CONICET Digital Nro. A

PRÓLOGO
Esta Guía Teórico-Práctica se propone brindar los conocimientos básicos

metodológicos utilizados actualmente en el diagnóstico clínico y en el área de la
investigación científica.
Consideramos además que puede ser de utilidad como fuente de consulta para el
graduado.
En esta nueva edición buscamos integrar más estrechamente los contenidos teóricos
de la asignatura con los contenidos prácticos. Es clave para formar las competencias
profesionales el “saber hacer reflexivo”, con marcos teóricos que sustenten las prácticas y
que permitan analizar con criterio sus resultados. Los contenidos específicos de
Inmunología están desarrollados en trabajos prácticos que acompañan las unidades del
programa de la asignatura. Se enseñan diferentes metodologías que se utilizan en el
diagnóstico inmunológico de enfermedades, el desarrollo de pruebas inmunodiagnósticas o
en el diseño de estrategias inmunoquímicas para la caracterización y/o purificación de
macromoléculas de interés inmunológico.
Esta guía contiene además tres apéndices. El primero, Bioseguridad, para que el
alumno adquiera las buenas prácticas de seguridad en el laboratorio puesto que tendrá
contacto con materiales potencialmente patógenos. El segundo, referido al manejo
adecuado de pipetas ya que es importante tener ciertos recaudos al realizar mediciones de
volúmenes para conseguir resultados confiables y reproducibles. El tercero es una
introducción a la microscopía de fluorescencia, metodología de amplia aplicación, no solo en
la clínica sino también en investigación. A continuación, presenta un Glosario que facilitará
al alumno acceder a definiciones breves y rápidas de conceptos tratados durante el dictado
de los trabajos prácticos. Finalmente, se acompaña de una Bibliografía para que puedan
consultar y ampliar los contenidos desarrollados.
Esperamos que este trabajo docente sea de suma utilidad para nuestros alumnos y
egresados de la carrera de Bioquímica.
Los autores.
ÍNDICE
UNIDAD 1: CONCEPTOS INTRODUCTORIOS

REACCIONES DE INTERACCIÓN PRIMARIA Y SECUNDARIA PARA LA INVESTIGACIÓN DE
ANTÍGENOS 3
Trabajo Práctico N° 1 15
Primera parte: Investigación de antígeno por ELISA directo (“sándwich”). 15
Segunda parte: Investigación de antígenos hemáticos por aglutinación. 17
Modelo de informe. 19
UNIDAD 2: EL SISTEMA INMUNE INNATO

EL SISTEMA COMPLEMENTO EN LA RESPUESTA INNATA 21
Trabajo Práctico N° 2: Valoración de la vía alterna del complemento en unidades
hemolíticas 50 % (AH50). 26
UNIDAD 3: EL SISTEMA INMUNE ADAPTATIVO

REACCIONES DE INTERACCIÓN SECUNDARIA Y PRIMARIA PARA LA INVESTIGACIÓN DE
ANTICUERPOS 31
Primera parte: Semicuantificación de anticuerpos por aglutinación rápida en placa 41
(ARP).
Segunda parte: Semicuantificación de anticuerpos por aglutinación lenta en tubo (ALT). 43
Tercera parte: Identificación y semicuantificación de anticuerpos por hemaglutinación
indirecta (HAI). 44
Técnica de screening. 45
Técnica de titulación. 47
Cuarta parte: Investigación de anticuerpos por ELISA. 48
IDENTIFICACIÓN DE POBLACIONES CELULARES POR INMUNOFLUORESCENCIA 53
Trabajo Práctico N° 4: Identificación de LT colaboradores por inmunofluorescencia
indirecta. 63
MECANISMOS EFECTORES DE LA RESPUESTA ADAPTATIVA FRENTE A LOS
DISTINTOS TIPOS DE ANTÍGENOS 67
Primera parte: Valoración de la vía clásica del complemento en unidades hemolíticas 50
% (CH50). 70
Segunda parte: Valoración de la fracción C3 o C4 por inmunodifusión radial cuantitativa
(IDRC). 77
UNIDAD 4: INMUNIZACIÓN ACTIVA Y PASIVA
INMUNIZACIÓN ACTIVA Y PASIVA 79
Primera parte: Producción de anticuerpos en animales de laboratorio. 93
Segunda parte: Purificación de IgG a partir de plasma. 96
UNIDAD 5: EL SISTEMA INMUNE EN PATOLOGÍAS Y RECHAZO DE

TRASPLANTES
REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD 99
Primera parte: Anafilaxia cutánea pasiva (ACP). 107
Segunda parte: Identificación de anticuerpos anti-Rh por reacción de Coombs indirecta. 109
AUTOINMUNIDAD 113
Trabajo Práctico N° 8: Investigación de anticuerpos antinucleares por
inmunofluorescencia indirecta. 118
INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS 121
Primera parte: Semicuantificación de isoaglutininas por aglutinación lenta en tubo. 124
Segunda parte: Valoración de inmunoglobulinas por inmunodifusión radial cuantitativa
(IDRC). 125
INMUNODEFICIENCIAS SECUNDARIAS 127
Trabajo Práctico N° 10: Investigación de anticuerpos por western blot. 131
APÉNDICE I: BIOSEGURIDAD 139

APÉNDICE II: MANEJO EN EL LABORATORIO 145
APÉNDICE III: CONCEPTOS BÁSICOS DE MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA 153
GLOSARIO 157
BIBLIOGRAFÍA 175
TRABAJOS
PRÁCTICOS
UNIDAD 1 Guía Teórico-Práctica de Inmunología
Conceptos Introductorios UNS
REACCIONES DE INTERACCIÓN PRIMARIA Y SECUNDARIA

PARA LA INVESTIGACIÓN DE ANTÍGENOS
ANTÍGENO
Se define como antígeno a toda sustancia capaz de unirse a los anticuerpos, al
receptor de membrana del linfocito B (LB, ver Glosario) o BCR o, al receptor de membrana
del linfocito T (LT, ver Glosario) o TCR.
Entre las características de los antígenos (ver Glosario) se pueden mencionar a la
reactividad y a la inmunogenicidad. La reactividad hace referencia a la capacidad de unirse
de manera complementaria a los productos de una respuesta inmune (ver Glosario). La
inmunogenicidad, se refiere a la capacidad de generar una respuesta inmune en un ser
vivo. Esta propiedad es variable para los diferentes antígenos y depende de factores
inherentes al mismo (composición química, tamaño molecular, carácter de no propio,
heterogeneidad en la composición química, degradabilidad, estado físico) y de otros que no
dependen de él (dosis y vía de administración, genotipo del receptor, adyuvantes). Si bien
la reactividad es una característica general en un antígeno, puede ocurrir que no esté
acompañada de la inmunogenicidad. No siempre un antígeno es a la vez un inmunógeno.
Entonces, el inmunógeno genera una respuesta inmune y además reacciona con los
productos de dicha respuesta in vitro; en cambio un antígeno interacciona con los productos
de la respuesta inmune aunque no necesariamente puede generarla.
En cuanto a la composición química, los antígenos pueden ser proteínas,
polisacáridos, lípidos o ácidos nucleicos. Los más inmunogénicos son las proteínas debido a
la complejidad química que presentan. Los polisacáridos de alto peso molecular suelen
también ser buenos inmunógenos. Los lípidos y ácidos nucleicos son los menos
inmunogénicos, pero asociados a proteínas o hidratos de carbono aumentan su poder de
generar una respuesta inmune.
Los haptenos (ver Glosario) son pequeñas moléculas o grupos químicos que pueden
ser reconocidos por el BCR (por lo que son antígenos), pero son incapaces de inducir una
respuesta inmune (no son inmunógenos). Pueden adquirir inmunogenicidad al asociarse
covalentemente a una molécula transportadora o carrier de mayor peso molecular,
3
generalmente una proteína. Podemos mencionar entre ellos al DNP (dinitrofenol), TNP
(trinitrofenol) y algunos fármacos.
Determinantes antigénicos y epitopes

De toda la estructura de un antígeno sólo pequeñas zonas o regiones, llamadas
determinantes antigénicos o epitopes (Figura 1) (ver Glosario) son reconocidas por el
sistema inmune y generan una respuesta adaptativa dirigida específicamente hacia ellas.
Cuando se trata de una proteína, un epitope tiene una extensión de 5-6 aminoácidos
relacionados; en el caso de un polisacárido son 5-6 unidades de hexosas.
EPITOPE
EPITOPE ANTÍGENO EPITOPE
EPITOPE
Figura 1: Representación esquemática de un antígeno con cuatro epitopes diferentes.
El epitope es la zona del antígeno que interactúa de manera complementaria con el

paratope (sitio de unión o área de reconocimiento específico, ver Glosario) de un
anticuerpo. También se utiliza el término epitope para hacer referencia al área de una
proteína que da lugar a los péptidos que reconocen los receptores de los LT.
El número de epitopes que presenta un antígeno se denomina valencia (ver
Glosario). Pueden existir antígenos monovalentes (cuando hay un solo sitio de unión) o
multivalentes (cuando tiene más de uno).
Según la disposición espacial, un epitope puede ser conformacional (discontinuo) o
lineal (continuo). El primero está constituido por aminoácidos separados en la estructura
primaria, pero próximos en la conformación tridimensional. Los segundos están formados
por aminoácidos contiguos en la estructura primaria (Figura 2).
4
EPITOPE EPITOPE
CONFORMACIONAL LINEAL
Figura 2: Representación esquemática de un epitope conformacional y un epitope lineal.
CLASIFICACIÓN DE ANTÍGENOS
Existen distintas formas de clasificar a los antígenos. Según el estado físico, se
pueden clasificar en particulados (formes) o solubles. Los primeros son suspensiones de
células o partículas. Como ejemplos se pueden mencionar suspensiones de bacterias,
glóbulos rojos, células, etc. Los segundos son soluciones de macromoléculas, tales como
una solución de proteínas o hidratos de carbono.
Otra forma de clasificar a los antígenos es en timo-dependientes (ver Glosario, ej.:
antígenos proteicos, haptenos fijados a proteínas, etc.) o timo-independientes (ver
Glosario, ej.: poliósidos, lipopolisacáridos, flagelina polimerizada, etc.). En cada caso la
clase de respuesta inmune que se genera frente a ellos es distinta según participen o no los
LT.
INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO IN VITRO

En la interacción in vitro de un antígeno con su correspondiente anticuerpo se
distinguen dos etapas, la reacción primaria (ver Glosario) no visualizable y la reacción
secundaria (ver Glosario), que sigue a la anterior y se caracteriza por la aparición de un
fenómeno visible como la precipitación o aglutinación (ver Glosario).
Interacción primaria
Cuando se pone en contacto un antígeno y su anticuerpo específico
(complementario), se forman rápidamente complejos no visualizables. La variación de la
temperatura y de la concentración salina tiene muy poca influencia en la formación de estos
complejos. Esta reacción se llama de interacción primaria.
5
Las técnicas de interacción primaria permiten la identificación de antígenos o

anticuerpos que, por su baja concentración o por sus características fisicoquímicas
(anticuerpos monovalentes, haptenos), no pueden detectarse a través de técnicas de
interacción secundaria.
Las técnicas de interacción primaria se caracterizan porque la identificación del
antígeno o del anticuerpo tiene lugar por interacción simple entre el antígeno y el
anticuerpo, sin la participación de fenómenos asociados como se verá que ocurre en las
técnicas de interacción secundaria.
Si bien la interacción primaria antígeno-anticuerpo no es visible, existen métodos que
hacen posible la visualización. Esto se consigue al emplear el antígeno o el anticuerpo
marcado, hecho que, además, incrementa la sensibilidad de la técnica. Para marcar un
antígeno o un anticuerpo pueden utilizarse distintas sustancias. Según la naturaleza de
éstas, la técnica recibe distintos nombres:
Enzimoinmunoensayo: cuando se emplea una enzima.
Inmunofluorescencia: cuando se usa un fluorocromo.
Radioinmunoensayo: cuando se utiliza un radioisótopo.
La elección de la técnica dependerá de las características de la sustancia a investigar
o cuantificar y de las condiciones del laboratorio con las que se cuenten. En el caso de
tratarse de biomoléculas solubles presentes en baja concentración en los líquidos
biológicos, se pueden emplear tanto los enzimoinmunoensayos como los
radioinmunoensayos.
En estos tipos de ensayos, la inmunomarcación empleando anticuerpos conjugados
(anticuerpo unido a una marca, ver Glosario) permite detectar antígenos. La misma puede
ser directa o indirecta.
Inmunomarcación directa: emplea un anticuerpo marcado que se une directamente
al antígeno en estudio presente en la muestra analizada (Figura 3).
6
ANTICUERPO MARCADO
ANTÍGENO
SOPORTE CÉLULA
Figura 3: Esquema de inmunomarcación directa.
Inmunomarcación indirecta: emplea un anticuerpo sin marca (primario) que

reconoce al antígeno de interés y luego un anticuerpo marcado (secundario) capaz de
reconocer al primario (una anti-inmunoglobulina marcada) (Figura 4).
ANTICUERPO
SECUNDARIO
MARCADO
ANTICUERPO
PRIMARIO
ANTÍGENO
SOPORTE CÉLULA
Figura 4: Esquema de Inmunomarcación indirecta
Las técnicas que utilizan la inmunomarcación son más sensibles que aquellas que se
basan en interacciones secundarias. Por otra parte, cabe tener en cuenta que la
inmunomarcación directa necesita de un anticuerpo primario marcado para cada antígeno a
detectar (lo que implica un costo económico relativo mayor). En cambio, en una
inmunomarcación indirecta, si bien se necesitan dos anticuerpos (primario y secundario), el
anticuerpo secundario marcado puede reconocer distintos anticuerpos primarios generados
en la misma especie, y en consecuencia pueden utilizarse en varios ensayos.
7
Técnicas inmunoenzimáticas
Las técnicas inmunoenzimáticas (EIA) se basan en la marcación de antígenos o de
anticuerpos con enzimas para la posterior detección de la interacción específica mediante
el agregado de un sustrato cromogénico.
El uso de enzimas como marcadores capaces de proveer una señal potente mediante
su actividad catalítica, resulta ventajoso respecto a otros métodos, como es el caso de los
inmunoradiométricos. A diferencia de estos últimos, las técnicas inmunoenzimáticas no
requieren de la manipulación de isótopos radioactivos, ni de un operador experto, así como
tampoco una habilitación especial del laboratorio. Los conjugados enzimáticos mantienen su
actividad biológica por períodos prolongados cuando son correctamente conservados. El
instrumento de lectura no es tan costoso como en las técnicas inmunoradiométricas, con la
ventaja adicional de que los métodos inmunoenzimáticos tienen límites de detección tan
bajos como los métodos inmunoradiométricos.
Por todos estos motivos estas técnicas son ampliamente utilizadas en la
cuantificación de distintos tipos de sustancias como fármacos, hormonas, citoquinas,
mediadores de inflamación, metabolitos tóxicos, etc.
Clasificación de los enzimoinmunoensayos

Se debe considerar que en la bibliografía aparecen diversas nomenclaturas para
referirse a los inmunoensayos. Una primera clasificación en técnicas homogéneas o
heterogéneas se relaciona con la inmovilización o no de los inmunoreactantes. Las
técnicas homogéneas se realizan en fase líquida en cambio las heterogéneas emplean un
soporte sólido para inmovilizar a uno de los inmunoreactantes.
Este Trabajo Práctico sólo se referirá a las heterogéneas, puesto que son las de
mayor uso, y particularmente al ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) que
presenta gran simplicidad y versatilidad.
ELISA
En esta técnica la actividad de la enzima empleada como marca no es afectada por
la reacción antígeno-anticuerpo. Es indispensable contar con una o más etapas de
separación entre reactivos unidos y reactivos libres. Esta situación se resuelve de forma
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simple mediante una fase sólida en la que se inmoviliza uno de los inmunoreactantes lo
que permite eliminar los reactivos no unidos (mediante lavados) luego de cada etapa de
incubación. La prueba de ELISA puede emplearse para la detección de antígenos o
anticuerpos.
ELISA para identificar y semicuantificar antígenos

Las técnicas que permiten el estudio de antígenos se conocen con el nombre de
ELISA "sándwich" o ELISA de captura.
El primer paso que se realiza es la sensibilización. En este caso, consiste en la
unión a una fase sólida de un anticuerpo específico para el antígeno de interés. La fase
sólida puede ser de poliestireno, cloruro de polivinilo, nylon, etc. Este anticuerpo específico
es el responsable de capturar al antígeno de la muestra. El origen de dicho anticuerpo es
generalmente monoclonal para aumentar la especificidad del ensayo.
Para la detección del complejo anticuerpo-antígeno capturado se pueden utilizar
anticuerpos monoclonales (ver Glosario) o antisueros policlonales (ver Glosario) marcados
(Figura 5A). Cuando el anticuerpo de captura es monoclonal, se puede emplear otro
anticuerpo monoclonal marcado que reconozca un epitope diferente al que reconoce el
anticuerpo de captura, o el mismo epitope si se sabe que éste se encuentra alejado y
repetido como mínimo dos veces en la molécula. El uso de un antisuero policlonal marcado
asegura un reconocimiento amplio a través de múltiples epitopes del antígeno.
En caso de emplear un anticuerpo sin marca para la detección del complejo
anticuerpo-antígeno capturado (Figura 5B), es necesario contar con un antisuero policlonal,
ahora marcado, dirigido contra las inmunoglobulinas de la especie a la que pertenece el
primer anticuerpo. Además, este primer anticuerpo sin marcar debe ser obtenido en una
especie diferente de aquella en la que se obtuvo el anticuerpo de captura para evitar que el
segundo anticuerpo marcado reconozca a dicho anticuerpo. Un ejemplo que aplica el diseño
de la Figura 5B utilizaría: un anticuerpo de captura monoclonal anti-antígeno, un anticuerpo
primario sin marca anti-antígeno (antisuero policlonal) obtenido en cabra, un anticuerpo
secundario marcado anti-inmunoglobulinas de cabra (antisuero policlonal) obtenido en
conejo.
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A Anticuerpo Anti-Inmunoglobulina B
marcado con enzima
Anti-Antígeno marcado
con enzima
Antígeno en estudio
Anticuerpo de captura
Figura 5: Distintos diseños de ELISA para la determinación de antígenos.
La etapa de bloqueo sigue a la de la sensibilización. Con este fin se emplean

soluciones de proteínas ajenas al sistema evaluado. Dichas proteínas ocupan los sitios
libres a los que no se ha fijado el antígeno en la etapa previa. Esto evita las uniones
inespecíficas en etapas posteriores de incubación con los anticuerpos. Las soluciones de
bloqueo más comúnmente utilizadas son las de proteínas de la leche, albúmina o gelatina.
Luego de cada etapa de incubación y para eliminar los inmunoreactantes no unidos o
unidos inespecíficamente se realizan lavados con una solución buffer que contenga un
agente tensioactivo (un detergente no iónico como el Tween-20).
Como diluyente de los sueros y conjugados deben emplearse soluciones buffer que
contengan Tween-20 y proteínas ajenas al sistema en estudio, las que competirán con
dichos inmunoreactantes por los sitios de unión inespecíficos en los componentes
inmovilizados en la fase sólida.
Para la detección de la actividad enzimática se puede optar por el uso de diferentes
soluciones de revelado. Estas soluciones contienen una sustancia cromogénica o
cromógeno (ver Glosario) responsable de la producción de un compuesto coloreado
soluble en el medio de reacción. Existen disponibles diferentes enzimas (peroxidasa,
fosfatasa alcalina, etc.) y sus respectivos sustratos cromogénicos (ortofenilendiamina,
fenilendiamina, trimetilbencidina, nitroazul de tetrazolio, entre otros). Una de las enzimas
más utilizadas es la peroxidasa, en este caso, proveniente de la raíz del rábano picante
(HRP). Esta enzima cataliza una reacción de óxido-reducción donde la sustancia
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cromogénica (DH) funciona como donante de electrones y el peróxido de hidrógeno como

aceptor de los mismos. La reacción general catalizada puede escribirse como:
2 DH + H2O2 2 H2O + 2 D (cromógeno oxidado coloreado)
En resumen, los pasos de la técnica son:

 Inmovilización del inmunoreactante (anticuerpo de captura) en la fase sólida
(sensibilización).
 Incubación con la muestra (antígeno) para permitir que ésta reaccione con el
inmunoreactante inmovilizado.
 Amplificación o modulación por medio del empleo de un conjugado enzimático
(esta etapa puede comprender, en realidad, más de un paso).
La lectura de los resultados se puede efectuar de forma visual o instrumental. En la
primera se comparan los colores finales de la reacción de la muestra con los colores de los
controles positivo y negativo (ver Glosario). Este tipo de lectura sólo es válido para
determinaciones cualitativas. En la segunda se emplean lectores de absorbancia. Son
fotómetros manuales, semiautomáticos o totalmente automatizados que trabajan a una
cierta longitud de onda. Según el equipo disponible será posible medir la absorbancia,
definir un resultado como positivo o negativo, o establecer un valor con determinadas
unidades. Este tipo de lectura se emplea tanto en determinaciones cualitativas como
cuantitativas.
La expresión de los resultados puede diferir para los distintos sistemas
antígeno/anticuerpo y fabricantes de kits comerciales. En las determinaciones cualitativas
de lectura instrumental es indispensable obtener previamente el valor de corte (cut off, ver
Glosario), que permite definir a una muestra como positiva o negativa. Una de las formas
de calcular este valor de corte es leer la absorbancia de 30 muestras negativas como
mínimo, promediarlas y calcular el desvío estándar (DS).
DS =
 x  m
i
2
n 1
Donde n es el número de muestra negativas analizadas, m es la media aritmética y xi

es la reactividad de cada muestra.
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El valor de corte (X) estará determinado por: X = XAbs + (3 x DS)

Generalmente, en los equipos comerciales el fabricante indica cómo se calcula este
valor.
Interacción secundaria
En las reacciones de interacción secundaria los complejos antígeno-anticuerpo
generados en la interacción primaria se agregan para dar diferentes fenómenos visibles.
Estas reacciones se aceleran con la temperatura, la agitación y la concentración de
electrolitos.
Para que una reacción primaria, progrese a secundaria deben cumplirse los
siguientes requisitos: antígeno multivalente, anticuerpo bivalente como mínimo,
concentraciones adecuadas de antígeno y anticuerpo.
Los fenómenos de interacción secundaria se visualizan de manera diferente según el
estado físico del antígeno. Cuando un anticuerpo se pone en contacto con su antígeno
particulado específico (hematíes, bacterias, parásitos, células) se observará el fenómeno de
interacción secundaria llamado aglutinación (ver Glosario). Si el anticuerpo interactúa con
su antígeno soluble específico (proteínas, polisacáridos) se observará el fenómeno de
precipitación (ver Glosario).
Para que se formen los complejos las proporciones de ambos deben ser las
adecuadas según lo propuesto en la Teoría del enrejado o de Marrack. Estos complejos
forman una red que estará integrada por varias moléculas de anticuerpo interactuando
simultáneamente con varios determinantes antigénicos presentes en la misma molécula de
antígeno y a su vez cada sitio activo de la molécula de anticuerpo uniéndose con
determinantes antigénicos presentes en moléculas diferentes de antígeno. Cuando la masa
de la red de complejos antígeno-anticuerpo formados supera las fuerzas que los mantiene
en solución, caen por su propio peso y se observan grumos en la aglutinación o
precipitado en la precipitación.
Reacciones de precipitación
Se utilizan para investigar antígeno o anticuerpo, dependiendo de cuál sea el
inmunoreactante conocido.
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Las reacciones de precipitación, cualitativas, semicuantitativas o cuantitativas

pueden realizarse en medio líquido o gelosado. Estas reacciones se estudiarán con mayor
profundidad en otros Trabajos Prácticos.
Reacciones de aglutinación
También son útiles para investigar antígeno o anticuerpo. De acuerdo a las
características de las partículas aglutinantes, las reacciones de aglutinación pueden
clasificarse como reacciones de aglutinación directa o reacciones de aglutinación indirecta
(pasiva). Las reacciones de aglutinación directa se basan en el empleo de una partícula
aglutinante como antígeno. Un ejemplo de este tipo de reacciones es la determinación de
grupo sanguíneo y factor Rh, donde los glóbulos rojos son los antígenos en estudio
(investigación de antígenos eritrocitarios del sistema ABO y D). Las reacciones de
aglutinación indirecta o pasiva se basan en el empleo de una partícula aglutinante
inmunológicamente inerte a la cual se le ha unido un antígeno soluble.
La aglutinación puede realizarse en forma cualitativa o semicuantitativa. Los
métodos cualitativos son utilizados para investigar la presencia de un antígeno o anticuerpo.
Por ejemplo, se puede mencionar para el caso de antígeno la investigación de una bacteria
en un líquido biológico o la determinación de grupos sanguíneos.
Antígenos hemáticos: Sistemas ABO y Rh

