BACTERIOLOGÍA DETERMINATIVA (24981)

PRACTICA No.3.
PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN GÉNERO Bacillus

INTRODUCCIÓN

Reino: Bacteria, filo: Firmicutes, clase: Bacilli, orden: Bacillales, familia: Bacillaceae, género:
Bacillus.

El género Bacillus comprende un grupo de casi 250 especies de bacterianas. Los Bacillus
presentan una morfología bacilar con extremos redondeados o cóncavos, son Gram
positivos, aerobios o anaerobios facultativos, móviles* y productores de esporas1,2. Son
ubicuos en la naturaleza, se encuentran en el suelo, agua, polvo y también hacen parte de
la biota intestinal del humana y animales. Las especies asociadas a enfermedades en
humanos son limitadas y por lo general oportunistas. El patógeno más importante de este
género es el Bacillus anthracis, responsable del carbunco1,2. Otra especie con importancia
clínica es el Bacillus cereus, que se asocia con gastroenteritis, infecciones oculares y sepsis
en pacientes con cateterismo1,2.

OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA

- Observar y describir las características macroscópicas y microscópicas de las especies

de Bacillus.
- Seleccionar y realizar pruebas microbiológicas que permitan la identificación de
Bacillus y sus especies.
- Diferenciar las especies bacterianas según las características bioquímicas.

CONTENIDO DE LA PRÁCTICA

Materiales y reactivos:

- Asa recta y curva - Coloración de Gram

- Gradilla - Coloración de esporas
- Elementos de protección personal - H2O2 al 3%
- Láminas portaobjetos - Reactivo A y B Voges-Proskauer
- Encendedor - Reactivo A y B Nitritos
- Microscopio - Zinc
- Aceite de inmersión - Lugol
- Solución salina estéril

*
Excepto Bacillus anthracis.
- Medios de cultivo: caldo nutritivo, agar mossel, agar leche descremada, agar urea, caldo nitratos,
caldo RMVP, agar almidón, medio de gelatina, agar nutritivo.

TRABAJO DE LABORATORIO

Día # 1:

1. Limpiar, desinfectar y preparar el área de trabajo. Poner un retaso de papel Kraft en el mesón
y trabaje él.
2. A partir de la muestra entregada realizar frotis directo, colorear con Gram, coloración de
esporas y observar al microscopio morfología, agrupación y presencia de esporas. Describa
lo que observa y realice el reporte.
3. Sembrar en los medios agar nutritivo y agar sangre utilizando el método de estrías por
agotamiento.
4. Incubar los medios inoculados a 35°C por 24 horas en aerobiosis.

Día # 2:

5. Luego de 24 horas de incubación, analizar e interpretar el crecimiento microbiano

observado: describir las características macroscópicas, microscópicas y cambios bioquímicos
en el medio.
6. Realice coloración de Gram para observar morfología y agrupación de los cocos y coloración
de esporas.
7. Realice las pruebas de identificación de especies de Bacillus.

Pruebas de identificación de Bacillus

A. Catalasa: los Bacillus producen catalasa por ende las especies de este género son
catalasa-positiva (H2O2 al 3%), aunque algunas especies pueden tener reacciones
variables.

B. Hidrólisis del almodón: determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar el

almidón por medios enzimáticos. El almidón es una clase de carbohidrato de alto peso
molecular con baja solubilidad en agua e insoluble en etanol acuoso y otros solventes
orgánicos. En esta prueba se detecta la presencia de la enzima amilasa, que hidroliza el
almidón obteniendo productos de bajo peso molecular (dextrinas y polímeros)3.

Procedimiento:
1. Tomar una colonia aislada y sembrar en agar almidón (peptona, extracto de carne, NaCl
y agar) en forma de estría central
2. Incubar a 35°C por 18-24 horas.
3. Revelar adicionando al medio gotas de Lugol.

Resultados:
Positivo: Presencia de halos de hidrólisis de almidón ante la adición al medio de solución de Lugol.
Negativo: ausencia de halos

C. Licuefacción de la gelatina: Determinar la capacidad de un microorganismo de producir

enzimas de tipo proteolítico llamadas gelatinasas, que licúan o hidrolizan la gelatina. La
gelatina es una proteína derivada del colágeno animal que se adiciona a medios de cultivo
con el fin de determinar la producción de gelatinasa por un microorganismo 3. Estas
enzimas proteolíticas son importantes factores de virulencia para algunos
microorganismos y son usadas para catabolizar proteínas presentes en el medio a
componentes más pequeños como polipéptidos y aminoácidos, facilitando su transporte
hacia el interior celular.
Procedimiento:
1. Tomar una colonia con asa recta e inocular por picadura a una profundidad de +/- 2 cm
en un medio de gelatina el cual debe permanecer refrigerada hasta que sea el momento
de inocularse.
2. Incubar de 18 – 24 horas a 35°C.
3. Posteriormente almacenar a nevera para realizar la lectura.

