción de Gram de las colonias sospechosas detectadas en el apartado

anterior. R. solanacearum es Gram negativa.
2. Realizar prueba de la catalasa. R. solanacearum es catalasa positiva.
3. Realizar prueba de la oxidasa. R. solanacearum es oxidasa positiva.
4. Realizar prueba de la licuefacción de la gelatina. R. solanacearum es negativa.
5.

Identificación molecular

1. Extracción de ADN:

- Realizar una suspensión de una colonia, previamente aislada en placa e identificada

como sospechosa de ser R. solanacearum, en un eppendorf con 0,5 mL de agua estéril.
- Someter la suspensión a choque térmico: 5 min a 100 ºC y, seguidamente, 5 min a 0 ºC.
- Tomar una alícuota de 0,01 mL del sobrenadante e incorporarlo a un eppendorf con
0,09 mL de agua estéril. Esa será la muestra de ADN molde para la posterior
amplificación.

2. Amplificación del ADN mediante PCR:

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Patología Molecular Guion de prácticas

Para la realización de la PCR se emplea el kit BIOmix TM Red 2,0X Taq DNA Polymerase
(Bioline) y se emplean cebadores específicos de genes asociados a la especie Ralstonia
solanacearum (PS1 y PS2), preparando las mezclas de cada muestra con los siguientes
volúmenes:
1. Kit de PCR: 10 μL.
2. Cebador Forward: 0,4 μL.
3. Cebador Reverse: 0,4 μL.
4. ADN muestra: 2 μL.
5. H2O miliQ: csp 20 μL.

Posteriormente se cargan las muestras en el termociclador, dando lugar a la PCR y

generando amplicones que pueden ser revelados mediante gel de agarosa.

Protocolo de Pastrik y Maiss (2000).

Condiciones de reacción PCR:
1 ciclo de 5 minutos a 95 C (desnaturalización del molde de ADN)
35 ciclos de:
- 30 segundos a 95 C (desnaturalización del molde de ADN)
- 30 segundos a 68 C (hibridación de los cebadores)
- 45 segundos a 72 C (extensión de la copia)
1 ciclo de 5 minutos a 72 C (extensión final)
Mantener a 4 ºC.

Cebadores:

PS-1: 5’-AGTCGAACGGCAGCGGGGG-3’
PS-2: 5’-GGGGATTTCACATCGGTCTTGCA-3’

Tamaño esperado del amplicón de los moldes de ADN de Ralstonia solanacearum = 553
pb.

Análisis de la enzima de restricción del amplicón:

Los productos PCR amplificados (553 pb), a partir de ADN de R. solanacearum, producen un
polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción característico con la enzima Taq I
tras la incubación a 65 °C durante 30 minutos. Los fragmentos de restricción obtenidos a
partir del fragmento específico de R. solanacearum tienen un tamaño de 457 pb y 96 pb.

1. Producto de PCR: 10 μL.

2. H2O miliQ: 18 μL.
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Patología Molecular Guion de prácticas

3. Tampón Taq I: 2 μL.

4. Taq I: 1 μL.

Identificación mediante electroforesis:

1. preparar un gel de agarosa al 1%, utilizando TAE como tampón. Como marcador de
tamaño se utiliza el Wide-Range DNA Marker (Sigma-Aldrich), en el que aparecen 16
bandas comprendidas entre 50 y 10.000 pb, situándose el producto de amplificación en
torno a 250 pb. Se cargan 5 μL de muestra en cada pocillo.
2. Carrera 1 hora a 110 V, utilizando una fuente de alimentación Consort EV231.
3. Visualizar mediante el sistema de documentación de geles Gel Doc TM XR (Bio Rad). La
visualización fue potenciada mediante la incorporación al gel durante su elaboración del
agente colorante Gel RedTM Nucleic Acid Stain (Biotium).

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Patología Molecular Guion de prácticas

3. DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE ESPECIES DE NEMATODOS

MEDIANTE TÉCNICAS MOLECULARES

FUNDAMENTO TEÓRICO

Los nematodos fitoparásitos son gusanos alargados, lisos, no segmentados, no ciliados, de

300-4000 m de largo y de 15-35 m de ancho. Normalmente son de sección cilíndrica y
tienen forma de pequeñas anguilas, aunque las hembras de varias especies adoptan un
aspecto globoso o de pera al madurar. A diferencia de otros animales, los nematodos
contienen un número fijo de células.