Los antígenos del sistema ABO surgen de una familia de glucolípidos presentes en la
superficie del eritrocito. Su estructura básica consiste en el lípido ceramida unido a un
oligosacárido formado por glucosa (Glu), galactosa (Gal), N-acetilgalactosamina (NAcG),
galactosa y fucosa (Fuc). En las personas de grupo O, éste es el único glucolípido que se
forma. La persona de grupo sanguíneo A tiene la enzima que puede agregar una N-
acetilgalactosamina adicional para formar el antígeno A, mientras que las personas de
grupo sanguíneo B tienen una enzima que puede agregar una galactosa adicional a la
estructura básica y formar así el antígeno B (Figura 6).
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NAcG Gal
Fuc Gal Fuc Gal Fuc Gal
NAcG NAcG NAcG
Gal Gal Gal
Glu Glu Glu
CERAMIDA CERAMIDA CERAMIDA
GLUCOLÍPIDO BASE ANTÍGENO A ANTÍGENO B
Figura 6: Composición de los isoantígenos del sistema ABO.
El sistema Rh contempla cinco antígenos de los cuales el antígeno D es el de mayor

inmunogenicidad. Su presencia es la que establece que un individuo sea Rh positivo. Está
constituido por numerosos epitopes. Contiene 12 dominios transmembrana de tipo
hidrofóbicos, 6 loops extracelulares, un extremo N-terminal intracitoplasmático y un extremo
C-terminal también intracitoplasmático (Figura 7).
Figura 7: Esquema de la ubicación del antígeno D en la membrana de los hematíes.
Para la determinación de los antígenos hemáticos del sistema ABO se emplean

anticuerpos monoclonales específicos de la clase IgM. Dado que la IgM tiene 5 sitios de
unión al antígeno, se favorece la formación de la red de Marrack que conduce a la
aglutinación de los glóbulos rojos. En el caso de la determinación del antígeno D se emplea
una mezcla de anticuerpos monoclonales de clases IgM e IgG.
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TRABAJO PRÁCTICO N° 1
Primera parte
Investigación de antígeno por ELISA directo (“sándwich”)
FUNDAMENTO:
La interacción del antígeno presente en la muestra a investigar con un anticuerpo
específico para dicho antígeno, inmovilizado sobre un soporte sólido, puede ponerse en
evidencia por medio de un segundo anticuerpo, específico para el antígeno, conjugado con
una enzima cuya actividad produce una reacción de color visible cuando se agrega el
sustrato correspondiente.
OBJETIVO:
 Investigación del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) en un suero.
MUESTRA A ANALIZAR:
 Suero humano.
REACTIVOS Y MATERIALES:
 Placas de poliestireno sensibilizadas con el anticuerpo anti-HBs.
 Buffer de lavado: buffer salino con tensioactivo.
 Conjugado concentrado: anticuerpo anti-HBs conjugado con peroxidasa (dilución de
trabajo: 1 parte de conjugado concentrado + 50 partes de diluyente de conjugado)
 Diluyente de conjugado: buffer Tris.
 Reactivo revelador: Tetrametilbencidina (TMB) en buffer citrato con el agregado de
peróxido de hidrógeno.
 H2SO4 2 N.
 Control positivo: suero inactivado reactivo para HBsAg.
 Control negativo: suero inactivado no reactivo.
 Pipetas automáticas y tips.
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PROTOCOLO:
 En los pocillos de la policubeta a utilizar colocar:
Blanco Control (-) Control (+) Muestra
- 100 μl 100 μl 100 μl
 Cubrir la policubeta con cinta adhesiva para evitar la evaporación.

 Incubar en estufa a 37 °C durante 60 min.
 *Aspirar cuidadosamente el líquido de cada pocillo, desechándolos en un recipiente que
contenga hipoclorito de sodio al 5 %.
 **Lavar 4 veces durante 2 min con buffer de lavado (350 μl/pocillo cada vez).
 ***Al finalizar el último lavado secar cuidadosamente la policubeta, invirtiéndola sobre
papel absorbente.
 Agregar 100 μl del conjugado a todos los pocillos.
 Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante 10 s.
 Cubrir con cinta adhesiva e incubar 30 min en estufa a 37 °C.
 Repetir los pasos *, ** y ***.
 Agregar 100 μl del reactivo revelador (preparado adecuadamente) a todos los pocillos.
 Incubar 30 min a temperatura ambiente protegido de la luz.
 El color desarrollado será celeste.
 Agregar 100 μl de H2SO4 2 N para frenar la reacción, a todos los pocillos (el color
celeste virará a color amarillo).
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN:
La lectura de los resultados se realiza con espectrofotómetro a 450 nm dentro de los
5 a 30 min de finalizada la reacción.
Se debe calcular el valor de corte de la siguiente manera:
Cut off = CN + 0,060; donde CN = Promedio de las absorbancias del control (-).
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Se considera:
Resultado Absorbancia de la muestra
Reactivo ≥ cut off
No reactivo < cut off
NOTA:
 Todos los reactivos y muestras a investigar deben estar a temperatura ambiente antes
de iniciar la prueba.
 Es importante en las etapas de lavado no dejar que los pocillos se sequen durante el
procedimiento.
Segunda parte
Investigación de antígenos hemáticos por aglutinación
FUNDAMENTO:
La aglutinación se produce cuando un anticuerpo conocido es puesto en contacto con
su antígeno particulado específico (hematíes, bacterias, parásitos, células) en un medio
salino adecuado. En este caso particular, anticuerpos dirigidos contra antígenos expresados
en la membrana de los glóbulos rojos interaccionan con ellos y forman complejos antígeno-
anticuerpo que se visualizan en forma de grumos.
OBJETIVO:
 Tipificación de antígenos hemáticos.
MUESTRA A ANALIZAR:
 Sangre entera recolectada con citrato, oxalato o heparina como anticoagulante.
 Reactivos preparados a partir de anticuerpos monoclonales: anti-A, anti-B y anti-D.
 Portaobjetos.
 Varillas mezcladoras.
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 Lámparas.
PROTOCOLO:
 Colocar en un portaobjeto una gota de reactivo anti-A y una gota de sangre entera.
Mezclar con varilla y balancear el portaobjetos durante 2 min. Observar si hay o no
aglutinación.
 Colocar en un portaobjeto una gota de reactivo anti-B y una gota de sangre entera.
Mezclar con varilla y balancear el portaobjetos durante 2 min. Observar si hay o no
aglutinación.
 Colocar en un portaobjeto una gota de reactivo anti-D y una gota de sangre entera.
Mezclar con varilla y balancear el portaobjetos durante 2 min. Acercar cuidadosamente
el portaobjeto a una fuente de calor. Observar si hay o no aglutinación.
La aglutinación o no de los glóbulos rojos ensayados frente a cada uno de los
reactivos indica la presencia o ausencia de los correspondientes antígenos en la membrana
de los mismos.
Aglutinación con
Grupo sanguíneo Suero anti-A Suero anti-B
A Positivo Negativo
B Negativo Positivo
AB Positivo Positivo
O Negativo Negativo
Factor Suero anti-D
Rh negativo Negativo
Rh positivo Positivo
NOTA:
 Los reactivos y las muestras deben hallarse a temperatura ambiente para evitar
aglutinaciones inespecíficas.
18
 No prolongar la lectura del ensayo luego de los 2 min para evitar que los
inmunoreactantes se sequen por evaporación.
MODELO DE INFORME
Primera parte: Investigación de antígeno por ELISA directo (sándwich)
Objetivo:
Sistema:
Resultado:
Interpretación:
Segunda parte: Investigación de antígenos hemáticos por aglutinación

Objetivo:
Sistema:
Resultado: Grupo …. Factor ….
Interpretación:
19
El Sistema Inmune Innato UNS
EL SISTEMA COMPLEMENTO EN LA RESPUESTA INNATA
EL SISTEMA INMUNE INNATO

La inmunidad innata (ver Glosario) contribuye a la erradicación del foco infeccioso
por mecanismos humorales y celulares. Estos mecanismos, establecidos aún antes de
contraerse la infección, están preparados para responder con rapidez una vez que ésta se
produce.
Los principales componentes de la inmunidad innata son:
 Barreras físicas y químicas (piel, secreciones mucosas).
 Células fagocíticas (neutrófilos, macrófagos) y células NK.
 Proteínas sanguíneas (sistema complemento y otros mediadores de la
inflamación).
 Citoquinas que regulan y coordinan muchas de las actividades celulares.
Dentro de los mecanismos innatos efectores humorales se encuentran el sistema
complemento (C, ver Glosario), las colectinas, las ficolinas y las pentraxinas. Todas estas
proteínas circulan en forma soluble en el plasma (ver Glosario) y los líquidos extracelulares
y reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), actuando como
opsoninas y marcando a patógenos para su posterior fagocitosis por los neutrófilos y
macrófagos (ver Glosario).
EL SISTEMA COMPLEMENTO
El sistema complemento es un complejo proteico polimolecular, compuesto por un
grupo de más de 30 proteínas. Están presentes en concentraciones que varían entre 1
g/ml, como en el caso el factor D, hasta 1 mg/ml, como en el caso de la fracción C3. Se
encuentran en todos los vertebrados, con un alto nivel de conservación en los mamíferos.
Son sintetizadas en su mayoría por los hepatocitos aunque los macrófagos tisulares y las
células endoteliales representan una fuente alternativa. Las proteínas del complemento
circulan en la sangre, normalmente en forma inactiva. La activación puede ocurrir a través
de tres vías:
21
 Vía Alterna.
 Vía de las Lectinas.
 Vía Clásica.
Este proceso de activación está bajo estricto control de mecanismos regulatorios
mediados por factores solubles y/o asociados a membranas celulares. Cuando el
complemento es activado se pone en marcha un potente mecanismo de amplificación
similar a la cascada de la coagulación.
Las consecuencias de la activación del complemento por cualquiera de las tres vías
son:
 Generación de moléculas opsonizantes (C3b).
 Producción de moléculas quimiotácticas y anafilácticas (C3a y C5a) que
participan en el proceso inflamatorio.
 Formación del complejo de ataque a membrana (C5b-9) que genera poros en
la misma provocando la lisis celular.
 Potenciación de las respuestas de los linfocitos B.
Durante la inmunidad innata el sistema complemento realiza su función efectora,
activándose mediante dos de sus tres vías, la vía alterna y la vía de las lectinas (Figura 8).
Para el estudio del sistema complemento, en el laboratorio, se han desarrollado dos
tipos de ensayos: funcionales como la Valoración del Complemento e inmunoquímicos
como la Inmunodifusión Radial Cuantitativa (IDRC, ver Glosario). Los ensayos funcionales
evalúan la integridad del sistema y la IDRC utiliza anticuerpos específicos para cuantificar
un componente particular del sistema.
El dosaje de la actividad del complemento en un suero (ver Glosario) utilizando un
ensayo funcional puede determinarse en unidades hemolíticas 100 % o en unidades
hemolíticas 50 %. Se define como unidad hemolítica a la menor cantidad de suero capaz de
producir la lisis total o parcial de un sistema antígeno-anticuerpo, glóbulos rojos de carnero
y su correspondiente anticuerpo (vía clásica), o de glóbulos rojos de determinadas especies
animales en condiciones adecuadas (vía alterna).
Estudios realizados sobre la cinética de la inmunohemólisis han demostrado que se
obtiene una mayor sensibilidad cuando la valoración de la actividad del complemento se
efectúa utilizando unidades hemolíticas 50 %.
22
ACTIVACIÓN DEL COMPLEMENTO
VÍA DE LAS LECTINAS VÍA ALTERNA
Se activa por la unión de una Se activa por la presencia de

lectina ligadora de manosa a la determinadas moléculas en la
superficie del patógeno superficie del patógeno
PRODUCCIÓN DE:
C3a, C5a C5b-C9 C3b C3bi
Atracción de Perforación de la
Potenciación de
células membrana de los Recubrimiento del
la respuesta B
inflamatorias patógenos por patógeno
formación del favoreciendo la
complejo de ataque fagocitosis
a membrana
MUERTE DEL PATÓGENO
Figura 8: Activación del complemento en la respuesta inmune innata.
VALORACIÓN DEL COMPLEMENTO

Si se ponen en contacto distintas diluciones de una muestra biológica, cuyo
complemento se desea valorar, con un sistema formado por glóbulos rojos de carnero y su
anticuerpo específico (vía clásica), o glóbulos rojos de ciertas especies animales (vía
alterna) se produce la lisis de los hematíes. Es posible entonces graficar el porcentaje de
23
hemólisis en función de la cantidad de complemento agregado, observándose que se

obtiene una curva sigmoidea, con una marcada pendiente en la zona que va del 25 al 75 %
de hemólisis. De esto se deduce que existe una mayor sensibilidad si la determinación se
hace según el 50 % de hemólisis, pues para pequeñas variaciones en la concentración de
complemento se observan mayores variaciones en el porcentaje de hemólisis (Figura 9).
% de Hemólisis
75
50
25
Cantidad de complemento
Figura 9: Porcentaje de hemólisis de glóbulos rojos en función de la cantidad de

complemento presente en un suero.
La expresión matemática de esta curva es la ecuación de Van Krough donde X = K

[Y/(1-Y)]1/n. En esta ecuación X es la cantidad de complemento expresada en ml de dilución
e Y corresponde al grado de lisis como fracción de 1. K es una constante que equivale a la
cantidad de complemento que produce el 50 % de hemólisis, 1/n es el valor de la
pendiente, que varía según las condiciones del ensayo. La transformación logarítmica de la
ecuación de Van Krough es útil para la valoración del complemento porque su
representación matemática es una recta: log X= log K + 1/n log [Y/(1-Y)]. Cuando Y=0,5
(es decir cuando se produce el 50 % de lisis), [Y/(1-Y)] será 1, haciendo que el término
sea igual a cero, y el log de X en ese punto sea igual al log K, determinando de este modo
la cantidad de complemento (en ml de dilución del suero) que produce el 50 % de lisis del
sistema hemolítico (vía clásica) o de glóbulos rojos de ciertas especies animales (vía
alterna).
24
APLICACIONES DEL ESTUDIO DEL COMPLEMENTO EN EL

LABORATORIO
La evaluación de la actividad del complemento o la cuantificación de las proteínas

individuales que lo componen permiten conocer si el sistema está involucrado en el origen o
en el proceso de diferentes enfermedades. Los resultados de estas pruebas pueden ayudar
al diagnóstico y comprobar la eficacia del tratamiento en algunas patologías. Por ejemplo,
los pacientes con una enfermedad autoinmune (ver Glosario) como Lupus Eritematoso
Sistémico pueden tener niveles bajos de C3 y C4, y estos niveles del Complemento pueden
seguirse como un índice de la actividad de la enfermedad. Otra situación a tener en cuenta
es que la actividad de complemento, medida como CH50 (vía clásica) y AH50 (vía alterna)
puede variar en los diferentes fluidos biológicos, entonces, la actividad del complemento en
la sangre de pacientes con Artritis Reumatoide puede estar normal o aumentada, pero en el
líquido articular la actividad se encuentra francamente disminuida. En algunas
enfermedades graves bacterianas, por hongos y/o por parásitos los niveles del
complemento se encuentran muy disminuidos, al igual que en algunas inmunodeficiencias
(ver Glosario).
25
TRABAJO PRÁCTICO Nº 2
Valoración de la vía alterna del complemento en unidades

hemolíticas 50 % (AH50)
FUNDAMENTO:
Los glóbulos rojos de conejo presentan un bajo contenido de ácido siálico en sus
membranas, lo que permite la activación de la vía alterna del sistema complemento. Si se
ponen en contacto glóbulos rojos de conejo con un suero recién extraído (fuente de
complemento) se produce la lisis de los mismos por la formación del complejo de ataque a
membrana, como consecuencia de la activación del complemento por la vía alterna. La
hemoglobina liberada es un índice de la actividad funcional de esta vía. Efectuando una
batería de tubos con diluciones del suero se puede expresar la concentración del
complemento activado por vía alterna en unidades hemolíticas.
OBJETIVO:
 Estudiar la actividad funcional del sistema complemento por vía alterna
semicuantificando su concentración en unidades hemolíticas 50 % (AH50).
MUESTRA A ANALIZAR:
 Suero humano.
 Suspensión de glóbulos rojos de conejo al 2,5 %.
 Buffer complemento 5X: NaCl 0,94 M, gelatina 0,66 %, veronal 0,053 M, EGTA 0,008
M y MgCl2 0,01 M.
 Buffer complemento de trabajo 1X: diluir al quinto el buffer complemento 5X.
 Solución Fisiológica (SF): NaCl 0,15 M.
 Pipetas automáticas y de vidrio.
 Pipetas Pasteur.
26
 Propipeta.
 Baño termostatizado.
 Tubos de hemólisis y de Khan (semimicrotubos).
 Centrífuga.
 Espectrofotómetro.
PROTOCOLO:
 Preparar 6 diluciones seriadas razón 2 del suero a valorar en buffer complemento de
trabajo en tubos de hemólisis como se indica en el cuadro. En el tubo 6, descartar 0,2
ml de la dilución.
Tubo Buffer de Suero o dilución del suero Dilución

trabajo
1 0,2 ml 0,2ml de suero 1/2
2 0,2 ml 0,2 ml de dilución 1/2 1/4
3 0,2 ml 0,2 ml de dilución 1/4 1/8
4 0,2 ml 0,2 ml de dilución 1/8 1/16
5 0,2 ml 0,2 ml de dilución 1/16 1/32
6 0,2 ml 0,2 ml de dilución 1/32 1/64
 Preparar en otros 2 tubos los controles de 0 % y 100 % de hemólisis agregando 0,2 ml

de buffer de trabajo y 0,2 ml de agua destilada respectivamente.
 Agregar los glóbulos rojos al 2,5 % como muestra el siguiente cuadro:
Tubos 1 2 3 4 5 6 0% lisis 100% lisis

Diluciones del suero (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 - -
Buffer de trabajo (ml) - - - - - - 0,2 -
H2O destilada (ml) - - - - - - - 0,2
GR 2,5 % (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
 Incubar 60 min a 37 °C agitando ocasionalmente para mantener los glóbulos rojos en

suspensión.
27
 Agregar 2,4 ml de SF en cada tubo para frenar la reacción, excepto en el tubo control
de 100 % de lisis, al que se le agregan 2,4 ml de agua destilada.
 Centrifugar 5 min a 2000 rpm.
 Trasvasar el sobrenadante a tubos de Khan o de hemólisis para realizar la lectura.
 Leer la absorbancia de cada sobrenadante a una longitud de onda de 540 nm, llevando
a cero con agua destilada.
Con los datos obtenidos de absorbancia confeccionar la siguiente tabla y graficar el
Log X (en el eje de las ordenadas, eje y) en función del Log [Y/(1-Y)] (en el eje de las
abscisas, eje x).
X (diluciones Y (Fracción de [Y/(1-Y)] Log [Y/(1-Y)] Log X

del suero) lisis)
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
En todos los casos, para obtener Y (Fracción de lisis) se calcula:
Y= Absorbancia de la dilución / Absorbancia del tubo de 100 % de lisis
Una vez graficada la recta, obtener el punto que corta al eje de las ordenadas, y a
partir de ese punto determinar las unidades hemolíticas 50 % (ver ejemplo a continuación).
28
Valoración de la vía alterna del complemento

en unidades hemolíticas 50 % (AH 50)
2
1,8
1,6
1,4
1,2
Log X
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
-2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5
Log [Y/(1-Y)]
Ejemplo de cálculo de la AH50:

El punto donde la recta corta al eje de las y, corresponde al 50 % de lisis. En ese
punto el log [Y/(1-Y)] es 0.
log X = log K + 1/n log [Y/(1-Y)]

log X = log K + 0
En la gráfica:
log X = 1,13
X = antilog 1,13
X = 13,48
Este valor se multiplica por la inversa de la dilución inicial del suero. Suponiendo una
dilución inicial de ½:
AH50 = 13,48 x 2
AH50 = 27 UH
29
NOTAS:
 El plasma es el líquido sobrenadante que se obtiene luego de centrifugar la sangre
recolectada con anticoagulante. El plasma contiene todas las proteínas de la sangre
incluyendo anticuerpos, factores de la coagulación, fibrinógeno, etc.
 El suero es el líquido sobrenadante que se obtiene luego de centrifugar la sangre
recolectada sin anticoagulante. Contiene todas las proteínas de la sangre, incluyendo
los anticuerpos, menos las que participan en el fenómeno de la coagulación.
 El suero debe ser recién extraído. Sino debe mantenerse en freezer a -70 °C hasta su
uso.
 El agregado del EGTA inhibe la activación del complemento por la vía clásica.
MODELO DE INFORME
Valoración de la vía alterna del complemento en unidades hemolíticas 50 % (AH50)
Objetivo:
Resultado:
Presentar tabla con los valores obtenidos y la recta confeccionada con algún programa de
computación (Excel, GraphPad Prism, etc).
30
El Sistema Inmune Adaptativo UNS
REACCIONES DE INTERACCIÓN SECUNDARIA Y PRIMARIA

PARA LA INVESTIGACIÓN DE ANTICUERPOS
REACCIONES DE INTERACCION SECUNDARIA

Las técnicas basadas en reacciones de interacción secundaria son más económicas
y de mayor simpleza que las que permiten visualizar una interacción primaria. Se pueden
estudiar los anticuerpos presentes en una muestra mediante reacciones de precipitación o
aglutinación, dependiendo del estado físico del antígeno. Las reacciones de precipitación
pueden realizarse en medio líquido o gelosado.
Precipitación en medio líquido

Puede ser cualitativa (zonal) o cuantitativa.
Precipitación zonal rápida

También conocida como Ring Test (RT) o Método del anillo. Sirve para investigar
tanto antígeno como anticuerpo. Pueden hacerse determinaciones cualitativas (investigar
su presencia) o semicuantitativas (hallar concentraciones relativas).
Por sus características es la prueba rápida que se elige para evaluar la respuesta de
un animal inmunizado con un antígeno soluble en el marco de un plan de inoculación (ver
Glosario), con el objetivo de obtener anticuerpos específicos en dicho animal. En un
microtubo, la solución antigénica se enfrenta a un suero que contiene anticuerpos
específicos formándose en la interfase un anillo blanquecino.
Precipitación cuantitativa: Curva de precipitación