D. Agar Mossel: Determinar la capacidad de los microorganismos para producir la enzima

lecitinasa C y actuar sobre la lecitina (yema de huevo) presente en el medio. Para esta
prueba se utiliza el agar mossel que contiene:
- Peptona de carne
- Extracto de carne
- Manitol
- Rojo fenol
- Adición de yema de huevo
- Polimixina B
- Agar

Procedimiento:
1. Tomar una colonia e inocular una caja de agar mossel con una estría central.
2. Incubar a 35°C por 18-24 horas.

Resultados:

Actividad de lecitinasa:
Positiva: halo opaco, opalescente alrededor de las colonias, el precipitado insoluble se observa
mejor al trasluz.
Negativo: no hay formación de halo.

Fermentación del manito:

Positiva: colonias amarillas causadas por la producción de ácido debido a la fermentación del
manitol.
Negativo: no hay cambio de color
Nota:
- La lecitinasa actúa sobre el componente lipoproteico de la yema de huevo. La hidrólisis de la
lecitina libera fósforo y colina en etapas y la precipitación de grasas insolubles produce la
opalescencia
- B. cereus presenta colonias rosadas rodeadas por una zona opaca del mismo color de las colonias.

E. Ureasa: en esta prueba se determina la presencia de la enzima ureasa (constitutiva) que

hidroliza la urea en dos moléculas de amoniaco (NH3), una molécula de agua (H2O) y una
de dióxido de carbono (CO2), que producen alcalinidad en el medio. En solución acuosa
la urea se hidroliza a carbonato de amonio ((NH4)2CO3) como producto final3.

Procedimiento:
1. Tomar una colonia e inocular con estría única en el pico de flauta de un agar urea de
Christensen (peptona, glucosa, rojo de fenol, urea al 40%).
2. Incubar a 35°C por 18-24 horas en aerobiosis.
3. Analizar los resultados.

Resultados:
Positivos: crecimiento bacteriano y cambio de color en el medio a rosa-rojo o rojo-violeta intenso
en el pico de flauta a causa de la alcalinidad.
-La extensión del color hacia la profundidad del medio indica la velocidad de la hidrólisis de la urea
y puede llegar hasta el interior del agar.
Negativo: crecimiento bacteriano, sin cambio de color (amarillo-naranja).

F. Voges Proskauer en caldo RMVP: Determinar la capacidad de los microorganismos para

generar, a partir de la fermentación de la glucosa, un producto final neutro: acetil-
metilcarbinol (AMC, acetoína), o ácido: ácido acético, ácido fórmico, ácido láctico3. El
medio utilizado para esta prueba es el caldo RMVP (rojo metilo Voges-Proskauer) y
contiene:
- Polipeptona
- Glucosa
- Fosfato dipotásico (K2HPO4)

Procedimiento:
1. Tomar una colonia aislada e inocular el caldo RMVP.
2. Incubar a 35°C por 18-24 horas en aerobiosis.
3. Luego de observar el crecimiento, revelar adicionando 6 gotas de α-naftol al 5% (reactivo
A) y mezclar.
4. Adicionar seguidamente 3 gotas de hidróxido de potasio al 40% (reactivo B).
5. Mezclar suavemente durante 30 segundos a 1 minuto de modo que el medio esté
expuesto al oxigeno atmosférico para oxidar la acetoína y obtener una reacción de
cambio de color.
6. Permitir que los tubos reposen durante 15 minutos para exponer al oxígeno antes de
intentar interpretar el color (la reacción generalmente es inmediata).
 Resultados:
Positivo: color rosado-rojo en la superficie del medio (presencia de acetoína).
Negativo: color amarillo en la superficie del medio (similar al color del reactivo). Se puede observar
un color cobrizo, pero es un resultado negativo, resultado de la mezcla de los dos reactivos.

Nota:
- α-naftol al 5%: es un intensificador del color, aumenta la sensibilidad de la prueba sin
disminuir la especificidad.
- KOH al 40%: absorbe el CO2 (agente oxidante)

G. Caldo nitratos: en esta prueba se determina la capacidad de un microorganismo de

reducir los nitratos a nitritos o gas nitrógeno libre por la presencia de la enzima nitrato
reductasa. La reducción del nitrato se manifiesta por la presencia de un producto final
catabólico o la ausencia de nitrato en el medio3.

Procedimiento:
1. Tomar una colonia aislada e inocular en caldo nitratos (extracto de carne, peptona de
gelatina, nitrato de potasio 0,1% (KNO3)).
2. Incubar a 35°C por 24 horas en aerobiosis.
3. Luego de observar crecimiento, revelar adicionando 6 gotas del reactivo de nitratos A
(α-naftilamina 0,5%) y 6 gotas de reactivo B (ácido sulfanílico 0,8%).
4. Agitar con suavidad para mezclar los reactivos. Los resultados se observan de 1 a dos
minutos.