Estos nematodos tienen gran importancia económica en la agricultura, ya que algunas

especies son importantes patógenos de la mayoría de las plantas cultivadas. La acción de estos
patógenos puede originar pérdidas anuales de hasta el 14% de la producción a nivel mundial.
La correcta identificación de estos nematodos (independientemente de la etapa de desarrollo
en que se encuentren) tiene importantes implicaciones en numerosas áreas, incluyendo
taxonomía, filogenia, genética de poblaciones, ecología, epidemiología y el control efectivo de
las enfermedades que desarrollan.

Tradicionalmente, el diagnóstico de una infección por nematodos se ha basado en el

estudio y medición precisa de ciertas estructuras morfológicas a través de la observación
microscópica de cada individuo de una población. Este procedimiento, con frecuencia acarrea
una considerable variación intra e inter específica lo que dificulta en gran medida la
interpretación de resultados. Además, en el caso de que la población estudiada esté formada
por una mezcla de especies muy relacionadas (frecuente), la discriminación entre especies
basada en promedios de medidas de los individuos no es concluyente. Por tanto, una
identificación dudosa conduce a menudo a la confusión entre algunas especies similares
morfológicamente, pero de muy distinta capacidad patogénica, lo que tiene importantes
consecuencias fitopatológicas y afecta al uso de medidas de control adecuadas como el cultivo
de variedades resistentes e incluso a la aplicación correcta de normas de cuarentena.

Actualmente, la disponibilidad de las técnicas moleculares para la identificación de

nematodos fitopatógenos permite realizar el estudio directo de la genética de especies,
eliminando los problemas asociados con las variaciones inconsistentes asociadas a la
morfología, puesto que la secuencia de ADN es la fuente primaria de variación biológica.

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Patología Molecular Guion de prácticas

El objetivo de esta práctica consiste en diagnosticar la presencia de nematodos en suelos

mediante el empleo de técnicas tradicionales de identificación y de técnicas moleculares,
permitiendo comprobar las ventajas e inconvenientes que poseen cada una de ellas.

DESARROLLO PRÁCTICO

Material y medios necesarios

- Suelo sospechoso de infección con nematodos fitopatógenos

- Bandeja para suelo
- Sistemas de filtración
- Filtros de 0,45 m
- Placa de Petri
- Lupa o microscopio óptico
- Botes de tapón rojo
- Pistilos

Procedimiento

Aislamiento de nematodos en suelo (método modificado de bandejas de Baermann)

1. Pesar 200 g de suelo sospechoso de infección con nematodos fitopatógenos y disponer

el suelo sobre una bandeja.
2. Adicionar 100 ml de agua de grifo al suelo.
3. Agitar la mezcla con objeto de deshacer los terrones de suelo y facilitar la dispersión de
los nematodos.
4. Incubar la mezcla durante 5-7 días a temperatura ambiente.
5. Tras la incubación, recoger el sobrenadante, en un vaso de tapón rojo, intentando no
arrastrar el suelo. El sobrenadante contiene los nematodos en suspensión.
6. Para facilitar el recuento de individuos, el sobrenadante se filtra a través de un sistema
de filtración, empleando un filtro de 0,45 m (en el filtro quedan retenidos los
nematodos).
7. Tras el filtrado, el filtro se lava con 5 ml de agua de grifo para evitar la plasmólisis de los
nematodos y ese volumen de agua se transfiere a una placa de Petri pequeña y
cuadriculada donde se puede realizar el recuento.

Caracterización morfológica de los nematodos presentes en el suelo

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Patología Molecular Guion de prácticas

1. Capturar a la lupa una pequeña cantidad de nematodos para observar sus características
morfológicas al microscopio.
2. Identificar las características de los nematodos capturados con la ayuda de un libro de
claves de identificación.
3. Transferir todos los nematodos posibles a un tubo eppendorf con 50 μL de tampón TNE
2X.

Diagnóstico molecular de especies de Meloidogyne presentes en el suelo

Extracción de ADN empleando Plant DNAzol:

1. Machacar con la ayuda de un pistilo, los nematodos recogidos en el tubo eppendorf.

2. Incorporar el contenido anterior (al menos 100 μL) a un eppendorf con 300 μL de Plant
DNAzol. Incubar 5 min a Temperatura ambiente.
3. Centrifugar 11750 rpm durante 10 min. Conservar el sobrenadante (300-500 μL).
4. Incorporar el sobrenadante a un eppendorf con 225 μL de Etanol al 100%. Invertir
varias veces y dejar reposar 5 min en frío.
5. Centrifugar 7500 rpm durante 5 min. Conservar el pellet.
6. Incorporar al eppendorf anterior (conteniendo pellet) 300 μL de mezcla de lavado (1
volumen de Plant DNAzol + 0,75 volúmenes de Etanol al 100%). Vortear e incubar
durante 5 min a Temperatura ambiente.
7. Centrifugar 7500 rpm durante 4 min. Conservar el pellet.
8. Incorporar al eppendorf anterior (conteniendo pellet) 300 μL de Etanol al 75%.
Mezclar.
9. Centrifugar 7500 rpm durante 4 min. Conservar el pellet y dejar secar.
10. Añadir 50-70 μL de agua destilada estéril.
11. Incubar 5-10 min a 65 ºC (Termobloque).
12. Emplear el contenido directamente en la reacción de PCR o almacenar a 4 C hasta su
uso.

Amplificación del ADN mediante PCR:

Para la realización de la PCR se emplea el kit BIOmix TM Red 2,0X Taq DNA Polymerase
(Bioline) y se emplean cebadores específicos de genes asociados a la especie Meloidogyne,
preparando las mezclas de cada muestra con los siguientes volúmenes (protocolo estándar,
adaptar en función del protocolo específico (Zijlstra, 1997):

5. Kit de PCR: 10 μL.

6. Cebador Forward: 0,4 μL.
7. Cebador Reverse: 0,4 μL.
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Patología Molecular Guion de prácticas

8. ADN muestra: 2 μL.

9. H2O miliQ: csp 20 μL.

Posteriormente se cargan las muestras en el termociclador, dando lugar a la PCR y

generando amplicones que pueden ser revelados mediante gel de agarosa.
Para la identificación de Meloidogyne se siguió el protocolo descrito por Zijlstra (1997),
con ligeras modificaciones. El método consiste en una múltiplex PCR que permite identificar
4 especies diferentes del género Meloidogyne, entre las que se encuentran las más
abundantes en esta zona, M. hapla y M. incognita. La reacción de PCR se llevó a cabo en un
volumen de 25 μL y contenía 2,5 μL de 10X PCR buffer, 2,5 μL de MgCl 2 50 mM, 1,75 μL de
dNTPs mix 2 mM, 0,5 μL de cada primer, HCFI-28S, I-ITS, H-18S y CF-ITS, a una concentración
10 μM, 0,3 μL de Taq polimerasa (5U/μL) y 5 μL de la extracción de ADN. EL programa de
PCR utilizado fue el siguiente: 94 ºC 4 min, 5 ciclos de 94 ºC 30s, 50 ºC 30 s (disminuyendo 1
ºC en cada ciclo), 72 ºC 1 min, 30 ciclos de 94 ºC 30 s, 40 ºC 30 s, 72 ºC 1 min, seguidos de
una extensión final a 72 ºC durante 12 min.

Una alícuota del producto de PCR se reveló mediante electroforesis en gel de agarosa al 2
% en tampón TBE 1X a 100 voltios (Figura 2). El tamaño de los fragmentos obtenidos para
cada especie son: M. hapla, 660 pb; M. incognita, 415 pb; M. chitwoodi, 525 pb y M. fallax,
517 pb. Para la identificación de las dos últimas especies es necesario digerir el producto de
PCR con la endonucleasa de restricción RsaI que en el caso de M. fallax corta el fragmento
de 517 pb en dos: uno de 400 pb y otro de 100 pb.

Cebadores:
H18S: CTTGGAGACTGTTGATC
CF-ITS: GAATTATACGCACAATT
I-ITS: TGTAGGACTCTTTAATG
HCFI-28S: TTCCTCCGCTTACTGATAT

Zijlstra, C. 1997. A fast PCR assay to identify Meloidogyne hapla, M. chitwoodi, and M.
fallax, and to sensitively differentiate them from each other and from M. incognita in
mixtures. Fundam. Appl. Nematol. 20 (5):505-511.

Identificación mediante electroforesis:

1. preparar un gel de agarosa al 1%, utilizando TAE como tampón. Como marcador de
tamaño se utiliza el Wide-Range DNA Marker (Sigma-Aldrich), en el que aparecen 16

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Patología Molecular Guion de prácticas

bandas comprendidas entre 50 y 10.000 pb, situándose el producto de amplificación en

torno a 300 pb. Se cargan 5 μL de muestra en cada pocillo.
2. Carrera 1 hora a 110 V, utilizando una fuente de alimentación Consort EV231.
3. Visualizar mediante el sistema de documentación de geles Gel Doc TM XR (Bio Rad). La
visualización fue potenciada mediante la incorporación al gel durante su elaboración del
agente colorante Gel RedTM Nucleic Acid Stain (Biotium).