Si en una serie de tubos, se mezclan volúmenes crecientes de antígeno soluble (de
una determinada concentración) con un volumen constante de un suero conteniendo
anticuerpos específicos podemos observar al cabo de un cierto tiempo la formación de un
precipitado. En esta batería de tubos, la cantidad de precipitado aumentará hasta alcanzar
un máximo luego del cual disminuirá (Figura 10). Después de la incubación se separan los
precipitados de los sobrenadantes por centrifugación. En los sobrenadantes se realizan
31
reacciones en anillo enfrentándolos al antígeno y al anticuerpo respectivamente. En los

precipitados se determina por alguna metodología adecuada la cantidad de anticuerpo
presente. Con estos últimos valores y conociendo la cantidad de antígeno añadida se puede
construir la siguiente curva:
Figura 10: Curva de precipitación.
La forma de esta curva se explica de la siguiente manera: inicialmente, los complejos

antígeno-anticuerpo específicos se forman y precipitan a medida que se van agregando
cantidades crecientes del antígeno (zona de exceso de anticuerpo). En los últimos tubos
considerados, la cantidad de precipitado disminuye por la formación de complejos inmunes
solubles (zona de exceso de antígeno). En la zona intermedia se encuentra la zona de
equivalencia (ver Glosario). Se la define como aquella zona o punto ubicado entre las
zonas de exceso de anticuerpo y la de exceso de antígeno, y en la que la precipitación es
máxima.
Del análisis de la Figura 10 se desprende que la reacción de precipitación es de tipo
reversible y se observa un equilibrio entre los complejos inmunes (precipitados y solubles)
con antígeno y anticuerpo libres.
Ag + Ac  (AgAc)(sólido)
(AgAc)(sólido) + Ag  (Ag2Ac)(acuoso) + (Ag3Ac2)(acuoso) + (Ag4Ac3)(acuoso)
32
El comportamiento en la zona de exceso de antígeno se explica por el fenómeno de

redisolución del precipitado. En esta zona predominan los complejos solubles Ag2Ac.
A partir de esta curva es posible determinar la concentración de anticuerpos
específicos en un suero. Para ello se debe primero hallar cualitativamente la zona de
equivalencia mediante reacciones del anillo. En aquel tubo (o aquellos), donde las
reacciones del anillo den negativas tanto frente a antígeno como frente a anticuerpo, se
hace la determinación cuantitativa de anticuerpos.
Precipitación en medio gelosado

Estas reacciones aprovechan la capacidad de las macromoléculas de difundir
libremente a través de geles. Dentro de las reacciones de precipitación en medio gelosado
se encuentran la doble difusión bidimensional de Outcherlony, que permite la identificación
de varios sistemas antígeno-anticuerpo interaccionantes y la Inmunodifusión Radial
Cuantitativa, que es de utilidad para cuantificar antígenos.
Micrométodo de Outcherlony
El antígeno y el anticuerpo difunden uno hacia el otro a través de un gel (agar) y el
complejo inmune que se genera precipita en forma de línea o banda opaca en la región
donde las proporciones son óptimas (zona de equivalencia). Si la solución antigénica
contiene más de un antígeno es posible que se observe más de una banda. La sensibilidad
del método puede ser insuficiente para detectar todos los antígenos por lo que en este caso
se observan la mínima cantidad de sistemas interaccionantes.
La posición de la banda entre el pocillo que contiene al antígeno y el que contiene al
anticuerpo depende de la velocidad de difusión, que está en relación con el peso molecular
y la concentración inicial de los reactantes. Por ejemplo, la banda formada suele ser
cóncava hacia el pocillo que contiene el reactante de mayor peso molecular.
Inmunodifusión radial cuantitativa

Esta técnica se estudiará en el Trabajo Práctico N° 5.
33
Aglutinación para la detección de anticuerpos

De acuerdo a las características de las partículas aglutinantes, las reacciones de
aglutinación para la detección de anticuerpos pueden clasificarse como:
 Reacciones de aglutinación directa.
 Reacciones de aglutinación indirecta o pasiva.
Las reacciones de aglutinación directa se basan en el empleo de una partícula
aglutinante como antígeno. Como ejemplos se pueden mencionar:
Partícula aglutinante Reacción Utilidad diagnóstica
Bacterias Huddleson Búsqueda de anticuerpos

(Brucella abortus) anti-B. abortus en suero
Parásitos Aglutinación directa-Chagas Búsqueda de anticuerpos
(Trypanosoma cruzi) anti-T. cruzi en suero
Parásitos Aglutinación directa- Búsqueda de anticuerpos
(Toxoplasma gondii) Toxoplasmosis anti-T. gondii en suero
Las reacciones de aglutinación indirecta o pasiva se basan en el empleo de una

partícula aglutinante inmunológicamente inerte a la cual se le ha unido un antígeno soluble.
Como ejemplos se pueden mencionar:
Partícula aglutinante Reacción Utilidad diagnóstica
Glóbulos rojos + HAI-Chagas Búsqueda de anticuerpos

lisado de T. cruzi anti-T. cruzi en suero
Glóbulos rojos + HAI-Toxoplasmosis Búsqueda de anticuerpos
lisado de T. gondii anti-T. gondii en suero
Látex + Búsqueda de anticuerpos
glicoproteína gp 120 anti-HIV en suero
Látex + Búsqueda de anticuerpos
HBsAg anti-HBsAg en suero
Látex + ASTO Búsqueda de anticuerpos
estreptolisina anti estreptolisina O en
suero
34
Los soportes inertes empleados para estas reacciones pueden ser glóbulos rojos
(hemaglutinación), partículas de látex o de gelatina. Para la preparación de este tipo de
reactivos es necesaria una etapa de incubación, entre la partícula inmunológicamente inerte
y el antígeno soluble sensibilizante, que permitirá la unión del mismo a las partículas. La
fijación se obtiene por mezcla directa o previo acondicionamiento de la superficie de la
partícula. En el caso de los glóbulos rojos el acondicionamiento se logra por incubación con
ácido tánico o tricloruro de cromo.
El anticuerpo a investigar por aglutinación directa o indirecta debe ser por lo menos
funcionalmente bivalente. Aquellos anticuerpos que poseen un solo paratope (ver Glosario)
funcional de alta afinidad se denominan anticuerpos incompletos o bloqueantes (ver
Glosario) y no generan reacciones de interacción secundaria cuando se enfrentan a su
antígeno específico. Aparecen en mayor concentración relativa en enfermedades crónicas
causadas por antígenos particulados como la brucelosis, la triquinosis y la gonococcia. Para
poder evidenciarlos utilizando reacciones de interacción secundaria es necesario recurrir a
otras pruebas como la de la antiglobulina, conocida como reacción de Coombs (ver
Glosario), la que se estudiará en el Trabajo Práctico N° 7.
La aglutinación puede realizarse en forma cualitativa o semicuantitativa. La primera
es utilizada para investigar la presencia de anticuerpos. Por ejemplo: búsqueda de
anticuerpos anti-Trypanosoma cruzi en un suero. La formación de grumos indica
especificidad del sistema antígeno-anticuerpo reaccionante. Los métodos semicuantitativos
determinan cuál es la máxima dilución del suero analizado capaz de aglutinar al antígeno
específico. Es importante destacar que no es posible determinar la concentración absoluta
de anticuerpos sino que se determina un título (ver Glosario). Para ello se incuban
diluciones seriadas de un suero con cantidades constantes de antígeno. El título se expresa
como la inversa de la máxima dilución del suero que produce aglutinación visible. Los
métodos semicuantitativos efectuados en forma seriada permiten seguir la respuesta inmune
experimental o la evolución de una infección.
La determinación de anticuerpos por aglutinación puede hacerse usando reacciones
de lectura lenta o rápida. En el primer caso se mezclan diferentes diluciones del suero a
valorar con suspensiones diluidas del antígeno. A continuación, una de las posibilidades es
incubar los tubos de reacción a 37 °C durante 2 horas y luego dejarlos en heladera hasta el
día siguiente para que la reacción se complete. Para determinar el título se busca el último
35
tubo de la serie que presenta aglutinación. En el segundo caso, la reacción se efectúa en

placa, mezclando volúmenes decrecientes del suero a investigar (sin diluir) con un volumen
constante de antígeno. El antígeno empleado es más concentrado que el utilizado en la
aglutinación lenta y la lectura del resultado se efectúa entre los 3 y 5 minutos. En el caso
del sistema Brucella abortus/anti-Brucella abortus, el título se expresa por convención.
Al valorar un suero, la disminución de anticuerpos por dilución hace que disminuya la
aglutinación hasta desaparecer lo que permite obtener el título. En algunos sueros se
observa un comportamiento particular, caracterizado por la ausencia de aglutinación en los
primeros tubos de la serie, donde la concentración de anticuerpo es máxima, y con
aglutinación a diluciones mayores (Figura 11). Este fenómeno se denomina prozona (ver
Glosario), y es propio de la aglutinación. Al existir un exceso de anticuerpos con respecto a
los determinantes antigénicos, es muy poco probable que los dos sitios activos del
anticuerpo se unan a determinantes antigénicos de dos moléculas de antígeno diferentes y
formen la red. Cuando ocurre el fenómeno de prozona se debe repetir el procedimiento
pero empleando una dilución del suero a investigar. Para determinar el título se observa
cuál es la máxima dilución que produce aglutinación visible. El título en este caso estará
dado por la inversa de la máxima dilución aglutinante multiplicada por el factor de la dilución
realizada.
Figura 11: El fenómeno de prozona.
Aglutinación con y sin 2-mercaptoetanol (2-ME)

La reacción de aglutinación puede realizarse en ausencia o presencia de 2-ME lo que
permite determinar qué clase de anticuerpo está produciendo dicha reacción. Cuando se
36
realiza la titulación de un suero por aglutinación en ausencia de 2-ME el título corresponde

a la actividad aglutinante de la IgM e IgG. Si, siguiendo el mismo protocolo, se realiza la
titulación en presencia de 2-ME, éste produce una reducción de la IgM pentamérica. Como
la IgM monomérica resultante no es aglutinante, el título obtenido en este caso
corresponderá exclusivamente a la actividad aglutinante de la IgG. La caída del título de un
suero obtenido por aglutinación con 2-ME respecto al obtenido sin 2-ME es indicativa de la
presencia de IgM específica. El hallazgo de esta IgM es de importancia en muchos casos
porque es indicio de infección aguda.
Reacciones cruzadas
En ciertas ocasiones puede ocurrir que un anticuerpo generado frente a un antígeno
determinado reaccione con otro antígeno que comparte algunos determinantes antigénicos
con el antígeno inductor de la respuesta inmune. Esto se conoce como reactividad cruzada
(ver Glosario) y es importante tenerla en cuenta ya que puede conducir a resultados falsos
positivos cuando se está analizando la presencia de anticuerpos específicos en una
muestra.
REACCIONES DE INTERACCIÓN PRIMARIA
ELISA para la detección de anticuerpos

Los diseños de ELISA para la detección de anticuerpos pueden ser: competitivos o
no competitivos.
En un ELISA competitivo para la determinación de anticuerpos, el antígeno se
encuentra fijado a un soporte. Luego se le agrega la muestra (en la que se desea investigar
anticuerpos) junto con un anticuerpo anti-antígeno marcado con una enzima. Ambos
anticuerpos, el de la muestra y el marcado, compiten por su unión al antígeno fijado.
Cuanto mayor sea la concentración del anticuerpo sin marca, menor será la cantidad de
anticuerpo marcado que se unirá al antígeno fijado y en consecuencia, menor la medida de
absorbancia detectada.
El diseño más simple de un ELISA no competitivo (o de amplificación) consiste en
unir a una fase sólida el antígeno de interés, el que será reconocido por los anticuerpos de
37
la muestra. Una vez lavado el material no unido, los anticuerpos son detectados mediante
un conjugado anti-inmunoglobulina marcada con enzima obtenido en una especie diferente
(Figura 12A). Este diseño experimental es el que se utilizará en el Trabajo Práctico.
Un diseño alternativo, como el mostrado en la Figura 12B, es útil cuando el antígeno
no se une eficientemente a la fase sólida debido a su naturaleza química u otros factores.
A Anti-Inmunoglobulina B
marcada con enzima
Anticuerpo en estudio
Antígeno
Figura 12: Distintos diseños de ELISA para la medición de anticuerpos.
Recordando los pasos de la técnica (ver Trabajo Práctico N° 1):

 Inmovilización del inmunoreactante (antígeno o, anticuerpo de captura y luego
antígeno) en la fase sólida (sensibilización).
 Incubación con la muestra (anticuerpo) para permitir que ésta reaccione con el
inmunoreactante inmovilizado.
 Amplificación o modulación por medio del empleo de un conjugado enzimático
(esta etapa puede comprender, en realidad, más de un paso).
El imnunoreactivo usado para sensibilizar puede ser soluble (proteínas, hidratos de
carbono, ácidos nucleicos) o particulado (células). Para este último caso se debe tratar
previamente la placa con polilisina.
Escogiendo el conjugado adecuado es posible detectar distintos isotipos de
anticuerpos contra un antígeno en particular.
Los ensayos de ELISA para la detección de anticuerpos, según el origen del antígeno
utilizado para la sensibilización de la fase sólida se clasifican en ELISA de primera,
segunda o tercera generación.
38
ELISA de primera generación

Utilizan antígenos procedentes de lisados de parásitos, bacterias o virus cultivados
en células. Su desventaja son los problemas de especificidad por reacciones cruzadas con
otras enfermedades parasitarias, bacterianas o contaminantes celulares.
ELISA de segunda generación

Emplean antígenos recombinantes originados al insertar una región determinada del
genoma de un parásito, bacteria o virus en vectores biológicos. Así pueden obtenerse
proteínas antigénicas en grandes cantidades. La especificidad no es totalmente óptima pues
pueden existir reacciones inespecíficas contra determinantes antigénicos del vector.
ELISA de tercera generación

Utilizan como antígenos péptidos sintéticos. Conociendo la estructura de la proteína
antigénica se construye, in vitro, una secuencia lineal que se emplea para la sensibilización
de la placa.
Actualmente las mejores técnicas de ELISA utilizan para fijar a la placa mezclas de
antígenos provenientes de diferentes fuentes lográndose así la máxima sensibilidad y
especificidad.
Obtención de los resultados

La lectura de resultados cualitativos (presencia/ausencia de anticuerpos) puede
realizarse de diversas formas, como se explicó en el Trabajo Práctico N° 1.
Si el objetivo es la semicuantificación de anticuerpos específicos en un suero se
pueden emplear diversas metodologías:
 Titulación a punto final.
 Medida de la absorbancia a dilución simple.
 Título de un suero en unidades arbitrarias por comparación con un suero patrón.
El más utilizado es el método de titulación a punto final. Según esta metodología se
debe graficar el logaritmo de la dilución del suero versus la absorbancia obtenida (Figura
13). El título del suero investigado se obtiene leyendo por curva cual es la dilución que
produce el 50 % de la absorbancia máxima del sistema. Este método tiene la ventaja de
39
que al analizar la curva de titulación de cada suero, puede aplicarse para sueros con bajo o
alto título.
Absorbancia a 490 nm 0.75
0.50
50 %
0.25
0.00
-6 -5 -4 -3 -2 -1 0
log dilución
Figura 13: Gráfico del logaritmo de la dilución del suero versus la absorbancia obtenida
para el método de titulación a punto final.
También se puede obtener la concentración de anticuerpos específicos mediante un

ELISA cuantitativo. Para ello es necesaria la construcción en paralelo de una curva de
calibrado con testigos de concentración conocida.
40
Primera parte
Semicuantificación de anticuerpos por aglutinación rápida en placa
(ARP)
FUNDAMENTO:
Si se pone en contacto una suspensión de bacterias Brucella abortus de una
determinada concentración con diferentes alícuotas de un suero en el cual se quiere
investigar la presencia de anticuerpos específicos anti-Brucella abortus es posible
determinar el título de estos anticuerpos. Este título está dado por la menor alícuota del
suero en la que se observa aglutinación, y en este caso se establece por convención.
OBJETIVO:
 Semicuantificar anticuerpos anti-Brucella abortus en un suero.
MUESTRA A ANALIZAR:
 Suero de conejo.
 Antígeno: suspensión de microorganismos 100.000 millones/ml de Brucella abortus en
NaCl 12 % con colorante azul de metileno u otro.
 Solución fisiológica (SF): NaCl 0,15 M.
 Varillas.
 Portaobjetos.
PROTOCOLO:
 Colocar en portaobjetos 80, 40, 20, 10 y 5 µl de suero a investigar y 40 µl de SF como
control negativo. Agregar 30 µl de antígeno a dichas alícuotas.
41
 Mezclar con varilla.

 Observar entre los 3 y 5 min si hay o no aglutinación y en qué alícuota.
Según las alícuotas usadas en este protocolo los títulos corresponden a valores de
20, 40, 80, 160 y 320. Son títulos establecidos por convención. Los resultados obtenidos
en la titulación en placa se aproximan a los obtenidos en la prueba en tubo, considerando
las siguientes diluciones:
Volumen de suero (ml) Dilución aproximada en la prueba en tubo
0,08 1/20
0,04 1/40
0,02 1/80
0,01 1/160
0,005 1/320
NOTAS:
 El colorante agregado a la suspensión bacteriana mejora la visualización e impide la
proliferación bacteriana.
 Tener en cuenta al realizar este procedimiento el posible fenómeno de prozona.
 Esta técnica permite evaluar la respuesta de un animal de experimentación durante la
inmunización con un antígeno particulado.
 Cuando el sistema evaluado es distinto al de Brucella abortus/anti-Brucella abortus, el
título se expresa como la inversa de la máxima dilución aglutinante.
42
Segunda parte
Semicuantificación de anticuerpos por aglutinación lenta en tubo
(ALT)
FUNDAMENTO:
Si se efectúan diluciones seriadas de un suero en el cual se quiere investigar la
presencia de anticuerpos específicos anti-Brucella abortus y se agrega una volumen
constante de una suspensión de bacterias Brucella abortus de una determinada
concentración es posible determinar el título de esos anticuerpos. Este título está dado por
la inversa de la mayor dilución del suero en la que se observa aglutinación.
OBJETIVO:
 Semicuantificar anticuerpos anti-Brucella abortus en un suero.
MUESTRA A ANALIZAR:
 Antígeno: suspensión de microorganismos 5000 millones/ml de Brucella abortus en
solución salina tamponada.
 Solución salina tamponada: NaCl 0,15 M; fosfato monopotásico 0,01 M, pH 7,2.
 Tubos de hemólisis.
 Pipetas de 1 y 5 ml.
 Gradillas.
 Baño de agua.
PROTOCOLO:
 Preparar una serie de 10 tubos de hemólisis.
 Colocar en cada uno de ellos 0,5 ml de solución salina tamponada.
 Al primero agregar 0,5 ml del suero a investigar. Mezclar.
 Transferir 0,5 ml de la mezcla al segundo tubo.
43
 Proceder de este modo con los siguientes tubos hasta el penúltimo del que se extraen
0,5 ml y se desechan.
 El último tubo lleva sólo solución salina tamponada y se usa como control.
 Agregar a todos los tubos 0,5 ml de la suspensión antigénica.
 De este modo quedan realizadas diluciones “razón” 2 a partir del primero cuya dilución
es 1/4.
 Mezclar e incubar en baño de agua a 37 °C durante 15 min.
 Reposar 24 h en heladera.
 Resuspender suavemente.
 Observar y determinar la máxima dilución aglutinante.
Se expresa el título, que está dado por la inversa de la máxima dilución aglutinante.
NOTA:
 También puede realizarse la lectura el mismo día en que se efectúa la determinación.
Para ello, luego de la incubación en baño, se centrifugan los tubos a 1000 rpm durante
1 min y se determina el título.
Tercera parte
Identificación y semicuantificación de anticuerpos por
hemaglutinación indirecta (HAI)
FUNDAMENTO:
La hemaglutinación indirecta (HAI) se basa en la propiedad que tienen los
anticuerpos (en este caso anti-Trypanosoma cruzi) de producir aglutinación específica en
presencia de glóbulos rojos sensibilizados con los correspondientes antígenos. En el suero
también existen anticuerpos inespecíficos (heterófilos) que son capaces de aglutinar
glóbulos rojos de distintas especies. Su posible presencia se investiga enfrentando el suero
con glóbulos rojos no sensibilizados.
44
MUESTRA A ANALIZAR:
 Suero humano.
 Reconstituyente HAI: solución fisiológica tamponada, pH 7,0.
 Antígeno HAI: liofilizado de glóbulos rojos de carnero sensibilizados con antígenos
citoplasmáticos de T. cruzi rehidratado en reconstituyente HAI.
 Glóbulos rojos de carnero no sensibilizados: suspensión al 1 % para control de
heterofilia.
 Buffer HAI: solución fisiológica tamponada con fosfatos a pH 7,5 con colorante inerte.
 Solución proteica: solución de albúmina bovina al 10 %.
 Diluyente de suero HAI: agregar 0,2 ml de solución proteica cada 10 ml de buffer HAI.
 Control positivo: suero inactivado conteniendo anticuerpos anti-T. cruzi.
 Policubetas.
 Ansas.
 Microgoteros.
 Microdilutores.
TÉCNICA DE SCREENING
OBJETIVO:
 Determinar la posible presencia de anticuerpos anti-T. cruzi en un suero.
PROTOCOLO:
 Colocar una gota de diluyente de sueros HAI con microgotero de 25 l en todos los
pocillos a utilizar de la policubeta (un pocillo por cada muestra).
 Sumergir un ansa limpia en la muestra.
 Colocar el ansa cargada en el pocillo que contiene el diluyente de sueros HAI, rotando
la misma para obtener un buen mezclado y distribuir la gota sobre todo el fondo del
pocillo.
45
 Retirar el ansa y secarla con papel absorbente, lavar en dos recipientes con agua
destilada.
 Secar nuevamente con papel absorbente.
 Proceder de la misma manera para cada nueva muestra.
 Agregar con microgotero de 25 l, una gota de antígeno HAI reconstituido y
homogeneizado a cada pocillo.
 Agitar la policubeta golpeando con los dedos en las paredes laterales.
 Cubrir con cinta adhesiva transparente para evitar evaporaciones y dejar reposar, al
resguardo de vibraciones 90 min a temperatura ambiente.
 Procesar simultáneamente un control positivo y un control negativo utilizándolos de la
misma manera que la muestra.
 Efectuar la lectura.
RESULTADOS:
No reactivo: presencia de un sedimento en forma de botón en el fondo del pocillo.
Reactivo: presencia de una película o manto en el fondo del pocillo.
NOTA:
 Los antígenos particulados constituyen mezclas heterogéneas que sedimentan por lo
que es de importancia homogeneizarlas adecuadamente al momento de tomar una
alícuota. Por esto tener en cuenta homogeneizar el Antígeno HAI por agitación evitando
la formación de espuma.
 Un suero reactivo siempre debe ser confirmado para discriminarlo de un falso positivo,
debido a la presencia de anticuerpos heterófilos. Estos últimos reaccionan contra
determinantes antigénicos presentes en la membrana de los glóbulos rojos soporte y
pueden encontrarse en el suero de individuos normales. Por esta razón es necesario un
control de heterofilia que se realiza en la técnica de titulación al enfrentar las diluciones
½ y ¼ del suero con glóbulos rojos no sensibilizados.
46
TÉCNICA DE TITULACIÓN
OBJETIVO:
 Determinar y semicuantificar anticuerpos anti-T. cruzi en un suero.
PROTOCOLO:
 Colocar una gota con microgotero de 25 l de diluyente de sueros HAI en todos los
pocillos a usar de la policubeta.
 Tomar una alícuota del suero con microdilutor de 25 l.
 Colocar el microdilutor en el primer pocillo y rotarlo por lo menos 10 veces para lograr
una correcta dilución.
 Realizar diluciones seriadas a partir del primer pocillo (dilución 1/2), pasando el
microdilutor al pocillo siguiente y así sucesivamente hasta la dilución que se desee
investigar, rotando en cada paso el microdilutor por lo menos 10 veces. Descartar los
últimos 25 l.
 Si se emplea micropipeta automática de 25 l para la toma y/o dilución de la muestra
homogeneizar por carga y descarga. Transferir 25 l de pocillo a pocillo hasta la
dilución que se desee investigar. Descartar los últimos 25 l.
 Colocar 25 l de glóbulos rojos no sensibilizados en los pocillos que contienen las
diluciones 1/2 y 1/4 del suero, para control de heterofilia.
 En el resto de los pocillos agregar 25 l de antígeno HAI.
 Agitar la policubeta golpeando con los dedos en las paredes laterales.
 Cubrir con cinta adhesiva transparente para evitar evaporaciones y dejar reposar, al
resguardo de vibraciones 90 min a temperatura ambiente.
 Efectuar la lectura.
No reactivo: presencia de un sedimento en forma de botón en el fondo del pocillo.
Reactivo: presencia de una película o manto que cubre el 50 % o más del fondo del
pocillo.
El título se expresa como la inversa de la mayor dilución del suero que da reactivo.
47
NOTAS:
 Tener en cuenta homogeneizar el Antígeno HAI y los glóbulos rojos no sensibilizados
por agitación, evitando la formación de espuma, antes de usarlos.
 Si las diluciones 1/2 y 1/4 dieran reactivas, indicarían la presencia de anticuerpos
heterófilos (heterofilia). Por lo tanto la determinación debe repetirse, previo tratamiento
del suero incógnita con glóbulos rojos no sensibilizados con la finalidad de adsorber los
anticuerpos heterófilos.
 La presencia de IgM específica característica del período agudo de la enfermedad se
investiga empleando la técnica de titulación previo tratamiento del suero con 2-
Mercaptoetanol (2-ME). En una infección aguda, los sueros tratados con 2-ME
presentan una caída del título en por lo menos dos diluciones comparados con los
mismos sueros sin tratar.
Cuarta parte
Investigación de anticuerpos por ELISA
FUNDAMENTO:
La interacción del anticuerpo presente en la muestra a investigar con un antígeno
específico inmovilizado sobre un soporte sólido, puede ponerse en evidencia por medio de
un segundo anticuerpo, específico para el anticuerpo presente en la muestra, conjugado con
una enzima cuya actividad produce una reacción de color visible luego del agregado del
sustrato cromogénico correspondiente.
OBJETIVO:
 Investigación cualitativa de anticuerpos anti-T. cruzi en un suero.
MUESTRA A ANALIZAR:
 Suero humano.
 Placas de poliestireno sensibilizadas con antígenos recombinantes de T. cruzi.
48
 Conjugado: anti-inmunoglobulinas humanas obtenidas en cabra conjugadas con

peroxidasa.
 Diluyente de muestras: albúmina bovina en solución fisiológica tamponada con buffer
fosfatos, pH 7,2.
 Sustrato (revelador A): peróxido de hidrógeno 60 mmol/l en buffer citrato 50 mmol/l,
pH 3,2.
 Cromógeno (revelador B): Tetrametilbencidina (TMB) 0,01 mol/l en HCl 0,1 N.
 Buffer de lavado concentrado: NaCl 1,4 mol/l en buffer fosfatos 100 mmol/l y
tensioactivo no iónico 0,1 g/l (dilución de trabajo: 1 parte de buffer de lavado
concentrado más 4 partes de agua destilada).
 H2SO4 2 N.
 Control positivo: suero inactivado reactivo conteniendo anticuerpos anti-T. cruzi.
PROTOCOLO:
 En los pocillos de la policubeta a utilizar colocar:
Pocillos 1 2 3
Diluyente de muestras 200 μl 200 μl 200 μl
Control (+) 10 μl
Control (-) 10 μl
Suero desconocido 10 μl