Resultados:
Positivo: se genera un color rosa a rojo oscuro en 1-2 minutos indicando que el nitrato fue reducido
a nitrito.
Negativo: no hay cambio de color, el nitrito no está presente.

Nota: en el caso de tener un resultado negativo se debe continuar con el siguiente procedimiento:

1. Adicionar al tubo con reacción negativa que tiene los reactivos A y B, una pizca de polvo de
zinc (ZN, aproximadamente 20 mg).
2. Esperar por 5-10 minutos y leer la prueba.

Positivo: ausencia de color, confirma reducción de nitrato a nitrito, este último fue reducido a
productos no gaseosos, desnitrificación (N2).
Negativo: aparición de color rosa a rojo oscuro en 5-10 minutos. Confirma el resultado negativo
obtenido en con la adición de los reactivos A y B ya que se detecta la presencia de Nitrato en el
medio. El color rojo es producido por la reducción de nitratos por la adición del con

H. Hidrólisis de la caseína: Esta prueba permite determinar la hidrolisis de la caseína por

microorganismos aerobios. La caseína es la proteína de la leche que proporciona su color
blanco y es hidrolizada por una proteasa bacteriana liberada al medio llamada caseinasa.
 Procedimiento:
1. Tomar una colonia y sembrar como estría en zigzag en un agar leche descremada
(caseína) que contiene: caldo nutritivo deshidratado (0,8% p/v), Leche descremada en
polvo (2,5% p/v), agar (1,5% p/v), pH 7.0.
2. Incubar a 35°C por 24 – 48 horas.

Resultados:
Positivo: formación de halos transparentes alrededor de las colonias por hidrolisis de la caseína.
Negativo: no se forman halos.

I. Determinación de la susceptibilidad a antibióticos: permite la determinación del perfil

de susceptibilidad de un microorganismos identificado. Los Bacillus spp. son encontrados
frecuentemente como contaminantes en cultivos; sin embargo, la evaluación de
aislamientos de bacterias de este género a partir de fuentes que son naturalmente
estériles, como cultivos de sangre, tejido profundo e implantes dispositivos prostéticos,
debe realizarse especialmente en pacientes inmunosuprimidos1,2.

Los agentes antimicrobianos utilizados para las pruebas de susceptibilidad para especies de
Bacillus spp. (excepto B. anthrasis) según el consenso publicado por CLSI† son (ver tabla 1)4.

- Antibióticos de evaluación primaria y reporte: vancomicina, fluoroquinolonas y clindamicina.

- Antibióticos evaluados: penicilina, ampicilina, cefazolina, cefotaxima, ceftriaxona, imipenem,

amikacina, gentamicina, eritromicina.

†
CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute.
Tabla 1. Información y criterios de interpretación para el método de determinación de sensibilidad antimicrobiana por dilución ‡4.

MIC: concentración mínima inhibitoria

‡
Tabla tomada del CLSI M45-A24.
Tabla 2. Pruebas de identificación para especies género Bacillus. (Investigue y complete la tabla 2 como apoyo para el laboratorio de
lectura de pruebas).
Infecciones en
Morfología Ubicación Voges Actividad Crecimiento Hidrólisis
Especie humanos/animales/ Catalasa Motilidad Crecimiento
de Espora espora Proskauer lecitinasa 50°C almidón
habitad 60°C

B. cereus

B. subtilis

B. polymyxa

G.
stearothermophilus

B. thuringiensis

B. anthracis

B. megaterium

B. licheniformis

B. firmus
 Continuación tabla 2.

Reducción Hidrolisis Fermentación de azucares

Especie
nitratos gelatina Glucosa Xilosa Manitol Lactosa Sacarosa Maltosa Salicina

B. cereus

B. subtilis

B. polymyxa

G. stearothermophilus

B. thuringiensis

B. anthracis

B. megaterium

B. licheniformis

B. firmus
BIBLIOGRAFA

1. Murray, P., Rosenthal, K. y Pfaller, M. (2014). Microbiología médica. Barcelona: Elsevier.

Edición 7, capítulo 21.
2. Ryan, K., Ray, C. y Sherris, J. (2017). Microbiología médica Sherris. Nueva York: McGraw Hill
Medical. Edición 6, capítulo 26.
3. MacFaddin J.F. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de
importancia clínica. 3era Edición. Médica Panamericana. Capítulo 12, 30, 38, 39, 40.
4. CLSI, (2016). M45: Methods for antimicrobial dilution and disk susceptibility testing of
infrequently isolated or fastidious bacteria; approved guideline.