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Patología Molecular Guion de prácticas

4. HERRAMIENTAS BIOINFORMÁTICAS EN FITOPATOLOGÍA

FUNDAMENTO TEÓRICO

La Bioinformática es un área científica multidisciplinar cuyas raíces se extienden en la

Biología, la Química estructural, las Ciencias de la Computación, las Matemáticas y la Teoría de
la Información. En las últimas décadas, la Biología Molecular ha experimentado una revolución
metodológica que le ha permitido acumular ingentes cantidades de datos de secuencias,
estructuras e interacciones entre distintos componentes genómicos. Organizar, analizar,
entender e integrar esta información sería imposible sin las técnicas computacionales que, en
paralelo, se han desarrollado también en estos años. Particularmente, el desarrollo de
herramientas adecuadas para almacenar, organizar, actualizar y catalogar los datos, así como
los algoritmos necesarios para recuperar información en respuesta a patrones de búsqueda y
analizar esta información según las distintas necesidades de cada analista.

El objetivo de esta práctica es conocer y aprender a usar diferentes entornos y programas

relacionados con la bioinformática, con el fin de poder identificar secuencias de ADN
procedentes de distintos microorganismos.

DESARROLLO PRÁCTICO

Material y medios necesarios

- Ordenador

Procedimiento

1. Se dispone de un par de secuencias de nucleótidos proporcionadas por el profesorado,

que proceden de un microorganismo en concreto que debe ser. Cada secuencia procede
del resultado de la secuenciación de un microorganismo secuenciado en un
Secuenciador Ion PGM (Personal Genome Machine), con Ion OneTouch™ 2 System, de
Life Technologies, que genera una secuencia Forward y una secuencia Reverse.
2. Trabajar con estas secuencias en los diferentes entornos y bases de datos más
relevantes de la bioinformática (BLAST, Eztaxon, Bacterio.net, Mycobank, etc).
3. Trabajar con distintos programas o aplicaciones bioinformáticas que posibiliten la
identificación de las secuencias de trabajo asignadas (Seq Scanner, MEGA, ClustalX,
Reverse Complement, Krona, etc)

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Patología Molecular Guion de prácticas

4. Identificar las secuencias problema usando todo el conocimiento adquirido y

presentar un informe acerca de la información recabada durante la práctica respecto
al microorganismo problema.

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Patología Molecular Guion de prácticas

5. ESTUDIO PRELIMINAR IN VITRO DE LA INTERACCIÓN

PATÓGENO-ANTAGONISTA

FUNDAMENTO TEÓRICO

El control biológico surgió en contraposición al control químico, caracterizado por el

empleo de productos químicos en agricultura. Cook y Baker (1983) definieron el Control
Biológico o Biocontrol como: “la reducción de la cantidad de inóculo o de la actividad de un
patógeno para producir una enfermedad por o a través de uno o más organismos distintos
al hombre”. Así, dentro del llamado control biológico podemos encontrar el uso de
microorganismos antagonistas denominados agentes de control biológico (ACBs).

Se han descrito varios mecanismos de acción de los antagonistas para controlar el

desarrollo de patógenos. Algunos de estos son antibiosis, competencia por espacio o por
nutrientes, interacciones directas con el patógeno (parasitismo y lisis enzimática) e
inducción de resistencia. No es fácil determinar con precisión los mecanismos que
intervienen en las interacciones entre los antagonistas y los patógenos en la planta. En
general, los antagonistas no tienen un único modo de acción y la multiplicidad de éstos es
una característica importante para su selección como agentes de control biológico. Si el
antagonista posee varios modos de acción reduce los riesgos de desarrollo de resistencia en
el patógeno. Este riesgo de resistencia también se reduce mediante el uso de
combinaciones de antagonistas con diferente modo de acción.

En concreto, en el ensayo con Trichoderma se puede observar detenidamente el

fenómeno del micoparasitismo, que es definido como una simbiosis antagónica entre
organismos, en el que generalmente están implicadas enzimas extracelulares tales como
quitinasas, celulasas, y que se corresponden con la composición y estructura de las paredes
celulares de los hongos parasitados. Las especies de Trichoderma durante el proceso de
micoparasitismo crecen quimiotrópicamente hacia el hospedador, se adhieren a sus hifas,
se enrollan en ellas frecuentemente y, en ocasiones, las penetran. La degradación de las
paredes celulares del hospedante se observa en los estados tardíos del proceso parasítico,
lo cual conlleva el debilitamiento casi total del fitopatógeno.