 Cubrir la policubeta con cinta adhesiva para evitar la evaporación.
 Incubar en estufa a 37 °C durante 30 min.
 *Aspirar cuidadosamente el líquido de cada pocillo, desechándolos en un recipiente que
contenga hipoclorito de sodio al 5 %.
 **Lavar 5 veces durante 2 min con buffer de lavado (300 μl/pocillo cada vez).
 ***Al finalizar el último lavado secar cuidadosamente la policubeta, invirtiéndola sobre
papel absorbente.
49
 Agregar una gota del conjugado (50 μl en caso de emplear micropipeta) a todos los
pocillos.
 Cubrir con cinta adhesiva e incubar 30 min en estufa a 37 °C.
 Repetir los pasos *, ** y ***.
 Agregar una gota de revelador A (50 μl en caso de emplear micropipeta) a todos los
pocillos.
 Agregar una gota de revelador B (ídem al anterior) a todos los pocillos.
 Incubar 30 min a temperatura ambiente.
 Agregar a todos los pocillos una gota (o bien 50 μl con micropipeta) de H2SO4 2 N
para frenar la reacción.
 Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de policubeta durante 10 s.
La lectura de los resultados puede realizarse empleando un espectrofotómetro a 450
nm o bien a simple vista por comparación con los controles positivos y negativos.
Interpretación visual (es la que se realizará en este caso):
Color desarrollado por la Lectura Resultado
muestra
< al control negativo Visual No reactivo

≥ al control positivo Visual Reactivo
> al control negativo (ligeramente Espectrofotométrica Reactivo o no reactivo según el
tenue) valor de corte
Con instrumental óptico:
En este caso realizar en paralelo un blanco de reactivos para llevar el
espectrofotómetro a cero. El mismo se procesa de la misma forma omitiendo el agregado
de la muestra. La presencia o ausencia de anticuerpos anti-T. cruzi se determina
relacionando la absorbancia de la muestra con el valor del cut off.
Cut off = CN + 0,300 donde CN es el promedio de las lecturas de absorbancia del
Control Negativo que se procesa por triplicado.
50
NOTAS:
 Todos los reactivos y sueros a investigar deben estar a temperatura ambiente antes de
iniciar la prueba.
 La actividad de la enzima peroxidasa se pone de manifiesto por la aparición de un color
netamente amarillo. El color desarrollado es estable durante 30 min.
MODELO DE INFORME
Primera parte: Semicuantificación de anticuerpos por aglutinación rápida en placa
(ARP).
Objetivo:
Sistema:
Resultado: Título: ...
Segunda parte: Semicuantificación de anticuerpos por aglutinación lenta en tubo (ALT).
Objetivo:
Sistema:
Resultado: Título: ...
Tercera parte: Identificación y semicuantificación de anticuerpos por hemaglutinación
indirecta (HAI).
Técnica de screening:
Objetivo:
Sistema:
Resultado: Ej. Suero 1: no reactivo.
Técnica de titulación:
Objetivo:
Sistema:
Resultado: Ej. Suero 2: Título: …
Cuarta parte: Investigación de anticuerpos por ELISA.
Objetivo:
Sistema:
Resultado:
Interpretación:
51
IDENTIFICACIÓN DE POBLACIONES CELULARES POR

INMUNOFLUORESCENCIA
Entre las técnicas de inmunomarcación encontramos aquellas que utilizan anticuerpos

que tienen acoplado una sustancia fluorescente o fluorocromo (ver Glosario). Se usan
para detectar antígenos en tejidos (Inmunohistoquímica), antígenos en células en
suspensión o fijadas a portaobjetos (Inmunocitoquímica) y también para la detección de
anticuerpos.
Cuando la marcación con una sustancia fluorescente se realiza sobre cortes de
tejidos (impronta) se emplea para la visualización un microscopio de fluorescencia. Cuando
la marcación se realiza sobre células en suspensión se emplea un citómetro de flujo, o bien
un microscopio de fluorescencia si luego de la marcación se colocan esas células sobre un
portaobjetos.
La detección de antígenos puede hacerse por Inmunofluorescencia Directa (IFD, ver
Glosario) o Inmunofluorescencia Indirecta (IFI, ver Glosario), según sea el primer o
segundo anticuerpo el que está conjugado con el fluorocromo (Figura 14). En cualquier
caso son imprescindibles los controles positivos y negativos para cada prueba.
Figura 14: Inmunofluorescencia directa (A) e indirecta (B). Los anticuerpos marcados con
una molécula fluorescente pueden utilizarse para detectar la presencia de antígenos en
células y tejidos.
Particularmente, en este Trabajo Práctico se hará referencia al estudio de los
linfocitos de sangre periférica.
53
AISLAMIENTO DE POBLACIONES CELULARES SANGUÍNEAS

En muchas ocasiones, para poder estudiar las células del sistema inmune es
conveniente aislar las distintas poblaciones. En el caso de los linfocitos es adecuado
obtener previamente una fracción enriquecida en células mononucleares sin la presencia de
eritrocitos y granulocitos, ya que éstos últimos liberan sustancias tóxicas que pueden
producir alteraciones celulares.
La densidad de flotación es un parámetro útil para lograr la separación de células
mononucleares de sangre humana total. Una de las maneras de conseguir esta separación
empleando esta propiedad es usando un gradiente de Ficoll-Hypaque (ver Glosario) de
densidad 1,077 g/ml. El procedimiento para lograr este gradiente de densidad consiste en
diluir un volumen de sangre entera con un volumen de solución fisiológica. Luego se coloca
en un tubo de centrífuga el Ficoll-Hypaque y sobre éste la sangre diluida, previamente
homogeneizada, formando dos fases (Figura 15). Se centrifuga y se separa la interfase
entre el Hypaque y el plasma diluido, que contiene la fracción enriquecida en células
mononucleares en la que se pueden estudiar los linfocitos.
Figura 15: Obtención de células mononucleares totales de sangre periférica según su

densidad.
Antes de realizar la purificación o el enriquecimiento de poblaciones celulares
inmunocompetentes se deben considerar varios aspectos: el órgano donde existe el mayor
porcentaje de las células de interés, la accesibilidad de dicho órgano (en general cuando se
54
trabaja con seres humanos se prefiere sangre periférica), la menor contaminación con otras
células, etc.
MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA PARA EL ESTUDIO DE

POBLACIONES CELULARES
La incubación de células con un anticuerpo monoclonal específico marcado con un

fluorocromo dirigido contra una molécula expresada en su membrana; o bien con un
anticuerpo sin marcar y luego detectando la unión formada con un anticuerpo anti-
inmunoglobulina de ratón fluorescente permite el estudio de marcadores fenotípicos.
Los conceptos básicos sobre microscopía de fluorescencia se han desarrollado en el

apéndice correspondiente (ver Apéndice III). Los pasos de las técnicas de
inmunofluorescencia que utilizan un microscopio de fluorescencia se muestran en las
Figuras 16 y 17.
Cabe mencionar que cuando se quiere aplicar la técnica de inmunofluorescencia a

células en suspensión existen dos alternativas. En una de ellas se fijan las células a un
portaobjeto y luego se realiza la inmunomarcación (Figuras 16 y 17). Otra forma consiste
en la incubación de las células en suspensión con los anticuerpos específicos y luego para
la observación microscópica se las coloca entre porta y cubreobjetos. Esta última opción se
empleará en este Trabajo Práctico.
Figura 16: Inmunofluorescencia directa.
55
Figura 17: Inmunofluorescencia indirecta.
CITOMETRÍA DE FLUJO
En la actualidad, la técnica de inmunofluorescencia más utilizada para el análisis de

características morfológicas celulares, así como la expresión de proteínas, el ciclo celular, la
activación celular, etc., es la citometría de flujo. El citómetro de flujo (Figura 18) es un
instrumento capaz de detectar un mínimo de tres señales fluorescentes de diversos colores,
procedentes de células en suspensión, por lo que permite analizar simultáneamente la
expresión de muchas moléculas distintas por parte de una única célula.
56
Figura 18: Esquema de un citómetro de flujo.
Además de detectar las señales fluorescentes, los citómetros de flujo también miden
la dispersión hacia adelante y hacia los lados procedentes de las células, lo que da
información de su tamaño y complejidad interna, respectivamente (Figura 19). Esta
57
información suele utilizarse para distinguir los distintos tipos celulares. Por ejemplo, en
comparación con los linfocitos, los neutrófilos dan lugar a una dispersión lateral mayor
debido a sus gránulos citoplasmáticos, y los monocitos provocan una dispersión mayor
hacia adelante debido a su tamaño.
Figura 19: Dispersión de la luz hacia adelante y angular.
Para su análisis, la suspensión celular en estudio se incuba con una sonda

fluorescente. En el citómetro de flujo, la suspensión fluye por una cámara rodeada por un
líquido acuoso donde las células pasan de una en una a través de un haz incidente
generado por un láser. De la incidencia de esta luz sobre cada célula se obtienen los
parámetros morfológicos de tamaño y complejidad celular. El detector frontal (FSC, Foward
Scatter) se halla en línea con el láser y en él se obtiene, con el paso de las células, una
penumbra que es proporcional al tamaño de éstas. Por otra parte, como las células no son
opacas, la luz que entra al citoplasma se refracta por toda la superficie celular en forma
proporcional a la granularidad citoplasmática. Esta refracción es recogida a 90° por el
detector lateral (SSC, Side Scatter). La fluorescencia resultante de la excitación de los
fluorocromos con la luz láser se recoge en tres detectores de fluorescencia (FL1, FL2 y
FL3). La cantidad de fluorescencia unida o incorporada a cada célula se interpretará en
función de lo que se haya marcado: proteínas, lípidos, azúcares, iones o ADN. Cabe aclarar
que todas estas medidas son recogidas por detectores específicos y convertidas en
impulsos eléctricos, amplificadas, digitalizadas y almacenadas en un ordenador. A este
proceso se lo conoce como adquisición (ver Glosario) de datos de la muestra.
58
En particular, el estudio de proteínas expresadas en la membrana de linfocitos

circulantes permite determinar distintos subtipos celulares. Para ello las células linfoides se
incuban con anticuerpos monoclonales acoplados a diferentes sustancias fluorescentes, que
quedarán adheridos a la superficie celular. Luego se recurre a un citómetro de flujo que
tenga el láser adecuado para excitar los distintos fluorocromos utilizados.
Es posible también estudiar moléculas intracitoplasmáticas. Para ello se debe realizar
la permeabilización transitoria de las células, de modo que los anticuerpos marcados
puedan atravesar la membrana plasmática. Además de anticuerpos, pueden usarse otro tipo
de sondas fluorescentes que censan estrés oxidativo o se unen al ADN y permiten el
estudio del ciclo celular.
Adquisición de datos e interpretación de resultados

La adquisición de los datos es la visualización en tiempo real y por medio de
citogramas de los parámetros de dispersión y fluorescencia que presentan las células de la
muestra a analizar y que pueden ser almacenados para su posterior análisis. Durante la
adquisición se puede seleccionar un conjunto de células a través de regiones de exclusión
llamadas ‘gate’ o ‘ventanas’ (ver Glosario), de este modo se analiza o simplemente se
visualiza el comportamiento físico y antigénico de la población elegida. Antes de la
adquisición de los datos de las muestras debe corroborarse que estén colocadas las
condiciones de calibración del equipo.
Los datos adquiridos por el programa del citómetro de flujo pueden ser volcados en
una variedad de gráficos (citogramas) con distinta utilidad: gráfico de puntos (Dot Plot)
(Figura 20A), histograma (Figura 20B), gráfico de contornos (Figura 20C), gráfico de
densidad (Density Plot) (Figura 20D), y representaciones 3D (Figuras 20E y 20F).
De cada gráfico se pueden tener los valores estadísticos para el análisis y debe
considerarse si se trata de la población total o de una región (gate). Estos valores
estadísticos pueden ser el número de eventos (número de células), porcentaje de células,
media de intensidad de fluorescencia, etc.
59
A B
N de Células
SSC
FSC Intensidad de Fluorescencia (FL1)

C D
SSC
SSC
FSC FSC
E F
N de Células
Figura 20: Representaciones gráficas de datos citométricos.

Los leucocitos pueden diferenciarse de acuerdo a su tamaño y su complejidad celular
(Figura 21A). Cuando se desea estudiar algunas de las células que forman parte del
sistema inmune, como los linfocitos, se puede dibujar un gate (Figura 21B) para procesar y
mostrar los datos registrados de la fluorescencia de los distintos fluorocromos
exclusivamente de esta población celular.
60
Figura 21: A. Gráfico de puntos de tamaño celular versus complejidad celular. B. Selección
de una región o gate.
Es importante determinar la marcación inespecífica de cada anticuerpo. Para esto, la

muestra en estudio se incuba con un anticuerpo que no reconoce ningún epitope en las
células a marcar, que es del mismo isotipo que el anticuerpo específico que tiene acoplado
el fluorocromo, y que también está acoplado al mismo fluorocromo (control de isotipo).
Esto nos indica la fluorescencia de una población que es negativa para el componente
celular en estudio. Por ejemplo, si el anti-CD3 FITC que se usa para la marcación de una
molécula de superficie es una IgG1, el control de la marcación inespecífica de ese
anticuerpo se realiza con un anticuerpo que debe ser una IgG1 acoplada a FITC pero que
no reconozca a la molécula CD3.
Cuando se estudian simultáneamente dos parámetros de fluorescencia pueden
representarse por un gráfico de puntos o dot plot (Figura 22A). El patrón de fluorescencia
obtenido con los controles de isotipo correspondientes, permite el trazado de cuadrantes
para establecer el límite NEGATIVO-POSITIVO necesario en las lecturas de las muestras.
Una vez establecidos los cuadrantes, se continúa con la adquisición de las marcaciones
específicas de las muestras.
En el estudio de expresión de proteínas, la intensidad de fluorescencia de cada una
de las células en la muestra puede ser representada mediante un histograma (Figura 22B).
En este caso el control de isotipo permite discriminar entre una población negativa y una
positiva para un cierto parámetro.
61
Figura 22: A. Gráfica de puntos de dos parámetros de fluorescencia, FL1 y FL2. B.

Histograma de fluorescencia para FL3.
La citometría de flujo posee algunas ventajas en relación a la microscopia de

fluorescencia. Entre esas ventajas encontramos que pueden emplearse múltiples marcajes,
analizar un elevado número de partículas en corto tiempo, analizar poblaciones celulares o
epitopes y también permite cuantificar las moléculas antigénicas presentes en un
determinado grupo celular. Es una metodología que aporta mayor objetividad y sensibilidad,
pero como emplea una suspensión celular no brinda información sobre la arquitectura de
los tejidos y la interacción entre células.
Cuadro 1: Algunos marcadores de superficie de células del sistema inmune.

Marcadores de superficie Células que expresan ese marcador
CD19, CD20 Linfocitos B
CD3, CD28 Linfocitos T, células NKT
CD4 Linfocitos T helper
CD8 Linfocitos T citotóxicos
CD56 Células NK, células NKT
CD14 Monocitos
CD16 Células NK, células NKT, linfocitos T citotóxicos, monocitos,

neutrófilos
CD25 Linfocitos T y B activados, células NK y NKT activadas
62
Identificación de LT colaboradores por inmunofluorescencia indirecta
FUNDAMENTO:
La separación de una fracción enriquecida en células mononucleares a través de un

gradiente de densidad, y posterior marcación indirecta empleando una técnica
inmunofluorescente, permite la identificación de células inmunocompetentes que presentan
el marcador CD4 en la membrana celular.
OBJETIVO:
 Identificar LT colaboradores mediante la presencia del marcador fenotípico CD4 en su
membrana.
MUESTRA A ANALIZAR:
 Sangre humana recolectada con heparina o EDTA.
 Ficoll-Hypaque, densidad 1, 077 g/ml.

 Buffer PBS, pH 7,4.
 Anticuerpo monoclonal anti-CD4 humano obtenido en ratón.
 Conjugado: Fragmento F(ab´)2 anti-inmunoglobulina de ratón marcado con isotiocianato
de fluoresceína obtenido en conejo.
 Tubos de centrifuga plásticos.
 Pipetas de vidrio.
 Medio de montaje: glicerina tamponada con azida sódica.
 Esmalte de uñas incoloro.
 Portaobjetos.
63
 Cubreobjetos.
 Centrifuga.
 Heladera.
 Agitador Vortex.
 Microscopio de fluorescencia.
PROTOCOLO:
 Diluir un volumen de sangre entera con un volumen de SF. Mezclar.
 Colocar en un tubo de centrífuga 1 ml de Ficoll-Hypaque y depositar sobre él 2 ml de
sangre diluida homogeneizada, por las paredes, lenta y cuidadosamente, formando dos
fases.
 Centrifugar a 1700 rpm a temperatura ambiente durante 20 min.
 Transferir con pipeta Pasteur, con mucho cuidado y de una sola vez, la interfase entre
el Hypaque y el plasma diluido a un tubo de centrífuga de plástico. Descartar el resto.
 Agregar 2 ml de solución de PBS y resuspender con la misma pipeta.
 Centrifugar a 2100 rpm durante 10 min.
 Pipetear el sobrenadante y descartar.
 Resuspender el sedimento con agitador Vortex, en la gota remanente.
 Repetir este lavado dos veces.
 Retirar el sobrenadante mediante una sacudida y secar cuidadosamente con papel
absorbente, de inmediato colocar el tubo en posición vertical.
 Agregar sobre el sedimento 15 l de anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD4 humano.
 Mezclar perfectamente con agitador Vortex.
 Incubar a 4 °C durante 30 min.
 *Resuspender el sedimento con el agitador, agregar 0,5 ml de buffer PBS. Centrifugar
a 2100 rpm durante 5 min. Repetir este lavado 2 veces.
 Secar con papel absorbente el sedimento y colocar el tubo en posición vertical.
 Resuspender con agitador y agregar 10 l de Fragmento F(ab´)2 anti-inmunoglobulina
de ratón marcado con isotiocianato de fluoresceína obtenido en conejo.
 Incubar a 4 °C durante 30 min.
 Lavar como en *.
 Diluir el sedimento con una gota del medio de montaje PBS-glicerina.
64
 Mezclar con agitador.