Serratia es un género bacteriano perteneciente al grupo de las enterobacterias,

habitualmente asociado a enfermedades nosocomiales. En el contexto de esta asignatura, la
especie Serratia marcescens resulta de especial interés para el seguimiento de la producción
de enzimas quitinasas, ya que esta bacteria es una excelente productora de estas enzimas.

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Patología Molecular Guion de prácticas

El objetivo de esta práctica es observar con la ayuda de una lupa o un microscopio

electrónico la interacción que ocurre al enfrentar diferentes microorganismos
fitopatógenos, frente a dos tipos de microorganismos con conocida capacidad antagonista,
Trichoderma y Serratia. Las quitinasas son enzimas interesantes para el control biológico de
hongos, ya que la quitina es un constituyente fundamental en su estructura.

DESARROLLO PRÁCTICO

Material y medios necesarios

- Cultivo de Trichoderma
- Cultivo de Fusarium
- Cultivo de Serratia marcescens
- Asa de platino
- Portaobjetos estériles
- Microscopio
- Taladro
- Papel de filtro estéril
- Agua destilada estéril
- Placas de Petri
- Cubreobjetos estériles

Procedimiento

Enfrentamiento hongo antagonista frente a hongo fitopatógeno

1. Sembrar placas de Trichoderma y Fusarium en medio PDA.

2. Incubar las placas durante 4-5 días en condiciones mesófilas.
3. Disponer papel de filtro estéril sobre placas estériles y humectar el papel con agua
destilada estéril.
4. Disponer sobre la placa un portaobjetos en condiciones de esterilidad.
5. Cortar un plug de cada hongo de ensayo y colocarlo sobre el portaobjetos de modo que
queden enfrentados.
6. Cubrir los plugs de cada hongo con la ayuda de un cubreobjetos.
7. Incubar las placas durante 3 días en condiciones mesófilas.
8. Realizar lectura del enfrentamiento usando microscopio.

Enfrentamiento hongo fitopatógeno frente a un productor de quitinasa

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Patología Molecular Guion de prácticas

1. Sembrar Fusarium en un tercio inferior de la placa en medio PDA y placas de Serratia

marcescens en medio APHA.
2. Incubar las placas durante 4-5 días en el caso del hongo y 2 días en el caso de la bacteria
en condiciones mesófilas.
3. Inocular una línea ascendente con la bacteria productora de quitinasa, la región próxima
a la zona de crecimiento del hongo.
4. Incubar las placas durante 2-3 días en condiciones mesófilas.
5. Obtener un plug procedente de la zona de interacción entre la bacteria y el hongo,
colocar sobre un portaobjetos y visualizar al microscopio frente a otra zona libre de ese
enfrentamiento.

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Patología Molecular Guion de prácticas

6. BÚSQUEDA MOLECULAR DE AGENTES DE CONTROL BIOLÓGICO

FUNDAMENTO TEÓRICO

Los miembros del género Bacillus son los microorganismos beneficiosos más utilizados
como bioplaguicidas. Su efecto protector puede deberse a la presencia de diferentes
mecanismos para influir negativamente, de forma directa o indirecta, en el crecimiento de
patógenos. Son numerosas las cepas de este género con actividad antagonista sobre
diferentes fitopatógenos, atribuible principalmente a la producción de antibióticos y
enzimas, entre otros.

El objetivo de esta práctica es la caracterización molecular de agentes de control

biológico. Para ellos, y tras observar las interacciones producidas en la práctica anterior, se
demostrará la presencia de genes de biosíntesis implicados en la producción de diversos
compuestos antibióticos, en cepas de Bacillus, demostrando a nivel molecular los
mecanismos que permiten a estos ACBs inhibir el crecimiento de fitopatógenos.

DESARROLLO PRÁCTICO

Material y medios necesarios

- Puntas de micropipeta y tubos de microcentrífuga (eppendorf)

- Termociclador
- Reactivos para PCR
- Gel de agarosa
- Cubeta de electroforesis

Procedimiento

Extracción de ADN:

1. A partir de placas con colonias de Bacillus bien aisladas, se dispone biomasa en tubos
eppendorf que contienen 1 ml de agua destilada estéril.
2. Aplicar choque térmico. Para ello, situar los tubos eppendorf en el bloque térmico a
100 C durante 5 minutos y posteriormente someterlos a baño de hielo durante otros 5
minutos.
3. Diluir el producto del choque térmico 1/10.