 Colocar una gota pequeña en un portaobjeto, cubrir con el cubreobjetos y sellar con
esmalte de uñas incoloro.
 Dejar reposar durante 5 min a 4 °C.
 Observar en el microscopio de fluorescencia.
Observar al microscopio de fluorescencia, con luz visible los linfocitos presentes en
un campo determinado y a continuación observar los linfocitos marcados con luz
fluorescente en ese mismo campo.
NOTAS:
 Se aconseja procesar la sangre dentro de las 2 horas de realizada la extracción.
 Los reactivos deben estar a temperatura ambiente en el momento de utilizarlas para
mejorar la eficiencia en la recuperación de las células, la cual decae con bajas
temperaturas de trabajo.
 El mismo procedimiento puede realizarse con material proveniente de médula ósea,
usando una dilución al tercio de la muestra obtenida.
 Si bien los nódulos linfáticos, las amígdalas y el bazo poseen una baja proporción de
granulocitos, la muestra de elección para obtener células mononucleares de seres
humanos es, sin dudas, la sangre periférica por su accesibilidad.
 Si se desea semicuantificar el número de linfocitos CD4 positivos se procede de la
siguiente manera:
- con luz visible se cuentan los linfocitos presentes en un campo determinado.
- se observa con luz fluorescente cuántos de ellos poseen el marcador.
- se continúa con este procedimiento hasta completar un total de 200
linfocitos observados con luz visible.
- se calcula el porcentaje de linfocitos marcados sobre el total de 200.
 El uso de un conjugado como fracción Fab o F(ab´)2 , en los casos donde se emplean
células, evita falsos positivos, ya que la mayoría de las células poseen el receptor para
Fc.
65
MODELO DE INFORME
Identificación de LT colaboradores por inmunofluorescencia indirecta
Objetivo:
Sistema:
Resultado:
Interpretación:
66
MECANISMOS EFECTORES DE LA RESPUESTA

ADAPTATIVA FRENTE A LOS DISTINTOS TIPOS DE
ANTÍGENOS
La inmunidad adaptativa (ver Glosario) se caracteriza por tener una exquisita

especificidad y una memoria que le permite recordar las exposiciones repetidas al mismo
microorganismo, generando respuestas más rápidas y de mayor afinidad. Los anticuerpos
(ver Glosario) son proteínas que ejercen una función clave en la respuesta adaptativa.
Están presentes en la sangre y en las secreciones mucosas y son producidos por las
células plasmáticas (ver Glosario). Son capaces de reconocer a los antígenos microbianos,
neutralizarlos y/o marcarlos como una diana para su eliminación por diversos mecanismos
efectores. Uno de estos mecanismos es la activación del Sistema Complemento por la vía
clásica (ver Glosario) que puede conducir a la muerte del patógeno.
ACTIVACIÓN DEL SISTEMA COMPLEMENTO POR LA VÍA CLÁSICA

La activación se inicia cuando los anticuerpos se unen al primer componente de la
cascada, el complejo proteico multimérico C1. Este complejo está formado por 3
subunidades C1q, C1r, C1s. El C1q es el que se une a los fragmentos Fc de las IgG o IgM.
Cada Fc tiene un único sitio de unión a C1q y cada molécula de C1q debe unirse a dos
cadenas pesadas de inmunoglobulina para iniciar la activación de la vía clásica del
complemento. La IgM tiene una estructura pentamérica, por lo que por sí sola puede unirse
a C1q para activarlo, aunque es necesario su unión al antígeno ya que esto induce un
cambio conformacional que permite la exposición de sus Fc. Por otro lado se necesitan por
lo menos dos moléculas de IgG para activar al C1q y la única manera de que se agrupen es
cuando interaccionan con un antígeno multivalente. Por lo tanto los anticuerpos deben estar
unidos a los antígenos para la activación del complemento y no circulando libremente.
La unión del C1q a los Fc de las inmunoglobulinas provoca una activación enzimática
del fragmento C1r, que a su vez escinde y activa al C1s. Este C1s escinde C4 generando
C4b, que es una molécula análoga al C3b y tiene funciones biológicas similares. Por otra
parte, C1s también escinde la molécula del complemento C2 generando C2b que junto con
67
el C4b forman el complejo C4bC2b llamado C3-convertasa de la vía clásica. Esta enzima
tiene la capacidad de escindir C3 y generar C3a y C3b. Una de las funciones del C3b es
formar parte de la C5-convertasa de la vía clásica (junto con C4b y C2b), que escinde C5
para generar C5a y C5b. Este último inicia el ensamblaje de los componentes finales del
sistema complemento para formar el complejo de ataque a membrana que culmina con la
lisis celular (Figura 23).
ACTIVACIÓN DEL COMPLEMENTO
VÍA CLÁSICA
Se activa por la unión de
anticuerpos específicos a la
superficie del patógeno
PRODUCCIÓN DE:
C3a, C5a C5b-C9 C3b C3bi
Atracción de Perforación de la
Potenciación de
células membrana de los Recubrimiento del
la respuesta B
inflamatorias patógenos por patógeno
formación del favoreciendo la
complejo de ataque fagocitosis
a membrana
MUERTE DEL PATÓGENO
Figura 23: Vía clásica de activación del complemento.
68
Como se vio en el Trabajo Práctico N° 2, el sistema complemento se puede estudiar

desde el punto de vista funcional e inmunoquímico. En este Trabajo Práctico se realizará la
reacción de valoración, un ensayo funcional, para evaluar la activación por la vía clásica
del complemento empleando un sistema antígeno-anticuerpo compuesto por glóbulos rojos
de carnero y su correspondiente anticuerpo (hemolisina). Además se cuantificará un
componente particular del sistema mediante una reacción de precipitación en agar, un
ensayo inmunoquímico, como la inmunodifusión radial cuantitativa (IDRC).
INMUNODIFUSIÓN RADIAL CUANTITATIVA (IDRC)

La IDRC permite cuantificar un antígeno. El antígeno difunde a través de un agar
que contiene un antisuero monoespecífico en concentración constante y en exceso con el
que interacciona. Inicialmente, la concentración elevada del antígeno en la periferia del
pocillo de siembra provoca la redisolución de los complejos inmunes precipitados. A medida
que el antígeno difunde más, la concentración disminuye hasta alcanzar el punto en el cual
las proporciones son óptimas y se forma un halo de precipitación. El diámetro de este halo
es proporcional a la concentración del antígeno. Para cuantificar un determinado antígeno
pueden emplearse las tablas provistas por los fabricantes de los equipos o pueden
construirse curvas de calibrado con testigos de concentraciones conocidas de dicho
antígeno. Para obtener el resultado se ingresa con el radio cuadrado (r2) de la muestra
incógnita y se determina la concentración correspondiente (Figura 24).
2
(r)
2
r3
2
r2
2
r1
C1 C2 C3
Concentración del antígeno (mg/ml)
Figura 24: Curva de calibrado para la determinación de la concentración de un antígeno.
69
Primera parte
Valoración de la vía clásica del complemento en unidades
hemolíticas 50 % (CH50)
FUNDAMENTO:
El complemento tiene la capacidad de fijarse inespecíficamente a complejos antígeno-
anticuerpo y producir lisis si el antígeno es una célula. Si se incuba un suero incógnita, cuyo
complemento se quiere valorar, en presencia de un sistema antígeno-anticuerpo (sistema
indicador) constituido por glóbulos rojos de carnero y su correspondiente anticuerpo
(hemolisina), se producirá la lisis de los eritrocitos. La hemoglobina liberada es un índice de
la actividad funcional de esta vía de activación. Efectuando una batería de tubos con
diluciones del suero se puede expresar la concentración del complemento activado por la
vía clásica en unidades hemolíticas.
TITULACIÓN DE HEMOLISINA
OBJETIVO:
 Determinar la dosis mínima hemolítica (DMH).
 Hemolisina: anticuerpo anti-glóbulo rojo de carnero.
 Glóbulos rojos de carnero al 5 %.
 Suero humano: fuente de complemento.
 Buffer complemento 5X: NaCl 0,94 M, Gelatina 0,66%, Veronal 0,053 M, CaCl2
0,0003 M y MgCl2 0,02 M.
70
 Centrífuga.
PROTOCOLO:
 Preparar 6 diluciones seriadas razón 2 de hemolisina en buffer complemento de trabajo
en tubos de hemólisis, a partir de una dilución de hemolisina 1/100. En el tubo 6,
descartar 0,3 ml de la dilución.
Tubo Buffer de Diluciones de hemolisina Dilución

trabajo
1 0,3ml 0,3ml de la dilución 1/100 1/200
 Preparar en otros 2 tubos los controles de 0 % y 100 % de hemólisis agregando en

ellos 0,3 ml de buffer de trabajo y 0,3 ml de agua destilada respectivamente.
 Agregar los glóbulos rojos al 5 % en todos los tubos, según el siguiente cuadro:
Tubos 1 2 3 4 5 6 0% 100%
lisis lisis
Diluciones de hemolisina (ml) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 - -

Buffer de trabajo (ml) - - - - - - 0,3 -
H2O destilada (ml) - - - - - - - 0,3
Glóbulos rojos al 5% (ml) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
71

suspensión.
 Agregar 0,9 ml de buffer de trabajo en cada tubo de reacción.
 Agregar 0,3 ml de suero humano (fuente de complemento) a cada tubo, mezclar e
incubar 60 min a 37 °C.
 Trasvasar el sobrenadante de cada tubo de reacción a tubos de Khan o de hemólisis
para realizar la lectura.
RESULTADO E INTERPRETACIÓN:
Calcular la fracción de células lisadas dividiendo la absorbancia a 540 nm de cada
tubo por la absorbancia a 540 nm del tubo de 100 % de lisis. Luego construir la curva de la
fracción de células lisadas en función de la dilución de la hemolisina y determinar la dilución
que produce el 50 % de lisis interpolando en la curva.
NOTAS:
 La DMH (dosis mínima hemolítica) es la dilución de hemolisina capaz de sensibilizar
(unirse) al 50% los glóbulos rojos.
 La sangre de carnero se obtiene por punción de la vena yugular del animal. Se mezcla
en partes iguales con la solución de Alsever, suavemente. Se conserva en heladera por
una semana para lograr su estabilización (permitir que todos los glóbulos rojos
adquieran un comportamiento similar).
 La solución de Alsever contiene glucosa (monosacárido) como fuente de energía para
mantener la vitalidad del glóbulo rojo; citrato como anticoagulante; cloruro de sodio para
mantener la isotonicidad y ácido cítrico como buffer.
 La hemolisina es el anticuerpo anti-glóbulo rojo de carnero. Se puede obtener
inoculando conejos adultos con glóbulos rojos enteros o con estroma. Las hemolisinas
así obtenidas difieren en calidad y presentan distinto comportamiento in vitro. La
hemolisina de elección es la obtenida por inmunización de conejos con estroma ya que
tiene un comportamiento más estable en el tiempo y en un mayor rango de diluciones,
72
lo que permite estandarizar la técnica y trabajar con mayor confianza. Antes de su uso,
este suero hemolítico es tratado con calor a 56 °C durante 30 min con la finalidad de
inactivar el complemento presente, que podría interferir en la reacción.
 Si como fuente de complemento se utiliza suero humano se debe realizar la pre-
adsorción del suero para eliminar los anticuerpos heterófilos. Para ello se incuba partes
iguales de suero humano y paquete de glóbulos rojos de carnero. Se incuba en baño de
hielo durante 30 min agitando esporádicamente para mantener las células en
suspensión, se centrifuga a 2000 rpm y se recupera el sobrenadante con el cual se
trabajará.
 También se puede utilizar complemento comercial de cobayo. Tiene una concentración
de 25-40 mg%, buena actividad y buen comportamiento en función del tiempo. Se
adquiere en el comercio liofilizado, se reconstituye en el momento de usar con agua
destilada, según las instrucciones del fabricante y se diluye convenientemente con
buffer complemento de trabajo 1X.
SISTEMA HEMOLÍTICO (SH)
OBJETIVO:
 Preparar el sistema indicador.
 Glóbulos rojos de carnero al 5 %.
 Hemolisina en una dilución adecuada.
PROTOCOLO:
 Se mezclan partes iguales de glóbulos rojos de carnero al 5 % y hemolisina diluida
convenientemente.
 Agregar siempre la hemolisina sobre los glóbulos rojos de a gotas, lentamente, agitando
constantemente en baño de agua a 37 °C. Una vez finalizado el agregado, incubar en
baño de agua 20 min a 37 °C para una correcta sensibilización.
73
VALORACIÓN DEL COMPLEMENTO EN UNIDADES HEMOLÍTICAS 50 % (CH50)
OBJETIVO:
 Estudiar la funcionalidad del sistema complemento semicuantificando su concentración
en unidades hemolíticas 50 % (CH50).
MUESTRA A ANALIZAR:
 Suero humano.
 Sistema hemolítico.
 Buffer complemento 5X: NaCl 0,94 M, Gelatina 0,66%, Veronal 0,053 M, CaCl2
0,0003 M y MgCl2 0,02 M.
 Centrífuga.
PROTOCOLO:
 Preparar 5 diluciones seriadas razón 2 del suero a valorar en buffer complemento de
trabajo en tubos de hemólisis, a partir del primer tubo cuya dilución es 1/5. En el tubo
5, descartar 0,25 ml de la dilución.
74
Tubo Buffer de Suero o diluciones del suero Dilución

trabajo
1 0,4ml 0,1 ml de suero 1/5
2 0,25ml 0,25 ml de dilución 1/5 1/10
3 0,25ml 0,25 ml de dilución 1/10 1/20
4 0,25ml 0,25 ml de dilución 1/20 1/40
5 0,25ml 0,25 ml de dilución 1/40 1/80
 Preparar en otros 2 tubos los controles de 0 % y 100 % de hemólisis agregando 0,25

ml de buffer de trabajo y 0,25 ml de agua destilada respectivamente.
 Agregar el sistema hemolítico como muestra el siguiente cuadro:
Tubos 1 2 3 4 5 0% de 100%
lisis de lisis
Diluciones del suero (ml) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 - -
Buffer de trabajo (ml) - - - - - 0,25 -
H2O destilada (ml) - - - - - - 0,25
Sistema Hemolítico (ml) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

suspensión.
 Agregar 2,6 ml de SF en cada tubo para frenar la reacción, excepto en el tubo control
de 100 % de lisis, al que se le agregan 2,6 ml de agua destilada.
 Trasvasar el sobrenadante de cada tubo de reacción a otros tubos de Kahn o de
hemolisis para realizar la lectura.
Con los datos obtenidos de absorbancia confeccionar la siguiente tabla:
75
X (diluciones Y (Fracción de [Y/(1-Y)] Log [Y/(1-Y)] Log X

del suero) lisis)
1/5
1/10
1/20
1/40
1/80
Graficar Log X (en el eje de las ordenadas, eje y) en función de Log [Y/(1-Y)] (en
el eje de las abscisas, eje x), como se muestra en el siguiente ejemplo:
Valoración de la vía clásica del complemento

en unidades hemolíticas 50 % (CH 50)
2,5
2
Log de X
1,5
0,5
0
-0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6
Log de [Y/(1-Y)]
Para calcular el valor de CH50 se procede como en el Trabajo Práctico Nº 2: obtener

el punto en el que la recta corta al eje de las ordenadas (y). A partir de este valor
determinar las unidades hemolíticas 50 %.
NOTAS:
 Se debe proceder con ciertas precauciones para evitar que se destruyan las fracciones
termolábiles del sistema complemento en el suero a valorar. Una vez extraída la sangre
dejar coagular espontáneamente a temperatura ambiente durante 30 min y separar el
76
suero rápidamente por centrifugación. Refrigerar inmediatamente entre 2 y 4 °C, siendo

útil sólo ese día. Conservado a -70 °C mantiene su actividad durante un año.
 Durante las incubaciones con sistema hemolítico conviene resuspender el paquete
globular periódicamente sin retirar los tubos del baño de agua.
Segunda parte
Valoración de fracción C3 o C4 por inmunodifusión radial cuantitativa
(IDRC)
FUNDAMENTO:
Cuando un antígeno difunde a través de un agar que contiene un antisuero
monoespecífico para dicho antígeno, se producirá un halo de precipitación. El diámetro del
halo será directamente proporcional a la concentración del antígeno, si se mantiene la
concentración del anticuerpo constante y en exceso en el agar.
OBJETIVO:
 Determinar cuantitativamente las fracciones C3 o C4 del sistema complemento en un
suero.
MUESTRA A ANALIZAR:
 Suero humano.
 Placas comerciales de IDRC para valorar C3 o C4.
 Jeringas Hamilton.
 Cámara húmeda.
 Dispositivo para medir halo.
PROTOCOLO:
 Sembrar 5 μl del suero en el que se desea cuantificar la fracción C3 o C4 por
duplicado.
77
 Dejar difundir en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 48 a 72 h o hasta

constancia del diámetro del halo de precipitación.
 Medir el diámetro de los halos de precipitación.
Determinar la concentración de C3 o C4 haciendo uso de la tabla que provee el

fabricante.
NOTAS:
 Se debe tener presente la posible alteración del antígeno y por lo tanto la probable no
correspondencia del anticuerpo utilizado.
 Hay que trabajar con una concentración de anticuerpo constante (homogéneamente
distribuido) y en exceso en el gel utilizado.
MODELO DE INFORME
Primera parte: Valoración de la vía clásica del complemento en unidades hemolíticas
50% (CH50)
Objetivo:
Resultado:
Presentar tabla con los valores obtenidos y la recta confeccionada con algún programa de
computación (Excel, GraphPad Prism, etc).
Segunda parte: Valoración de fracción C3 o C4 por inmunodifusión radial cuantitativa

(IDRC)
Objetivo:
Sistema:
Resultado:
78
Inmunización Activa y Pasiva UNS
INMUNIZACIÓN ACTIVA Y PASIVA
La inmunidad se define como la capacidad de resistencia a la infección y puede
adquirirse en forma activa o pasiva, natural o artificial.
INMUNIZACIÓN ACTIVA
La vacunación es una forma de inmunización activa y artificial en la que se manipula
al Sistema Inmune (SI) con fines profilácticos o terapéuticos. En este caso se enfrenta al SI
con un agente extraño que mimetiza la infección natural primaria, o antígenos derivados de
él, tras lo cual se adquiere inmunidad. Cuando el agente tipo salvaje ingresa, se despliega
rápidamente una inmunidad protectora dada por los anticuerpos circulantes existentes y por
la respuesta secundaria que se genera, con todos sus beneficios. Así mismo, la obtención
de anticuerpos en animales de laboratorio, que luego son extraídos y purificados con
múltiples fines, también se consigue a través de la inmunización activa y artificial.
INMUNIZACIÓN PASIVA
Se conoce como inmunización pasiva al procedimiento por el cual se transfieren
células sensibilizadas o anticuerpos preformados, homólogos o heterólogos, de un individuo
a otro. En consecuencia se confiere inmunidad, aunque temporal ya que no activa la
respuesta inmune propia. Las vías más usadas de inmunización pasiva con preparados de
inmunoglobulinas son la intramuscular y la endovenosa.
En este Trabajo Práctico se abordarán algunos aspectos relacionados con estos
temas. En primer lugar, se discutirá sobre la producción de anticuerpos en animales de
laboratorio (AL). Se considerarán aspectos prácticos a tener en cuenta en el diseño de un
plan de inoculación y aspectos teóricos relacionados con los eventos que se dan en el SI
del animal y condicionarán la producción de anticuerpos. Finalmente, se estudiarán los
79
métodos utilizados para la purificación de inmunoglobulinas, en nuestro caso humanas, que
dan origen a los preparados comerciales utilizados en la seroterapia.
PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS EN ANIMALES DE LABORATORIO
Generalidades sobre el uso de animales de laboratorio

El uso de animales de laboratorio (AL) tiene que estar justificado, asegurándose su
protección, respeto y cuidado (evitar la incomodidad, estrés, dolor). En este sentido se
debe considerar, previamente y cuando sea posible, el reemplazo por un modelo
alternativo no consciente o no sensible. De no ser posible debe procurarse la reducción al
mínimo del número de animales a emplear así como el refinamiento en el trato de los
mismos y la responsabilidad en su uso. El Departamento de Biología, Bioquímica y
Farmacia cuenta con un Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de
Experimentación (CICUAE) el cual tiene como principal función velar por el cumplimiento de
la reglamentación vigente respecto al uso de animales de laboratorio.
Las ratas y los ratones son los animales más empleados en la docencia universitaria
y la investigación. En el campo de la Inmunología es frecuente recurrir a conejos, ratones,
cobayos, ratas, hámster, caballo, cerdo, oveja, cabra, entre otros. La elección de unos u
otros para la producción de anticuerpos dependerá de múltiples variables.
Para generar experimentalmente la respuesta inmune contra un determinado antígeno
se recurre un animal vertebrado, inmunológicamente maduro y que no haya estado en
contacto con dicha sustancia previamente. Esto último hace que dicho animal sea
considerado virgen para esa sustancia. Algunos factores que también determinan la
especie animal a elegir son el volumen de antisuero que se pretende obtener y el acceso a
un lugar cómodo para alojarlos (bioterio) entre otros.
La producción de anticuerpos en un AL permite obtener antisueros del tipo policlonal.
Para esto se lo debe estimular con el antígeno de interés siguiendo un plan de inoculación.
Este plan puede variar de acuerdo a las necesidades y a la respuesta generada. En un plan
80
básico de inmunización la frecuencia de administración es cada quince días por al menos
dos meses.
En la obtención de antisueros, el conejo es uno de los animales más utilizados. Entre
las ventajas de su uso se encuentra el tamaño mediano, la docilidad, la facilidad de manejo,
los hábitos alimenticios, el costo no excesivo de su manutención, la accesibilidad a grandes
vasos sanguíneos en las orejas y, la cantidad y calidad de anticuerpos que se obtienen.
Entre sus desventajas se haya la predisposición a sufrir una gran variedad de
enfermedades.
Adyuvantes
Por lo general, cuando se desea generar una respuesta inmune adecuada contra una
molécula, ésta debe inocularse acompañada de un adyuvante. Sobre todo si la molécula
posee escaso poder inmunogénico o puede ser rápidamente catabolizada por el organismo.
Los adyuvantes son sustancias o preparados químicos que se inyectan junto con el
inmunógeno para hacer más efectiva la respuesta inmune. En consecuencia se puede
producir una mayor concentración de anticuerpos específicos. Además, con su empleo es
posible disminuir la cantidad de antígeno usado por inyección y el número total de
inoculaciones necesarias para alcanzar una respuesta adecuada.
El adyuvante de Freund completo (FCA) es uno de los más utilizados en AL. El
FCA es una emulsión constituida por una parte de un oleato y nueve partes de vaselina
líquida, junto a un macerado de bacilos tuberculosos muertos. La inmunogenicidad
intrínseca de los bacilos promueve el efecto adyuvante ya que incrementa el número de
células del sistema inmune que acuden al sitio de inoculación. La porción oleosa hace que
el antígeno se libere lentamente, en forma gradual, permitiendo un estímulo persistente.
Cuando el adyuvante se prepara sin las micobacterias se denomina adyuvante de Freund
incompleto (FIA). Por su reactogenicidad este tipo de adyuvante no es aplicable en el
hombre. Los más utilizados en seres humanos y que forman parte de algunas vacunas son
81
aquellos basados en sales de aluminio (hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio) y otros
de reciente aparición denominados MF59, AS04 y AS03.
Vías de administración
Cuando se administra una sustancia a un AL por cualquier vía se deberán seguir las
buenas prácticas de cuidado y uso de los mismos, puesto que los errores durante este
procedimiento pueden causar un sufrimiento que es evitable.
Cuando las sustancias son administradas en forma de soluciones, los vehículos más
utilizados son el agua para inyectables y la solución fisiológica estéril. Para compuestos
insolubles en agua se puede emplear algún vehículo orgánico adecuado. Éste debe carecer
de efectos farmacológicos, ser estable en las condiciones de uso y no ser tóxico ni irritante.
Además, debe permanecer fluido a la temperatura a la que será usado y su viscosidad
debe ser la adecuada para facilitar la inyección.
La elección de la vía estará determinada por el inmunógeno empleado, el propósito
del experimento, la especie animal, los posibles efectos de la técnica de administración, la
frecuencia de las inoculaciones y el tipo de adyuvante disponible. Las tres vías más
frecuentes son parenterales: intravenosa (o endovenosa), subcutánea e intradérmica
(Figura 25). No es común la elección de la vía intraperitoneal. Las vías enterales (oral
sobretodo) así como la vía inhalatoria resultan útiles en la inmunización activa en el hombre
(vacunas).
Se debe tener en cuenta que un antígeno soluble no debería inocularse por vía
intravenosa ya que se degradaría rápidamente. En cambio, un antígeno particulado puede
ser inoculado por vía intravenosa, intradérmica o subcutánea sin dificultades. Cuando se
utiliza un adyuvante con componentes oleosos nunca debe ser introducido por vía
intravenosa con el fin de evitar la formación de trombos.
82
Figura 25: Vías más utilizadas en la inmunización.
En el conejo, los lugares de inoculación de elección son el lomo o la parte interna de
las patas traseras, ya que son zonas muy cercanas a las cadenas ganglionares linfáticas,
lo que favorece la generación de una buena respuesta inmune. La vía más común es la
intradérmica. En el punto de inoculación del inmunógeno puede aparecer un granuloma,
que es una reacción de tipo inflamatoria.
Generación de la respuesta inmune que conduce a la producción de
anticuerpos específicos
Localización de la respuesta inmune humoral y celular
El timo es la principal localización donde maduran los LT procedentes de la médula
ósea y el hígado fetal. Luego, los LT maduros vírgenes se dirigen a la zona de LT en los
órganos linfáticos secundarios donde eventualmente se encontrarán con los antígenos
extraños. Los LB se desarrollan, en el hombre, en la médula ósea a partir de precursores
pluripotentes y terminan su proceso de maduración en el bazo. Estos LB maduros vírgenes
se ubican en los folículos de los tejidos linfoides secundarios.
83
La llegada del antígeno a los tejidos linfáticos y la activación de los LT
Cuando un antígeno extraño, como una proteína, traspasa la barrera epitelial, las
células dendríticas (CD) inmaduras lo captan en periferia y lo transportan al ganglio
linfático más cercano. En los casos en que el antígeno sea transportado vía sanguínea, su
encuentro con las CD inmaduras se da en el bazo. Estas CD que han incorporado el
antígeno maduran y migran a zonas de LT de los tejidos linfáticos donde podrán entrar en
contacto con los LT vírgenes. Las CD procesan al antígeno y presentan pequeñas
porciones del mismo sobre moléculas del CMH-II expresadas en su membrana celular. El
contacto de estas CD con LT colaboradores específicos vírgenes genera su activación, la
expansión del clon celular y, la diferenciación a LT efectores y células de memoria. Los LT
activados presentan un aumento en la expresión de CD40L en membrana, un incremento
de la secreción de citoquinas y un cambio en la expresión de receptores de quemoquinas.
Por ello, algunos LT colaboradores efectores pueden migrar al foco de inflamación en
periferia donde, mediante la expresión en membranas de algunas moléculas y la secreción
de citoquinas, aumentan la eficiencia en la actividad de los macrófagos encargados de la
eliminación del agente agresor. Otros LT colaboradores permanecen en los tejidos linfáticos
aunque se dirigen hacia el folículo donde podrán cooperar con los LB en su activación.
La activación de los LB
La unión de un antígeno proteico, que ingresa vía linfática al ganglio, con el receptor
del LB folicular (BCR) inicia el proceso de activación de la célula. En él se ponen en
marcha cascadas de señalización intracelulares que concluyen con la activación de factores
de transcripción que llevarán a la expresión de los genes necesarios para las respuestas
funcionales de los LB activados. Se induce su proliferación, diferenciación y se observa un
aumento en la expresión de moléculas del CMH-II, moléculas coestimuladoras (CD86 y
CD80) y receptores para citoquinas (para aquellas que producen los LT) y quemoquinas.
84
Antígenos T-independientes y T-dependientes
Algunas clases de antígenos, como los polisacáridos o los glucolípidos, poseen
múltiples epitopes idénticos en cada molécula por lo que pueden entrecruzar de forma
eficaz BCR cercanos e iniciar la activación del LB sin colaboración de los LT. Estos
antígenos se conocen como independientes del timo o T-independientes. En cambio, los
antígenos proteicos presentan generalmente una sola copia de cada epitope por molécula,
razón por la cual su capacidad de entrecruzar BCR vecinos sería nula. Es por ello que la
activación adecuada de los LB por este tipo de antígenos requiere de eventos adicionales
relacionados con la cooperación de los LT. Los LB que se activan en esta situación son los
LB2, ubicados en los folículos primarios de los órganos linfoides secundarios. Para que
esto sea posible el complejo proteína-BCR, en este ejemplo, se endocita y se procesa en el
LB que de este modo lo presentará asociado a una molécula de CMH-II en la superficie
celular. Esto permite que los LT colaboradores, específicos y previamente activados,
interactúen físicamente y a través de la liberación de citoquinas con los LB. De esta manera
estos últimos serán capaces de generar una respuesta humoral más eficiente. Estos
antígenos se conocen como dependientes de timo o T-dependientes.
Respuesta inmune a antígenos T-dependientes
En los órganos linfoides secundarios, los LB activados migran hacia la zona de LT.
Los LB situados en la interfase T-B interactúan con los LT colaboradores, de quienes
reciben ayuda a través de CD40L y las citoquinas (IL-2, 4 y 21 principalmente) que éstos
producen. Algunos de estos LB activados dejan este primer foco de proliferación y se
dirigen a los cordones medulares del ganglio linfático donde se diferencian en plasmocitos
de vida corta productores de IgM. La mayoría de los LB migran de nuevo hacia zonas
profundas del folículo donde forman un centro germinal o zona de alta proliferación
(folículo secundario) en la cual se producen el cambio de isotipo, la hipermutación
somática y los fenómenos de selección que dan lugar a la maduración de la afinidad y la
85
generación de los LB de memoria. El área central de esta zona alberga a los centroblastos
en rápida proliferación que se observan rodeados de su progenie, linfocitos de menor
tamaño o centrocitos.
En el centro germinal, los LB activados experimentan el cambio de clase de la
cadena pesada dando lugar a la síntesis de anticuerpos de los isotipos IgA, IgE o IgG que
mantiene la misma especificidad antigénica de la IgM producida inicialmente. En este
fenómeno es crucial la señal que genera CD40 hacia el interior del LB así como la
presencia de determinadas citoquinas producidas por los LT activados que también
migraron desde la zona de interfase T-B junto con los LB.
La maduración de la afinidad da lugar a LB productores de anticuerpos con alta
afinidad por el antígeno que los activó en primer lugar. Este proceso es dependiente de la
colaboración de los LT y ocurre tras la hipermutación somática de los genes que codifican
para la inmunoglobulina. En el centro germinal, el ADN que corresponde al segmento VDJ
de un LB se vuelve propenso a fenómenos de mutación (hipermutación) generando
centrocitos que producen una inmunoglobulina ligeramente diferente en su secuencia de
aminoácidos. Algunas de las mutaciones serán útiles y conseguirán aumentar la afinidad de
unión por el antígeno pero muchas otras generarán una disminución o incluso pérdida de
esa capacidad de unión. Es aquí donde las CD foliculares (CDF) cumplen un rol
importante en el proceso de selección de aquellos LB que expresan el anticuerpo con
mayor afinidad. Estas células son diferentes de las CD que incorporaron y presentaron el
antígeno a los LT. Las CDF poseen largas prolongaciones que forman una red alrededor de
la cual se forman los centros germinales. Estas prolongaciones se hallan en estrecho
contacto con los centrocitos y presentan el antígeno que inicialmente activó a los LB
(Figura 26). Aquellos centrocitos que reconozcan con mayor afinidad al antígeno serán
seleccionados para sobrevivir. Es decir que los centrocitos están predestinados a morir por
apoptosis rápidamente sino son rescatados por el reconocimiento del antígeno sobre las
CDF.
86
Figura 26: La CDF expresa receptores para complemento (CR) y para Fc de Ig (FcR) que
le permiten unirse a antígenos opsonizados.
Finalmente, la progenie generada en los centros germinales se diferencia a células
plasmáticas de larga vida y a LB de memoria. Las células plasmáticas de larga vida
migran a la médula ósea donde son las responsables de la producción de anticuerpos. Los
LB de memoria son los responsable de la rápida respuesta humoral frente a la
reintroducción del antígeno. Estos linfocitos típicamente tienen receptores del antígeno con
afinidad elevada y de isotipos cambiados.
Respuesta inmune a antígenos T-independientes
En general, los polisacáridos y los lípidos logran activar a los LB sin la cooperación
de los LT. Sin embargo, a diferencia de las respuestas T-dependientes, se producen
anticuerpos generalmente de baja afinidad y principalmente IgM con un escaso cambio a
algunos isotipos de IgG. Esto se debe a que dichos antígenos no pueden ser procesados y
presentados adecuadamente por las CPA y en consecuencia no se activan LT específicos
que colaboren con los LB. Las respuestas T-independientes se pueden generar en el bazo,
87
la médula ósea, la cavidad peritoneal y las mucosas. Los linfocitos BZM (LB de la zona
marginal) son un subconjunto de LB que responden principalmente a polisacáridos y
sintetizan IgM luego de ser activados. Por esta razón cumplen un papel muy importante en
la defensa contra las bacterias capsuladas. Otro linaje que responde principalmente a
antígenos T-independiente son los LB1 ubicados en las cavidades peritoneal y pleural.
Respuesta inmune primaria y secundaria
La respuesta inmune que se genera cuando un antígeno T-dependiente es inoculado
por primera vez se conoce como respuesta primaria. Es iniciada por unos pocos linfocitos
que poseen receptores específicos para ese antígeno. La principal clase de anticuerpos que
se generan corresponden al isotipo IgM (a cargo de plasmocitos que no llegaron a cambiar
el isotipo de inmunoglobulina sintetizada) y en menor medida a IgG.
Ante la segunda entrada del mismo antígeno se produce una respuesta inmune,
denominada secundaria, en la que participan principalmente linfocitos de memoria de larga
vida originados en la respuesta primaria. Ahora, los anticuerpos producidos son
principalmente de la clase IgG de alta afinidad (Figura 27A).
La respuesta inmune provocada por un antígeno T-independiente (polisacáridos, LPS,
etc.) no se caracteriza por la generación de linfocitos B de memoria y, en consecuencia,
tanto la respuesta primaria como la secundaria es idéntica. Se encuentran principalmente
anticuerpos de la clase IgM (Figura 27B).
88
Figura 27: Respuestas primarias y secundarias para antígenos T-dependientes (A) y T-
independientes (B).
Sangría exploratriz
Para conocer si el animal estimulado antigénicamente ha respondido o no con la
producción de anticuerpos se deberá realizar una sangría exploratriz. En este procedimiento
se extrae sangre durante el transcurso de un plan de inoculación para la posterior búsqueda
de anticuerpos específicos en el suero.
La especie animal y el volumen necesario determinarán la vía de acceso más
adecuada para la obtención de la muestra de sangre. Cabe tener en cuenta que existe un
máximo volumen extraíble para cada especie y según el peso del animal. Por ejemplo, en
un conejo de 3 kg de peso se pueden extraer hasta 15 ml de sangre aproximadamente sin
producirle alteraciones en su fisiología.
89
PURIFICACIÓN DE INMUNOGLOBULINAS
Diferentes estrategias se pueden emplear para separar, purificar y caracterizar
antígenos o anticuerpos. Estas metodologías son diseñadas y estudiadas por una rama de
la Inmunología llamada Inmunoquímica.
Los anticuerpos, por sus características, no pueden ser sintetizados por métodos
químicos convencionales y por ello se debe recurrir a una fuente natural para obtenerlos:
suero, plasma u otro material biológico, sobrenadante de cultivo, etc.
Para lograr una fracción enriquecida en inmunoglobulinas se puede recurrir a
diferentes métodos clasificados en inespecíficos y específicos. Los primeros utilizan las
propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos (solubilidad, carga eléctrica, tamaño, peso
molecular) o las propiedades biológicas de algunas proteínas (proteína A de
Staphylococcus aureus y/o proteína G de Streptococcus) para separar las
inmunoglobulinas de las restantes proteínas. En cambio, los segundos se valen de las
propiedades inmunológicas de los anticuerpos (la reacción antígeno-anticuerpo) para
purificar aquellos específicos presentes en la mezcla.
Algunos métodos inespecíficos son la precipitación salina, la precipitación con
etanol, y la cromatografía de intercambio iónico. La electroforesis de proteínas es un
método inespecífico muy utilizado aunque con fines analíticos en el control de la
purificación.
Precipitación
Uno de los métodos más empleados para la obtención de inmunoglobulinas a partir
de sueros/plasmas humanos es la precipitación con etanol frío en condiciones controladas,
descrito por Cohn-Oncley. La precipitación de las diferentes fracciones/proteínas del
plasma se produce en función de cinco variables: concentración de etanol, pH, fuerza
iónica, temperatura y concentración proteica. La variación en la concentración de etanol
modifica la constante dieléctrica de las distintas proteínas provocando la precipitación de
90
las menos solubles hasta las más solubles en forma secuencial. Los productos obtenidos se
identifican con números romanos: la fracción II+III da lugar al concentrado de
inmunoglobulinas.
La precipitación salina con sulfato de amonio sobresaturado es otro método muy
utilizado en el laboratorio. La técnica consiste en agregar una solución saturada de iones
pequeños muy cargados, como el sulfato de amonio, a la muestra bajo condiciones
adecuadas de temperatura y pH. Se produce una competencia por las moléculas de agua
de solvatación entre las inmunoglobulinas y la sal (salting out). En consecuencia, las
interacciones proteína-proteína aumentan haciendo que las mismas precipiten.
Una de las principales ventajas de estos métodos es que preservan la estructura de
las proteínas, por las condiciones en que se llevan a cabo, y en consecuencia los
anticuerpos conservan su actividad biológica. Sin embargo, el producto contiene además de
inmunoglobulinas, otras proteínas de alto peso molecular o proteínas que quedan atrapadas
en el precipitado. Por ello, estas técnicas suelen combinarse con otras que permiten
alcanzar un producto de mayor pureza. Entre éstas se encuentran los métodos
cromatográficos.
Cromatografía de Intercambio Iónico (CII)

La CII tiene en cuenta la carga eléctrica de las proteínas en solución. Las proteínas
con una determinada carga se unen a una matriz estacionaria o resina de carga opuesta.
Esta unión es del tipo electrostático y reversible. Luego, la fuerza de esta unión se puede
modificar variando la concentración salina (fuerza iónica) y/o el pH del buffer utilizado
como eluyente.
La resina intercambiadora está constituida por una matriz insoluble inerte, que puede
ser silicato de aluminio, resinas sintéticas o polisacáridos como la celulosa y el dextrano, a
la que se ligan grupos funcionales cargados. La naturaleza de estos grupos es la que
determina el tipo y la fuerza de unión de la resina. Entre las resinas empleadas en el
91
laboratorio de inmunoquímica se hallan la Dietilaminoetil (DEAE)-celulosa y la Carboximetil
(CM)-celulosa, resinas de intercambio aniónico y catiónico débiles respectivamente, las que
deben ser activadas previamente a su uso.
Para la purificación de IgG se puede utilizar la resina DEAE-celulosa y el
procedimiento consta de tres etapas. En una primera etapa se ajustan adecuadamente la
fuerza iónica y el pH de la resina activada y la muestra. En una segunda etapa, se agrega
la muestra que en parte será adsorbida sobre la resina por fuerzas electrostáticas. Por
último, se procede a la elución de la IgG con una solución buffer de mayor fuerza iónica. El
eluido se recoge en fracciones que son controladas por mediciones de absorbancia a 280
nm de longitud de onda en espectrofotómetro. El pico proteico se corresponde con la
presencia de IgG con un alto grado de pureza.
Otras resinas y métodos son también utilizados para la purificación de
inmunoglobulinas totales o clases de inmunoglobulinas. Los descriptos anteriormente son
algunos de los más comunes tanto en los laboratorios de investigación como en la industria
farmacéutica. A nivel industrial, la obtención de hemoderivados (factores de la coagulación,
inmunoglobulinas, albúmina, etc.) se realiza a partir de grandes mezclas de plasma
provenientes de donantes. Los métodos de precipitación (crioprecipitación, precipitación con
etanol) y los cromatográficos (filtración por geles, intercambio iónico y afinidad) constituyen,
en general, las técnicas más utilizadas en la preparación de concentrados de
inmunoglobulinas de aplicación intramuscular (IgIM) y endovenosa (IgIV). Los métodos
cromatográficos generan un producto carente de sustancias vasoactivas, agregados de IgG
y/o pequeñas cantidades de otras proteínas, lo que permite disminuir los efectos adversos
observados con la aplicación de otros preparados de inmunoglobulinas. En la elaboración
de este tipo de productos la seguridad constituye un aspecto de gran relevancia. Por esto
es indispensable un estricto control serológico inicial de las mezclas de plasmas y la
introducción de etapas de inactivación o eliminación viral durante el proceso de producción
y al finalizar el mismo.
92
Primera parte
Producción de anticuerpos en animales de laboratorio
FUNDAMENTO:
La introducción de un inmunógeno mezclado o no con adyuvantes, por una vía
determinada, y siguiendo un plan de inoculación, en un animal de experimentación
vertebrado e inmunológicamente maduro, induce en éste una respuesta inmune mediada
por células y/o anticuerpos.
PLAN DE INOCULACIÓN
OBJETIVO:
 Estimular antigénicamente a un animal de experimentación.
FRECUENCIA DE INMUNIZACIÓN:
 Una inoculación cada quince días por al menos dos meses.
ANIMALES:
 Conejos (Oryctolagus cuniculus).
 Inmunógeno soluble: ovoalbúmina (1mg/ml) mezclada en partes iguales con adyuvante
de Freund completo o incompleto, según el caso.
 Alcohol, algodón.
 Jeringas (2,5 ml) y agujas (20G1).
93
PROTOCOLO
 Elegir la zona del animal donde se realizará la inoculación.
 Depilar y desinfectar con alcohol.
 Colocar el inmunógeno en una jeringa con aguja estéril e inocular 1 ml vía intradérmica.
EXTRACCIÓN DE SANGRE
OBJETIVO:
 Obtener suero inmune específico.
ANIMALES:
 Conejos inmunizados.
 Jeringas (10 ml) y agujas (21G1).
 Alcohol y algodón.
 Tubos de centrífuga.
PROTOCOLO:
 Depilar la oreja del animal.
 Exaltar la arteria mediante masajes.
 Desinfectar con alcohol y extraer sangre con jeringa y aguja.
 Recolectar la sangre en un tubo de centrífuga.
 Dejar coagular a 37°C en baño de agua una hora, o dos horas a temperatura ambiente.
La conservación en heladera toda la noche favorece la retracción del coágulo y permite
la exudación de mayor cantidad de suero.
94
 Luego de coagulada la sangre centrifugar 10 min a 3000-4000 rpm y separar el suero
que puede usarse inmediatamente o conservarse en freezer a -20 °C hasta su
utilización.
SANGRÍA EXPLORATRIZ
OBJETIVO:
 Valorar semicuantitativamente los anticuerpos producidos por un animal de
experimentación durante el desarrollo de un plan de inmunización.
MUESTRA A ANALIZAR:
 Suero inmune de conejo (suero del conejo inmunizado).
 Antígeno soluble: ovoalbúmina (1 mg/ml).
PROTOCOLO
Distintas técnicas inmunológicas se pueden aplicar para la investigación de
anticuerpos en un material biológico como el suero. Muchas de ellas fueron desarrolladas
en el cursado de la materia.
NOTA
 Actualmente, respecto al uso de AL, la normativa vigente a nivel internacional
comprende: a) Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, NIH, National
Academy Press, USA; b) Directiva 2010/63/UE relativa a la Aproximación de las
Disposiciones Legales, Reglamentarias y Administrativas de los Estados Miembros de la
Comunidad Económica Europea respecto a la Protección de los Animales Utilizados
para Experimentación y otros fines científicos.
95
Segunda parte
Purificación de IgG a partir de plasma
FUNDAMENTO:
Una muestra de plasma que es fraccionada en primer lugar por precipitación con
sulfato de amonio es luego utilizada para obtener mediante Cromatografía de Intercambio
Iónico (CII) un producto de mayor pureza en IgG. En este caso, la IgG se adsorbe sobre la
fase estacionaria (DEAE-celulosa) mediante fuerzas electrostáticas y luego es eluida con
una solución buffer de mayor fuerza iónica.
OBJETIVO:
 Purificar IgG por CII a partir de un plasma.
MUESTRA A PURIFICAR:
 Plasma humano previamente fraccionado por precipitación con sulfato de amonio.
 DEAE-celulosa DE23 Whatman, capacidad 0,5 g/g resina seca.

 HCl 0,5 M.
 NaOH 0,5 M.
 BufferTris-HCl 0,2 M, pH 8,5.
 Buffer Tris-HCl 0,01 M, pH 8,5.
 Buffer Tris-HCl 0,01 M, pH 8,5; NaCl 0,05 M.
 Jeringas plásticas.
 Cánulas de plástico.
 Pinzas.
 Soporte universal.
 Papel de filtro.
96
 Pipetas de vidrio de 10 ml.

 Vaso de precipitado de 50 ml.
 Semimicrotubos o tubos de Khan.
 Espectrofotómetro UV/visible.
PROTOCOLO:
Preparación de la muestra
 Dializar la muestra obtenida por precipitación contra buffer Tris-HCl 0,01 M, pH 8,5
durante 24 h a 4 °C o bien diluirla 1/12 con dicho buffer.
Preparación de la columna
Pretratamiento (Activación de la resina)
 Pesar la cantidad necesaria de resina y, en un vaso de precipitado de 50 ml,
resuspenderla en 15 volúmenes de HCl 0,5 M. Lavar la resina hasta que el filtrado
tenga pH 4. Agregar luego 15 volúmenes de NaOH 0,5 M y lavar nuevamente hasta
que el filtrado tenga pH neutro.
 Agregar 15 volúmenes de buffer Tris-HCl 0,2 M, pH 8,5. Ajustar el pH de la mezcla de
ser necesario. Filtrar y repetir la operación. Dejar decantar. Remover el sobrenadante.
Empaquetamiento y equilibrado
 Armar con una jeringa invertida una columna sostenida con pinzas a un soporte.
Conectar las cánulas de plástico a la entrada y salida de la columna. Acoplar a estos
tubos pinzas que permitan regular los flujos. Agregar la resina húmeda a la columna.
Dejar correr el eluyente.
 Pasar a través de la columna buffer Tris-HCl 0,01 M, pH 8,5 hasta que el eluyente
tenga el mismo pH y conductividad que el buffer. Detener el flujo.
97
Cromatografía
 Agregar cuidadosamente la muestra diluida en buffer Tris-HCl 0,01 M, pH 8,5, en la
parte superior de la columna, de manera de no distorsionar el lecho de la resina.
Esperar que se incorpore. Abrir el flujo y pasar a través de la columna 6 ml de buffer
Tris-HCl 0,01 M, pH 8,5. A continuación, pasar a través de la columna 6 ml del buffer
de elución (Tris-HCl 0,01 M, pH 8,5; NaCl 0,05 M).
 Colectar el eluyente en volúmenes de 1,5 ml por semimicrotubo y controlar la aparición
de proteínas por lecturas de absorbancia a 280 nm en espectrofotómetro. El pico
proteico se corresponde con la presencia de IgG.
Se grafica el cromatograma correspondiente: Absorbancia vs. Fracción eluida.
Interpretar, de observarse, el pico de absorbancia.
Si se realiza el control de purificación por electroforesis en gel de poliacrilamida con
SDS (PAGE-SDS), comparar el plasma del cual se partió para la purificación, la fracción
resultante de la precipitación con sulfato de amonio y la muestra purificada por CII.
MODELO DE INFORME
Segunda parte: Purificación de IgG a partir de plasma.
Objetivo:
Resultados: Cromatograma (gráfico).
PAGE-SDS (figura).
Interpretación:
98
El Sistema Inmune en Patologías y Rechazo de Trasplantes UNS
REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD
La inmunidad adaptativa es la responsable de proteger al hospedador de las

infecciones ocasionadas por los agentes patógenos. Sin embargo existen ocasiones en las
cuales la respuesta inmune es capaz de producir lesiones hísticas y enfermedades. Estas
reacciones no deseadas que ocasiona la respuesta inmune se conocen como reacciones
de hipersensibilidad.
Gell y Coombs clasificaron a las reacciones de hipersensibilidad en cuatro grupos
(Cuadro 2), en cada uno de ellos participan de manera secuencial diferentes tipos de
células y mediadores solubles.
Cuadro 2: Reacciones de hipersensibilidad de acuerdo a la clasificación de Gell y Coombs.
TIPO I TIPO II TIPO III TIPO IV
Células y/o IgE IgG/ IgM IgG/ IgM LTh1 LTCD8+

anticuerpos Mastocitos Complemento Complemento LTh17
Basófilos Neutrófilos Neutrófilos Macrófagos
Eosinófilos Macrófagos Macrófagos
LTh2
Activación de Fagocitosis, Activación de Activación de Activación

Mecanismo mastocitos. activación de neutrófilos y macrófagos por IFN-γ de
efector neutrófilos y macrófagos LTCD8+
macrófagos por por
complejos inmunes complejos
fijados a células. inmunes
circulantes.
Asma Fiebre reumática, Enfermedad Diabetes mellitus T1, Dermatitis

Patología alérgica, anemia perniciosa, del suero, artritis reumatoidea, de
rinitis diabetes resistente a nefritis, miocarditis contacto
alérgica, insulina, miastenia vasculitis, autoinmune, TBC:
alergias gravis, citopenias, sinovitis, lesión granulomatosa,
alimentarias, nefritis, vasculitis, fenómeno de lesiones asociadas a
anafilaxia sinovitis. Arthus. autoinmunidad e
infecciones.
99
Un mismo antígeno puede desencadenar diferentes mecanismos de hipersensibilidad.