Amplificación del ADN mediante PCR:

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Patología Molecular Guion de prácticas

Para la realización de la PCR se emplea el kit BIOmix TM Red 2,0X Taq DNA Polymerase
(Bioline) y se emplean cebadores específicos de genes asociados a la producción de
antibióticos en Bacillus para el estudio de especies candidatas a dar resultado como agentes
de control biológico. Las mezclas de cada muestra se prepararon con los siguientes
volúmenes:

1. Kit de PCR: 10 μL.

2. Cebador Forward: 0,4 μL.
3. Cebador Reverse: 0,4 μL.
4. ADN muestra: 2 μL.
5. H2O miliQ: csp 20 μL.

Posteriormente se cargan las muestras en el termociclador, dando lugar a la PCR y

generando amplicones que pueden ser revelados mediante gel de agarosa.

Condiciones de PCR:
1 ciclo de 4 minutos a 94 ºC
25 ciclos de:
- 1 min a 94 ºC (desnaturalización del molde de ADN)
- 1 min a 60 ºC (hibridación de los cebadores)
- 1 min a 72 ºC (extensión de la copia)
1 ciclo de 4 min a 72 ºC (extensión final)
Mantener a 4 ºC

Cebadores SrFA (surfactina):

SrFAF1: GAAAGAGCGGCTGCTGAAAC
SrFAR1: CCCAATATTGCCGCAATGAC

Cebadores FND (fengicina):

FNDF1: CCTGCAGAAGGAGAAGTGAAG
FNDR1: TGCTCATCGTCTTCCGTTTC

Identificación mediante electroforesis:

1. preparar un gel de agarosa al 1%, utilizando TAE como tampón. Como marcador de
tamaño se utiliza el Wide-Range DNA Marker (Sigma-Aldrich), en el que aparecen 16

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Patología Molecular Guion de prácticas

bandas comprendidas entre 50 y 10.000 pb, situándose el producto de amplificación en

torno a 300 pb. Se cargan 5 μL de muestra en cada pocillo.
2. Carrera 1 hora a 110 V, utilizando una fuente de alimentación Consort EV231.
3. Visualizar mediante el sistema de documentación de geles Gel Doc TM XR (Bio Rad). La
visualización fue potenciada mediante la incorporación al gel durante su elaboración del
agente colorante Gel RedTM Nucleic Acid Stain (Biotium).

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Patología Molecular Guion de prácticas

7. MÉTODOS DE INOCULACIÓN CON POTENCIALES AGENTES DE

CONTROL BIOLÓGICO (ACBs)

FUNDAMENTO TEÓRICO

El control biológico consiste en el uso de organismos vivos para controlar poblaciones de

otros organismos. Es un método de control de plagas y fitopatógenos. Este tipo de control
presenta una serie de ventajas, entre las que cabe citar que no se producen efectos colaterales
a otros organismos, el desarrollo de resistencia es considerablemente menor que en el control
químico, la relación existente entre los costes y beneficios es mayor y, por supuesto, no dejan
residuos en cultivos, por lo tanto, no se le asocian problemas de toxicidad.

Los principales y tradicionales métodos que se conocen para la aplicación del control
biológico son:

- Método clásico: se introduce un organismo considerado “enemigo” natural de otro que

causa una plaga o enfermedad y que ha sido introducido en un nuevo ambiente donde dichos
enemigos no se encuentran naturalmente.

- Método de inoculación e inundación: en este caso, se introducen organismos con el

objetivo de que actúen de manera rápida y eficiente, bien comenzando con cantidades
pequeñas de forma periódica, inoculación, o bien introduciendo directamente una gran
cantidad, inundación, para llevar a cabo el control de la enfermedad a largo plazo, pero que se
erradique a corto.

- Método de conservación: es un método que se usa para mantener y fomentar la aparición

de “enemigos naturales” ya presentes. Se lleva a cabo modificando el ambiente para adecuarlo
al crecimiento de los organismos empleados como agentes de control.

El objetivo de esta práctica es aprender a hacer una búsqueda bibliográfica empleando

recursos científicos rigurosos enfocados en el “estado del arte” de los métodos de control
biológico, especialmente respecto a la inoculación de los agentes implicados, para conocer los
tipos de métodos novedosos de aplicación de ACBs y sus ventajas e inconvenientes.

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DESARROLLO PRÁCTICO

Material y medios necesarios

- Ordenador

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