Por su relevancia médica, podemos mencionar el caso de los antibióticos betalactámicos, y
en particular la penicilina, que es capaz de producir reacciones de hipersensibilidad
mediadas por cualquiera de los cuatro mecanismos anteriormente citados.
Este Trabajo Práctico se relaciona con las reacciones de hipersensibilidad mediadas
por anticuerpos, y en particular, con las reacciones de hipersensibilidad de tipo I y II.
HIPERSENSIBILIDAD DE TIPO I
Dentro de este grupo de afecciones encontramos a las reacciones alérgicas (rinitis
alérgica, conjuntivitis alérgica, asma, dermatitis atópica, alergias alimentarias) y a las
manifestaciones sistémicas agudas y graves como el shock anafiláctico. Las reacciones de
hipersensibilidad de tipo I afectan al 25 % de la población mundial y son mediadas por IgE.
El concepto de atopia (del griego atopos: fuera de lugar) se relaciona muy
estrechamente con las reacciones de hipersensibilidad de tipo I. Los individuos atópicos
presentan una predisposición a producir IgE en respuesta a antígenos inocuos denominados
alérgenos. Los alérgenos más frecuentes son los pólenes, ácaros, cucarachas, hongos,
alimentos, pelos de gatos y perros, algunas drogas, látex, y metales. En general, los
alérgenos presentan las siguientes propiedades:
 Son proteínas de bajo peso molecular, lo que favorece sus propiedades
aerodinámicas.
 Tienen actividad enzimática, casi siempre proteolítica lo que facilita su ingreso a las
mucosas.
 Alta estabilidad por la que pueden mantener sus propiedades físicoquímicas
inalteradas por largo tiempo.
 Alta solubilidad lo que permite su rápida difusión hacia las superficies mucosas con
las que contacta.
 Algunos pueden actuar como haptenos asociándose con proteínas del individuo
atópico a fin de adquirir inmunogenicidad (metales, antibióticos, medicamentos).
100
Etapas de una reacción de hipersensibilidad de tipo I

El antígeno que ingresa por piel, mucosa del árbol respiratorio o tracto gastrointestinal
es captado por células dendríticas para ser presentado a los LTh. El LTh se activará y se
diferenciará a LTh2 secretor de citoquinas como IL4 e IL 13 que colaboran con el LB en el
cambio de clase de inmunoglobulina a fin de producir IgE específica. Esta IgE se fijará al
receptor de alta afinidad (RFcεI) de mastocitos y basófilos. Esta etapa recibe el nombre
de sensibilización.
Cuando el individuo se expone nuevamente al mismo antígeno, éste se une a las IgE
fijadas a mastocitos y basófilos, lo que favorece el entrecruzamiento de los mencionados
receptores. Esto activa una serie de cascadas intracelulares que conducen a la liberación
del contenido de los gránulos que poseen estas células. Los gránulos contienen mediadores
biológicos como histamina, serotonina, proteasas, heparina, peroxidasas, entre otros, que
median los efectos que promueven el desarrollo de los procesos alérgicos. Por ejemplo, la
histamina contrae la musculatura lisa bronquial, relaja la musculatura lisa vascular,
incrementa la permeabilidad vascular (edema), actúa sobre las células dendríticas
inhibiendo su capacidad de estimular la diferenciación de las células TCD4+ hacia un perfil
Th1, promoviendo así la diferenciación hacia un perfil Th2.
Existen dos receptores diferentes que median la unión de la IgE a las células a través
del fragmento Fc: RFcεI y RFcεII (CD23).
El RFcεI pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas. La unión de la IgE al
RFcεI no induce por sí sola la desgranulación del mastocito. Para que esto ocurra será
necesario el entrecruzamiento del receptor inducido por el alérgeno.
El RFcεII pertenece a la superfamilia de las lectinas de tipo C. Es expresado por los
monocitos, macrófagos, células dendríticas, eosinófilos, LB y plaquetas, como también por
las células epiteliales. Reconoce y une dos ligandos: el fragmento Fc de la IgE y la
molécula CD21 (receptor de complemento de tipo 2 que integra el correceptor del LB).
Puede mediar el transporte bidireccional de la IgE a través del epitelio promoviendo la
liberación de anticuerpos IgE en la luz y también el transporte de alérgenos (que se hayan
unido a la IgE) desde la luz hasta los sitios inductivos de las mucosas. Estas acciones
favorecen tanto la desgranulación de los mastocitos como el ingreso de los alérgenos para
poder ser captados por las células dendríticas y los LB. El RFcεII puede ser escindido por
101
proteasas y liberarse como receptor soluble. De esta forma puede interactuar con CD21
brindando una señal estimuladora al LB, promoviendo el cambio hacia IgE y perpetuando
de esta manera el fenómeno alérgico.
ANAFILAXIA
Es una reacción de hipersensibilidad que afecta a más de dos órganos o sistemas.
Está determinada por las características del antígeno, la dosis, la vía de penetración, el tipo
de anticuerpo formado contra ese antígeno, la genética del individuo, entre otros.
Clásicamente está mediada por un mecanismo de hipersensibilidad de tipo I aunque
también puede ocurrir en la hipersensibilidad de tipo II y III.
Los desencadenantes más frecuentes de las reacciones anafilácticas son:
 Alimentos: maní, huevo, mariscos, pescados, leche.
 Medicamentos: antibióticos betalactámicos, aspirina, ibuprofeno.
 Venenos de insectos, látex, polen.
La anafilaxia es un fenómeno inmediato, ya que los inmunocomplejos se forman
rápidamente (segundos o minutos), y está mediada por anticuerpos llamados citotrópicos,
es decir que tienen capacidad de fijarse a células.
Los anticuerpos citotrópicos se clasifican en:
 Homocitotrópicos, si tienen capacidad para fijarse a células homólogas (de la misma
especie). Ej. IgE en el hombre.
 Heterocitotrópicos, si tienen la capacidad de fijarse a células heterólogas (de
especie diferente). Ej. IgG.
Anafilaxia experimental
La anafilaxia es útil para demostrar la participación de los anticuerpos como
mediadores del fenómeno, así como también para estudiar la dinámica propia de la reacción
ya que se puede tener el control, entre otros factores, de la clase de anticuerpos
inoculados.
La anafilaxia puede ser activa (mediada por anticuerpos homocitotrópicos) o pasiva
(mediada por anticuerpos homocitotrópicos o heterocitotrópicos). Tanto la activa como la
pasiva pueden tener manifestaciones locales o generales. Los pasos que se deben seguir
102
para desencadenar una reacción anafiláctica experimental en un animal de laboratorio (AL)

son:
1. Sensibilización del animal:
Se refiere a la existencia en el AL de anticuerpos específicos citotrópicos que pueden
originarse en el mismo animal, en forma activa, o pueden provenir de otro animal. En este
último caso la sensibilización es pasiva y los anticuerpos pueden ser homo o
heterocitotrópicos.
Tanto en la anafilaxia activa como en la pasiva debe esperarse un período de
latencia entre la inoculación del antígeno o de los anticuerpos preformados y, la dosis del
antígeno desencadenante del fenómeno. Durante este período, los anticuerpos citotrópicos
se unen a mastocitos y a basófilos circulantes
2. Administración de la dosis de antígeno desencadenante:

El fenómeno anafiláctico es mediado por la interacción del antígeno con anticuerpos
citotrópicos. El acontecimiento crítico es el entrecruzamiento de los receptores por un
antígeno multivalente que a modo de puente une dos moléculas de anticuerpo vecinas
(Figura 28).
Antígeno multivalente
Anticuerpo citotrópico
Receptor para Fc de Ig
Mastocito/Basófilo
Figura 28: Entrecruzamiento de receptores para Fc de inmunoglobulinas.
Finalmente, ocurre la desgranulación de los mastocitos y basófilos involucrados con

la consecuente liberación de mediadores químicos preformados así como la síntesis de
otros. Entre los mediadores preformados se encuentran la histamina, serotonina, heparina,
proteasa neutra, factor activador de plaquetas, etc. y entre los sintetizados de novo se
encuentran los leucotrienos, prostaglandinas y tromboxanos. Las consecuencias que
produce la liberación de estos mediadores pueden circunscribirse a un tejido en particular
103
(fenómeno local) o bien pueden afectar a todos los tejidos (fenómeno sistémico). En el
laboratorio se observará un video donde se podrá visualizar la experiencia práctica de una
Anafilaxia Cutánea Pasiva, descripta inicialmente por Ovary.
Choque o shock anafiláctico

Cuando un alergeno reingresa en el torrente sanguíneo aún en dosis muy pequeñas,
en un individuo sensibilizado, puede causar la activación de los mastocitos asociados a los
vasos sanguíneos del tejido conectivo. Esto causa una reacción de hipersensibilidad
peligrosa que se conoce como Anafilaxia Sistémica o shock anafiláctico.
Las características de este choque anafiláctico difieren según la especie animal y es
consecuencia, principalmente de los mediadores químicos liberados y de la ubicación de las
células fijadoras de los anticuerpos. En general, se produce contracción de la musculatura
lisa, sobre todo intestinal y bronquial, y aumento de la permeabilidad vascular. El choque
anafiláctico en el hombre es un hecho poco común. Puede ocurrir por la inyección de
sueros antitoxinas (proteínas séricas de caballo), antibióticos, drogas, vacunas, etc. El
tracto respiratorio es el más afectado, pero también se observa picazón en las palmas de
las manos, enrojecimiento de la piel, edema de glotis, disnea y colapso. Por regla general,
ocurre edema obstructivo del árbol respiratorio superior, seguido de hipotensión y muerte.
HIPERSENSIBILIDAD DE TIPO II
Las reacciones de hipersensibilidad de tipo II son mediadas por anticuerpos IgG o
IgM que reconocen antígenos presentes en la superficie celular o en la matriz extracelular.
Estos anticuerpos participan de diferentes maneras en el desencadenamiento de este tipo
de reacción:
 Opsonizan células circulantes promoviendo su fagocitosis por macrófagos. Este
mecanismo puede dar lugar a diferentes citopenias.
 Activan el sistema complemento, a través de la vía clásica promoviendo el
reclutamiento y la activación de neutrófilos, monocitos y macrófagos. Esto conduce
a la aparición de cuadros inflamatorios que afectan preferentemente el glomérulo
renal (glomerulonefritis), pequeños vasos (vasculitis) y las articulaciones (sinovitis).
104
Algunas de las patologías producidas por acción de anticuerpos dirigidos contra

antígenos expresados en la superficie celular o en la matriz extracelular son: Eritroblastosis
fetal, Anemia hemolítica autoinmune, Vasculitis, Púrpura trombocitopénica idiopática,
Sindrome de Goodpasture, Enfermedad de Graves, Fiebre reumática, Anemia perniciosa,
etc.
Como ejemplo de reacción de hipersensibilidad de tipo II se hará referencia a la
Eritroblastosis Fetal y en particular a la reacción de Coombs como metodología de
laboratorio que permite detectar los anticuerpos específicos responsables de la patología.
Eritroblastosis fetal
La Eritroblastosis fetal es una enfermedad grave que puede llevar a la muerte del
feto. Se caracteriza por anemia hemolítica en grado variable. La hiperbilirrubinemia,
secundaria al proceso hemolítico, puede ocasionar daño neurológico. En la mayoría de los
casos es ocasionada por incompatibilidad Rh, aunque también puede ser secundaria a
incompatibilidad de otros grupos sanguíneos (sistema ABO).
Durante el trabajo de parto es frecuente que cierto volumen de sangre escape desde
la circulación fetal hacia la circulación materna. Además puede ocurrir que existan
microfisuras placentarias que también favorezcan este pasaje. Estas razones hacen que si
los glóbulos rojos del feto son Rh (+) y los de la madre son Rh (-), ella se sensibilice y
desarrolle anticuerpos contra el antígeno D. En un embarazo posterior, si los glóbulos rojos
del feto fueran Rh (+), los anticuerpos IgG maternos podrán atravesar la placenta (que
posee receptores para el fragmento Fc de la IgG), y opsonizar a los eritrocitos fetales que
serán eliminados y destruidos por el sistema mononuclear fagocítico, fundamentalmente por
células de Kupffer del hígado y los macrófagos esplénicos.
Cabe destacar que la IgG unida a la superficie del eritrocito no puede activar la vía
clásica del complemento, ya que la densidad de antígenos D expresada en la membrana
del eritrocito es baja.
La enfermedad hemolítica del recién nacido puede prevenirse mediante la
inmunización pasiva de la madre con un concentrado de anticuerpos del isotipo IgG que
reaccionan con el antígeno D (inmunoglobulina anti-D). Las mujeres Rh (-) deben recibir
105
esta inmunoglobulina en dos momentos: en la semana 28 de gestación y dentro de las 72

horas posteriores al parto.
Desde el punto de vista diagnóstico, es importante señalar que los anticuerpos anti-
Rh de la clase IgG no son capaces de aglutinar in vitro los eritrocitos Rh (+) debido a la
baja densidad de antígenos D expresada en superficie. La aglutinación de los eritrocitos
recubiertos por IgG anti-D puede ponerse de manifiesto mediante la reacción de Coombs,
que también es de utilidad para detectar anticuerpos incompletos o bloqueantes. Esta
reacción emplea un suero, llamado suero de Coombs, constituido por una mezcla de
anticuerpos anti-IgG y anti-C3 (fracción de complemento). La Prueba de Coombs puede
ser directa o indirecta.
 Coombs directa: Detecta los anticuerpos IgG maternos unidos a la superficie de los
eritrocitos del feto o del recién nacido. El agregado del suero de Coombs a los
eritrocitos inducirá aglutinación sólo en el caso de que éstos estén opsonizados por
IgG maternas. Otra utilidad de esta prueba es la identificación de anticuerpos sobre
eritrocitos de pacientes que padecen Anemia Hemolítica Autoinmune.
 Coombs indirecta: Permite detectar anticuerpos IgG anti-Rh en el suero materno a
fin de determinar si la madre se ha sensibilizado frente al antígeno D. Esta reacción
también se utiliza para investigar la presencia de anticuerpos incompletos en el
suero de pacientes con enfermedades crónicas bacterianas, como es el caso de la
brucelosis.
106
Primera parte
Anafilaxia cutánea pasiva (ACP)
FUNDAMENTO:
Se inocula a un ratón, vía intradérmica, el suero de un animal inmunizado, se espera
un período de latencia para permitir la fijación de los anticuerpos a las células granuladas
basófilas y mastocitos y luego se inyecta el antígeno mezclado con Azul de Evans por vía
intravenosa. La interacción antígeno-anticuerpo a nivel de los capilares provoca la liberación
de mediadores químicos que alteran la permeabilidad capilar y producen la extravasación
del colorante inyectado. Se observa una mancha azul en el punto de inoculación inicial lo
que demuestra la correspondencia entre antígeno y anticuerpo.
OBJETIVO:
 Demostrar la participación de anticuerpos específicos citotrópicos (IgG) en el fenómeno
de anafilaxia experimental.
MUESTRA A ANALIZAR:
 Suero de conejo inmunizado activamente con ovoalbúmina.
 Ratones no inmunizados.
 Antígeno: ovoalbúmina (OVA) 0,2 % en SF.
 Colorante: Azul de Evans 1 % en SF.
 Jeringas tipo tuberculina y agujas 25G5/8’’.
 Algodón. Alcohol. Tijeras.
PROCEDIMIENTO:
 Rasurar la región dorsal del animal.
107
 Inocular en esa zona 0,1 ml de suero anti-ovoalbúmina vía intradérmica.

 Inocular a no menos de dos centímetros de la inoculación anterior 0,1 ml de SF como
control.
 Esperar 3 h como mínimo (período de latencia).
 Inocular vía intravenosa 1 ml de una mezcla de partes iguales de solución antigénica y
colorante.
 Cumplido el período de desencadenamiento de 30 min como mínimo, sacrificar el
animal, quitar la zona de piel rasurada y observar por transiluminación.
Para realizar la lectura debe comprobarse que en la zona de inoculación del control
no se observe mancha.
Al observar la zona de inoculación del anticuerpo pueden darse dos situaciones:
Situaciones Observación Resultado Interpretación
1 Mancha azul Positivo Especificidad antígeno-

anticuerpo
2 No mancha azul Negativo No especificidad antígeno-
anticuerpo
La intensidad y el tamaño de la mancha dependen del grado de sensibilización del

animal. Se puede medir el diámetro de las manchas y obtener el grado de positividad de la
reacción. Se expresa en cruces:
Diámetro del halo (cm) Grado de positividad
0,5 +/-
1 +
1,5 ++
2 o más +++/++++
108
NOTAS:
 La aparición de una mancha azul en la zona de inoculación del antisuero es debida a la
extravasación del colorante de alto peso molecular producida por la alteración de la
permeabilidad capilar.
 El anticuerpo citotrópico puede ser bivalente, monovalente o incompleto.
 La dosis desencadenante de antígeno debe ser la adecuada para permitir la formación
del complejo antígeno-anticuerpo.
 El período de latencia varía según la concentración del anticuerpo y según la especie
animal.
 No se deben producir lesiones en la piel del animal pues esto conduciría a
extravasaciones no específicas del colorante.
 Utilizando este modelo experimental también se pueden determinar dosis mínimas
sensibilizantes de anticuerpos así como las condiciones óptimas de sensibilización.
 Es una reacción muy sensible: 1 μg/ml de antígeno desencadena la reacción
anafiláctica.
 Como animal de experimentación también se puede utilizar el cobayo.
Segunda parte
Identificación de anticuerpos anti-Rh por reacción de Coombs
indirecta
FUNDAMENTO:
Los anticuerpos anti-Rh presentes en un suero al ponerse en contacto con glóbulos
rojos O Rh positivo no producen aglutinación visible debido a la baja densidad del antígeno
D sobre la membrana. Su presencia se detecta agregando en una segunda etapa un suero
antiglobulina o suero de Coombs que producirá una aglutinación visible.
OBJETIVO:
 Identificar anticuerpos anti-Rh en un suero.
109
MUESTRA A ANALIZAR:
 Suero humano.
 Antígeno: suspensión de glóbulos rojos O Rh positivo al 3 % en SF.
 Suero de conejo antiglobulina humana: Suero anti-inmunoglobulina G y anti-fracción C3
humanos obtenidos en conejo.
 Tubos de hemólisis.
 Baño de agua a 37 °C.
 Gradillas.
 Centrífuga.
PROTOCOLO:
Reactivo Tubo1 Tubo 2

(de reacción) (control)
GR O Rh+ al 3 % 0,1 ml 0,1 ml

Suero a investigar 0,2 ml ------
SF ------ 0,2 ml
 Incubar en un baño de agua a 37 °C durante 1 h.

 Lavar tres veces con SF en una relación de 20 volúmenes por cada volumen de
glóbulos rojos. Luego de cada centrifugación desechar el sobrenadante y antes de
agregar nuevamente la solución de lavado, resuspender el sedimento.
 Agregar a cada tubo 0,1 ml de suero de conejo antiglobulina humana.
 Incubar 15 min en baño de agua a 37 °C. Centrifugar.
 Resuspender y observar si hay aglutinación.
110
Una vez que se ha verificado que el tubo control da correctamente, se procede a
hacer la lectura en el tubo de reacción, pudiéndose dar dos situaciones:
Tubo de reacción Observación Resultado Interpretación
Situación 1 Presencia de grumos Positivo Presencia de anticuerpos anti-Rh

Situación 2 Ausencia de grumos Negativo Ausencia de anticuerpos anti-Rh
NOTAS:
 Esta determinación puede realizarse en forma semicuantitativa efectuando diluciones
seriadas del suero a valorar. En este caso se determina el título.
 La prueba de Coombs indirecta también es de utilidad para investigar la presencia de
anticuerpos incompletos o bloqueantes que se producen en mayor concentración
relativa por la multiestimulación con antígenos particulados tanto en el hombre como en
los animales (ej: brucelosis crónica). Estos tienen la capacidad de unirse a su antígeno
específico pero son incapaces de generar reacciones visibles por sus características
fisicoquímicas. Recordar que se debe contar con un suero antiglobulina que reconozca
los anticuerpos incompletos o bloqueantes de la especie en estudio.
MODELO DE INFORME
Identificación de anticuerpos anti-Rh por reacción de Coombs indirecta.
Objetivo:
Sistema:
Resultado: Positivo/Negativo
Interpretación:
111
AUTOINMUNIDAD
La Autoinmunidad se define como la presencia de LT con reactividad contra lo

propio o de anticuerpos autorreactivos y la Enfermedad Autoinmune como la secuela
patológica de una respuesta inmune. La detección de LT autorreactivos o de los
autoanticuerpos permite estudiar desde el laboratorio a las enfermedades autoinmunes. El
análisis de los LT autorreactivos no es fácil de implementar en un laboratorio clínico, sin
embargo es más sencillo demostrar la presencia de autoanticuerpos, lo que constituye la
principal herramienta en el diagnóstico de las patologías autoinmunes.
En relación a la identificación de los autoanticuerpos se debe tener en cuenta que
pueden encontrarse en individuos sin enfermedad aparente en bajos títulos y que su
detección requiere de un umbral. Solamente los títulos que están sobre ese umbral tienen
significado clínico. La ausencia de los autoanticuerpos no descarta un desorden
autoinmune.
Las enfermedades autoinmunes son multifactoriales en cuanto a sus causas. Entre
los principales factores se encuentran los genéticos, los hormonales y/o los ambientales.
Según la distribución de los tejidos afectados las podemos clasificar en:
 Enfermedades órgano-específicas: la respuesta inmune está dirigida a antígenos de
determinados órganos o glándulas. Se caracterizan por la presencia de autoanticuerpos
específicos de órgano.
 Enfermedades no órgano-específicas o sistémicas: la respuesta inmune está dirigida
frente a antígenos no específicos de órgano. Se asocian con anticuerpos antinucleares.
Los mecanismos de daño predominantes están dados por complejos inmunes
circulantes y pueden afectar múltiples órganos.
ANTICUERPOS ANTINUCLEARES (ANA)

La presencia de ANA es el denominador común de muchas enfermedades
autoinmunes sistémicas. La frecuencia es alta en Lupus Eritematoso Sistémico (LES),
Síndrome de Sjögren, Esclerodermia, Enfermedad Mixta del Tejido Conectivo y
Hepatopatías Autoinmunes, entre otras. Su presencia en las distintas patologías tiene valor
113
diagnóstico, pronóstico y de monitoreo, sin embargo también pueden estar presentes en

enfermedades infecciosas, pacientes sanos y en personas de edad avanzada.
La primera referencia a la presencia de ANA surge en el año 1948, cuando se
describen las células LE. Estas células son leucocitos polimorfonucleares que han
incorporado material nuclear opsonizado por autoanticuerpos. Estos autoanticuerpos
estaban dirigidos contra diferentes componentes nucleares. Hacia fines del año 1950 se
desarrolló la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) empleando como sustratos
cortes de tejidos de hígado o riñón de rata o ratón. En los últimos años se han
incorporado líneas celulares como sustrato para la detección de ANA por IFI, siendo las
HEp-2 las más usadas.
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) PARA LA

INVESTIGACIÓN DE ANA
El método recomendado actualmente para detección de autoanticuerpos es la IFI
empleándose como sustrato tejidos animales o células de cultivo, según las características
del autoanticuerpo que se quiera detectar (Figura 29).
Figura 29: Inmunofluorescencia indirecta.
114
El fundamento de la IFI consiste en incubar cortes de tejido o monocapas de células

fijadas y permeabilizadas, con el suero diluido del paciente. Después de lavados, que
eliminan los anticuerpos no unidos al sustrato, se incuba con anti-inmunoglobulina humana
conjugada con isotiocianato de fluoresceína. Posteriormente se lava, se realiza el montaje y
se observa en el microscopio la fluorescencia de las estructuras celulares que se han unido
a sus anticuerpos específicos.
Por ser una técnica manual y subjetiva requiere de un observador muy experimentado
para la lectura de los resultados. Esto hace necesario la estandarización de las distintas
variables propias de esta técnica lo que permite asegurar la calidad en la determinación de
los ANA. Entre estas variables se pueden mencionar:
 Microscopio de fluorescencia: dada la variedad de fuentes de luz y filtros disponibles,
la elección del microscopio es muy importante. Las lámparas pueden ser halógena, de
mercurio o sistema de LED. La magnificación recomendada para la observación de los
preparados es de 400X.
 Recolección y almacenamiento de las muestras: se emplea suero. Este debe
conservarse entre 2 y 8 °C si se procesa dentro de las 72 h, de lo contrario se debe
conservar a -20°C. Evitar congelamientos y descongelamientos sucesivos que podrían
alterar los resultados. No usar muestras muy hemolizadas o lipémicas.
 Elección del sustrato: Durante muchos años se utilizaron cortes de hígado o de riñón
de rata o ratón para la detección de anticuerpos antinucleares y/o anticitoplasmáticos.
En la actualidad han sido reemplazados por monocapas de células tumorales, siendo
las más utilizadas las células epiteliales humanas procedentes de un carcinoma laríngeo
mantenidas en cultivo conocidas como HEp-2 (Figura 30). Las ventajas de utilizar
células HEp-2 en lugar de tejidos de roedores son:
- Es un sustrato más sensible porque presenta mayor concentración de antígenos.
- Tiene mayor especificidad por ser de origen humano.
- Al provenir de un cultivo celular asincrónico permite la detección de anticuerpos
contra múltiples estructuras nucleares, citoplasmáticas y relacionadas con la
división celular.
- Los núcleos presentan mayor tamaño por lo que los patrones de fluorescencia
son más fáciles de visualizar.
- La distribución antigénica es uniforme.
115
Figura 30: Distribución celular de los antígenos en las HEp-2.
 Conjugado fluorescente: Los anticuerpos conjugados con isotiocianato de fluoresceína

son los más usados.
El conjugado puede ser anti-IgG o anti-GAM. La mayoría de los autoanticuerpos
asociados a enfermedades autoinmunes sistémicas son de isotipo IgG. La relación
Fluoresceína (F)/Proteína (P) debe estar entre 2,5-4,0. Si la relación F/P es mayor,
aumentará la tinción fluorescente no específica y si es menor disminuirá la
fluorescencia específica obteniéndose resultados falsos negativos. La relación
Anticuerpo específico/Proteína debe ser aproximadamente 0,1 o mayor, si es menor
disminuye la especificidad.
La concentración final (dilución de trabajo) del anticuerpo marcado específico debe
estar entre 30 y 60 µg/ml. La dilución de trabajo es determinada por titulación. Para
ello se debe contar con un suero de referencia de título conocido (control positivo, C
(+)) y con un suero negativo (control negativo, C (-)). Se realiza la determinación
frente a diluciones seriadas del conjugado, por ejemplo 1/50, 1/100, 1/200, 1/400 y
1/800, enfrentándolas con diluciones seriadas del C (+) y C (-). Estas diluciones
deben cubrir el rango por encima y por debajo del título asignado al C (+). Por
ejemplo, si el control positivo tiene un título de 1/640, se pueden obtener los
resultados que figuran en el siguiente cuadro:
116
Cuadro 3: Titulación del anticuerpo conjugado.
Se define como título plateau a la mayor dilución del C (+) que es positivo en al
menos tres diluciones diferentes y consecutivas del conjugado, luego el título cae
abruptamente. En el ejemplo: 1/640.
La mayor dilución del conjugado que permite obtener el plateau se denomina punto
final del plateau. En el ejemplo: 1/400.
La dilución óptima de trabajo del conjugado es un cuarto de la dilución del punto final
del plateau. En el ejemplo: 1/100.
Además se debe realizar un control de PBS (control de coloración inespecífica).
La titulación del conjugado debe realizarse cada vez que se use un lote nuevo de
conjugado, si se cambia el sustrato o la lámpara del microscopio o ante la falta de
resultados adecuados en los controles.
La IFI también resulta adecuada para la detección de otros autoanticuerpos como

anti-músculo liso, anti-citoplasma de neutrófilo, anti-endomisio, anti-mitocondria, etc. Se
deben utilizar cortes de tejidos o células según la especificidad del anticuerpo que se quiere
detectar.
117
Investigación de anticuerpos antinucleares por inmunofluorescencia

indirecta.
FUNDAMENTO:
Empleando como sustrato células HEp2 obtenidas en cultivo y dispuestas en
monocapa en una impronta y un anticuerpo anti-gammaglobulina humana marcado con
isotiocianato de fluoresceína, es posible identificar en el suero de un individuo la presencia
de autoanticuerpos mediante la técnica de inmunofluorescencia indirecta.
OBJETIVO:
 Investigación de anticuerpos antinucleares en un suero.
MUESTRA A ANALIZAR:
 Suero humano.
 Sueros control positivo y negativo.
 Anti-gammaglobulina humana marcada con isotiocianato de fluoresceína obtenida en
cabra.
 Improntas HEp2.
 Jarras de Coplin.
 Buffer PBS, pH 7,2.
 Cubreobjetos.
 Medio de montaje: glicerina tamponada.
 Microscopio de fluorescencia.
118
PROTOCOLO:
 Diluir el suero desconocido 1/80 en PBS.
 Cubrir bien los pocillos de la impronta con el suero control positivo, suero control
negativo y dilución del suero incógnita, sin tocar el pocillo con el tip.
 Incubar durante 30 min en cámara húmeda a temperatura ambiente.
 Lavar en jarra de Coplin con buffer PBS 2 veces durante 5 min cada vez.
 Retirar y secar los bordes con papel absorbente sin tocar los sustratos. Evitar que estos
se sequen completamente.
 Cubrir con anti-gammaglobulina marcada diluida convenientemente (dilución de trabajo
obtenida mediante la titulación del conjugado).
 Incubar 30 min en cámara húmeda a temperatura ambiente y al resguardo de la luz.
 Lavar en jarra de Coplin con buffer PBS 2 veces durante 5 min cada vez.
 Retirar, quitar el exceso con papel absorbente.
 Colocar unas gotas de medio de montaje entre áreas reactivas y cubrir con un
cubreobjetos limpio y desengrasado.
 Realizar la observación microscópica en cuarto oscuro.
Observación Resultado Interpretación
Patrón fluorescente nuclear Positivo Presencia de anticuerpos

y/o citoplasmático definido específicos
No se discrimina un patrón Negativo Ausencia de anticuerpos
fluorescente definido específicos
Un resultado positivo debe estar acompañado por el título y el patrón correspondiente.
NOTAS:
 Las improntas deben sacarse del envase inmediatamente antes de su uso.
119
 Los lavados permiten eliminar el exceso de proteínas no fijadas. Al realizarlos, evitar

agregar el buffer directamente sobre la impronta.
 El pH del líquido de montaje debe ser 8,0 o mayor.
 La titulación del conjugado es indispensable, ya que permite la correcta diferenciación
entre un resultado positivo y uno negativo.
 Toda muestra positiva debe ser titulada para lo cual se realizan diluciones razón 2 del
suero a partir de la dilución inicial de trabajo. Se repite la técnica y se determina el título
que estará dado por la inversa de la mayor dilución del suero que da positivo.
 Los sueros control positivo y negativo provistos en el equipo comercial se usan sin
diluir. Sin embargo, también pueden usarse sueros humanos positivos y negativos
comprobados, diluidos 1/80 en PBS.
 Comprobar que el resultado de los controles sea el esperado, caso contrario se invalida
la determinación.
 En esta técnica es muy importante el entrenamiento del observador, que condiciona la
positividad o negatividad de un resultado.
 Los patrones de fluorescencia son orientativos del autoanticuerpo involucrado siendo
necesario el empleo de técnicas como LIA, ELISA o western blot para poder definir la
correcta especificidad.
 Según el Primer Consenso Argentino para la Estandarización de la Determinación de
Anticuerpos Anti-Nucleares por Inmunofluorescencia Indirecta-HEp-2 se debe informar
el patrón de fluorescencia nuclear y el patrón de fluorescencia citoplasmática, indicando
el título en cada caso.
MODELO DE INFORME
Trabajo Práctico Nº 8
Investigación de anticuerpos antinucleares por inmunofluorescencia indirecta
Objetivo:
Resultado:
Positivo/negativo.
Patrón.
Interpretación:
120
INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS
Las inmunodeficiencias primarias (IDP) son un grupo heterogéneo de

enfermedades genéticas de muy baja incidencia, caracterizadas por alteraciones cualitativas
o cuantitativas que comprometen, en forma individual o combinada, los distintos
componentes del sistema inmune: los LB responsables de la inmunidad humoral, los LT
responsables de la inmunidad celular, el sistema fagocítico (polimorfonucleares y
mononucleares) y/o el sistema complemento. El conocimiento de las IDP ha contribuido a
la comprensión de muchas funciones normales del sistema inmune.
La incidencia de estas enfermedades es de 1 cada 10000 recién nacidos vivos,
siendo el 65 % debido a deficiencias humorales, 5 % a celulares, 15 % son IDP
combinadas (celular/humoral), 10 % afectan a células fagocíticas y el 5% restante son
deficiencias del complemento. Los defectos inmunitarios pueden ser cuantitativos o
funcionales.
La principal manifestación de las IDP es la aparición de infecciones causadas por
bacterias, virus, parásitos u hongos, que resultan ser no patógenos para la población
inmunocompetente. Estas infecciones son generalmente graves y complicadas, y además
recidivantes y prolongadas en el tiempo. El tipo de microorganismo (bacterias, virus,
hongos, parásitos) prevalente en cada paciente guarda relación con el tipo de
inmunodeficiencia que éste padece. Estos procesos infecciosos no se limitan a un solo
órgano, sistema o localización, y se repiten en distintas localizaciones y sistemas a lo largo
del tiempo.
Dado que se trata de enfermedades bastante infrecuentes, siempre deben tenerse en
cuenta otras causas predisponentes de infecciones recidivantes, como las enfermedades
metabólicas, las malformaciones estructurales (en el aparato respiratorio o urinario por
ejemplo) y el tratamiento con inmunosupresores. A su vez, hay infecciones, como es el
caso de la infección por HIV, que pueden causar inmunodeficiencia (inmunodeficiencia
secundaria).
121
EL DIAGNÓSTICO DE LAS IDP

Existen varias clasificaciones de las inmunodeficiencias primarias. La LAGID (Latin
American Group of Immunodeficiencies) según el fenotipo, describe las siguientes
categorías diagnósticas:
 Deficiencias combinadas (celulares y humorales).
 Deficiencias predominantes de anticuerpos.
 Deficiencias celulares y de anticuerpos asociadas a otros defectos mayores (como los
síndromes de ataxia telangiectasia y de Wiskott Aldrich, entre otros).
 Inmunodeficiencias asociadas con defectos del fagocito.
 Defectos del complemento.
El estudio de laboratorio básico para el diagnóstico correcto de una inmunodeficiencia
primaria consiste en:
 Hemograma con recuento y fórmula leucocitaria.
 Estudio de las principales subpoblaciones de linfocitos circulantes (T, B, NK y dentro
de las T: CD4+ y CD8+).
 Búsqueda de anticuerpos preexistentes (isoaglutininas).
 Cuantificación de inmunoglobulinas séricas (IgA, IgG e IgM).
Si alguno de estos parámetros no se encuadra dentro de los valores considerados
normales, el diagnóstico se enfocará hacia una inmunodeficiencia primaria. Si dieran
normales, se siguen con otras pruebas elegidas en base a la sintomatología del paciente.
Entre los estudios que se realizan hay ensayos cuantitativos y funcionales.
En este Trabajo Práctico se hará referencia a dos de estas determinaciones, la
semicuantificación de isoaglutininas y la cuantificación de inmunoglobulinas.
ISOAGLUTININAS ANTI-A Y ANTI-B

Los eritrocitos humanos presentan en la superficie los aloantígenos del sistema ABO.
Su presencia o ausencia permite clasificar a los glóbulos rojos en grupos sanguíneos A, B,
AB u O. El polimorfismo genético ABO genera finalmente diferencias en los carbohidratos
de los glucolípidos presentes en la superficie de los glóbulos rojos (ver Trabajo Práctico N°
1).
122
En el suero de los seres humanos están presentes de manera natural anticuerpos

que reaccionan con los antígenos A y/o B del sistema ABO. Los determinantes antigénicos
de los glóbulos rojos humanos se comportan como antígenos timo-independientes y
estimulan solo la producción de anticuerpos del isotipo IgM (Cuadro 4). Cada individuo
genera anticuerpos que reconocen el determinante antigénico que no posee en sus propios
glóbulos rojos.
Cuadro 4: Antígenos de membrana de los eritrocitos e isoaglutininas séricas de acuerdo al

grupo sanguíneo.
Grupo sanguíneo Antígeno presente en la membrana Isoaglutininas

del glóbulo rojo (anticuerpos séricos)
A A Anti-B
B B Anti-A
AB AyB No posee anticuerpos
O No posee antígenos A ni B Anti-A y Anti-B
Estos anticuerpos que se conocen con el nombre de isoaglutininas se forman como

consecuencia del estímulo continuo que generan los determinantes antigénicos A y B
presentes en bacterias del tracto gastrointestinal, como por ejemplo Escherichia coli.
La investigación de isoaglutininas se realiza para determinar incompatibilidades en la
transfusión sanguínea (son responsables de la hemólisis masiva de los eritrocitos
transfundidos porque activan el sistema complemento por vía clásica). También se realiza
previo a un trasplante de órganos para detectar el grado de sensibilización del receptor.
Otra utilidad es para evaluar la respuesta inmune humoral ante la sospecha de una IDP ya
que estos anticuerpos se generan en forma natural desde muy temprana edad como
consecuencia de la colonización bacteriana del intestino poco después del nacimiento.
CUANTIFICACIÓN DE INMUNOGLOBULINAS
El método de elección para cuantificar las inmunoglobulinas de mayor concentración
sérica, como son la IgG, IgA e IgM es la IDRC. El fundamento de este método ha sido
explicado en el Trabajo Práctico N° 5.
123
Primera parte
Semicuantificación de isoaglutininas por aglutinación lenta en tubo
FUNDAMENTO:
Si se efectúan diluciones seriadas de un suero en el cual se quiere investigar la
presencia de isoaglutininas (anticuerpos dirigidos contra los determinantes antigénicos del
sistema ABO) y se agrega un volumen constante de una suspensión de glóbulos rojos que
presenten el isoantígeno correspondiente, es posible determinar el título de dichos
anticuerpos.
OBJETIVO:
 Semicuantificar isoaglutininas en un suero.
MUESTRA A ANALIZAR:
 Suero humano inactivado 30 min a 56 °C.
 Antígeno: suspensión de hematíes del grupo A o B al 2,5 % en SF.
 Semimicrotubos o tubos de Khan y gradillas.
PROTOCOLO:
 Preparar una serie de ocho semimicrotubos.
 En el primero colocar 0,4 ml de SF y en los siguientes 0,25 ml de la misma solución.
 Al primer tubo agregar 0,1 ml de suero anti-A o anti-B inactivado a investigar. Mezclar.
Transferir 0,25 ml del primer tubo al segundo y así sucesivamente hasta el tubo Nº 7
del que se extraen 0,25 ml y se desechan. El último tubo se usa como control negativo.
124
 Agregar a todos los tubos 0,1 ml de glóbulos rojos A o B al 2,5 %. De este modo
quedan realizadas diluciones razón 2 a partir del primer tubo cuya dilución es 1/7.
 Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
 Centrifugar a 1000 rpm durante 1 min. Resuspender suavemente. Observar y
determinar la máxima dilución aglutinante.
RESULTADO:
Se expresa el título de isoaglutininas.
NOTA:
 Para evitar la activación del sistema complemento y que esto interfiera en la reacción, el
suero debe ser calentado a 56 °C durante 30 min previo a su uso.
Segunda parte
Valoración de inmunoglobulinas por inmunodifusión radial
cuantitativa (IDRC)
FUNDAMENTO:
Cuando un antígeno difunde a través de un agar que contiene anticuerpos
monoespecíficos para dicho antígeno, se producirá un halo de precipitación. El diámetro del
halo será directamente proporcional a la concentración del antígeno, si se mantiene la
concentración del anticuerpo constante y en exceso en el agar.
OBJETIVO:
 Determinar la concentración de IgG, IgA o IgM en suero.
MUESTRA A ANALIZAR:
 Suero humano.
 Placas comerciales para IDRC conteniendo anticuerpos monoespecíficos.
125
 Sueros testigos de concentración conocida.

 Jeringas Hamilton.
 Dispositivos para medir halos.
PROTOCOLO:
 Sembrar 5 μl del suero a investigar por duplicado.
 En la misma placa sembrar 5 μl de los testigos de alta, media y baja concentración.
 Dejar difundir en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 48 a 72 h o hasta
constancia del diámetro del halo de precipitación.
 Medir el diámetro de los halos de precipitación.
Graficar la curva de calibrado: concentración del antígeno (mg/ml) presente en el
suero testigo versus su correspondiente radio al cuadrado (r2). Hallar la concentración de la
inmunoglobulina en estudio por interpolación, mediante el r2 correspondiente.
NOTA:
 Si no se cuenta con los sueros testigos el resultado se obtiene utilizando la tabla que
provee el fabricante.
MODELO DE INFORME
Primera parte: Semicuantificación de isoaglutininas por aglutinación lenta en tubo.
Objetivo:
Sistema:
Resultado:
Segunda parte: Valoración de inmunoglobulinas por inmunodifusión radial cuantitativa
(IDRC).
Objetivo:
Sistema:
Resultado:
126
INMUNODEFICIENCIAS SECUNDARIAS
Las ID secundarias o adquiridas se producen como consecuencia de neoplasias,

infecciones virales, tratamiento de enfermedades específicas con algunos fármacos y
malnutrición entre otras causas. El principal ejemplo de inmunodeficiencia secundaria a una
infección viral es el SIDA, causada por la infección con el virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH). Este virus infecta y elimina los LT CD4+, destruyendo la función de los LT
colaboradores.
EL VIH Y SU DIAGNÓSTICO
El VIH es un retrovirus que pertenece a la subfamilia de los lentivirus. Estos virus se
caracterizan por tener una organización genómica compleja, afectan el sistema nervioso,
producen viremia persistente, inmunodeficiencia y largos períodos de infección asintomática.
La partícula viral contiene dos cadenas simples de ARN idénticas.
Existen dos tipos de virus denominados VIH-1 y VIH-2 y, de cada uno de ellos varios
grupos y subgrupos. Las proteínas codificadas en el genoma del virus son inmunogénicas
en el organismo infectado y se distinguen tres grupos principales de antígenos. Las
proteínas gag o de la cápside (p55, p24 y p17), las glicoproteínas de la envoltura (gp160,
gp120 y gp41) y las proteínas pol (p66, p51 y p31) entre las que se encuentra la
polimerasa inversa.
El diagnóstico de laboratorio de la infección con VIH presenta cuidados especiales
desde la consulta del paciente hasta la entrega del resultado. Aquí se hará referencia
resumidamente a la metodología.
El laboratorio clínico se centra en la detección de los antígenos del virus o ácidos
nucleicos circulantes y en la identificación de anticuerpos específicos. Para ello se utilizan
métodos directos e indirectos. En los primeros se estudia la presencia del virus o sus partes
(antigenemia). El principal antígeno buscado mediante inmunoensayos es la proteína p24.
También pueden detectarse las secuencias genéticas del virus por PCR. En los métodos
indirectos se investiga la presencia de anticuerpos contra el virus utilizando
inmunoensayos.
127
Inicialmente se recurre a ensayos de screening o cribado, altamente sensibles que

permiten asegurar un resultado negativo. Luego, se procede a confirmar los resultados
positivos (reactivos) mediante pruebas más específicas. Esto permite descartar los
resultados falsos positivos encontrados en el screening y que pudieran deberse a
reacciones cruzadas. Los inmunoensayos de screening disponibles son del tipo aglutinación
pasiva, ELISA, dot blot y ensayos quimioluminiscentes. Algunas de estas pruebas combinan
la búsqueda de p24 y anticuerpos contra el VIH-1 y el VIH-2 de manera simultánea. Entre
los ensayos confirmatorios el más utilizado es el western blot. Éste es una prueba
altamente específica e incluso, algunos kits comerciales permiten distinguir la presencia de
anticuerpos contra VIH-1 y VIH-2.
WESTERN BLOT
El western blot o inmunotransferencia ofrece una herramienta reproducible y muy
sensible para el estudio de una o más proteínas incluidas en una mezcla o bien, la
búsqueda de anticuerpos específicos. El método consiste en separar, en una primera etapa,
una mezcla de proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida y luego transferirlas a
una membrana sintética donde quedan inmovilizadas y se pueden analizar. Habitualmente,
la transferencia se logra bajo un campo eléctrico (electrotransferencia), aplicado en sentido
transversal a la corrida electroforética inicial, obteniéndose una réplica en espejo del patrón
del gel (Figura 31). Existen distintos tipos de membranas sintéticas, capaces de unir
proteínas, que se utilizan en estos ensayos. Las más comunes son las de nitrocelulosa y
las de difluoruro de polivinilideno (PVDF).
A continuación, se realiza sobre la membrana el revelado de la o las bandas de
interés. En los casos en que se investigue la presencia de un antígeno en particular, el
procedimiento continúa con la incubación de la membrana con los anticuerpos específicos
adecuados y luego, con la anti-gammaglobulina conjugada. Cuando lo que se estudia es la
presencia de un anticuerpo en un suero, la membrana se incuba con dicho suero y luego,
con una anti-gammaglobulina unida a una marca. Esta última suele ser una enzima.
El estudio de un complejo antígeno-anticuerpo inmovilizado en un soporte provee de
ventajas adicionales. La más importante es que la visualización de la banda no depende de
la formación de un complejo inicialmente visible, sino de la amplificación que proporciona el
128
uso de anticuerpos en la inmunodetección. El análisis de los resultados se basa en la

visualización de una o varias bandas que se corresponden con la presencia del antígeno o
anticuerpo investigado.
Figura 31: Western blot (revelado inmunoenzimático).
Cabe recordar algunos aspectos de la separación electroforética que se realiza como

primer paso. La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) es uno de los métodos
más comunes y utilizados en el estudio de proteínas. La misma se puede realizar sin
dodecilsulfato de sodio (SDS), conocida como electroforesis nativa; o con SDS, llamada
electroforesis desnaturalizante. En este último caso puede o no tratarse la muestra con un
agente reductor de los enlaces disulfuro de las proteínas (Ej. 2-mercaptoetanol, ditiotreitol).
Al realizar un PAGE-SDS, la movilidad electroforética diferencial de los polipéptidos
en presencia de un campo eléctrico estará determinada fundamentalmente por sus pesos
moleculares (PM) más que por su relación carga/masa. En consecuencia, el efecto de
tamiz molecular del entramado del gel es el responsable de la separación. Por esta razón,
el PAGE-SDS permite determinar el PM aparente de las proteínas separadas. Para ello se
deben correr simultáneamente con las muestras marcadores de PM conocidos. El logaritmo
de los PM de estos marcadores (expresado en daltons) será proporcional a las respectivas
129
movilidades relativas (Rf). Luego, con las movilidades relativas de las proteínas pueden
interpolarse en la gráfica sus respectivos PM aparentes (Figura 32).
Rf






log PM
Figura 32: Curva Rf vs. log PM.
WESTERN BLOT Y VIH

El western blot permite confirmar los casos en que resulta reactivo, mediante alguna
técnica de screening, un suero donde se quiere determinar la posible infección por VIH. En
este caso se separa por electroforesis una mezcla de proteínas antigénicas del VIH-1
inactivado y parcialmente purificado. Estas bandas son electrotransferidas a una membrana
de nitrocelulosa donde luego se realiza la incubación con el suero del paciente y posterior
revelado. Algunas pruebas agregan en un extremo de la membrana una banda de un
péptido sintético propio del VIH-2. Como en todo inmunoensayo se requiere del
procesamiento en paralelo de sueros controles positivos y negativos. Un resultado positivo,
negativo o dudoso estará determinado por el criterio que dicte la organización o institución
de referencia en salud (OMS, Centro de Control de Enfermedades Estadounidense, etc.)
que se siga. Por ejemplo, el CCE de EEUU determina como resultado positivo la presencia
de dos bandas cualesquiera: p24, gp41, gp120/gp160.
Si bien el Trabajo Práctico que se realizará no involucra la búsqueda de anticuerpos
anti-VIH, se trabajará de forma análoga en la búsqueda de un anticuerpo de interés en un
suero de conejo por western blot.
130
Investigación de anticuerpos por western blot
FUNDAMENTO:
Una mezcla antigénica es inicialmente separada por PAGE-SDS tras la cual se
transfiere, bajo un campo eléctrico, a una membrana de nitrocelulosa donde se fija. Luego,
se incuba con el suero donde se investiga la presencia de anticuerpos específicos.
Finalmente, se realiza la inmunodetección mediante el agregado de un anticuerpo anti-
gammaglobulina, conjugado con peroxidasa. La presencia de anticuerpos específicos en la
muestra se evidencia por la aparición de una banda de color luego del revelado
cromogénico.
OBJETIVO:
 Determinar la presencia de anticuerpos anti-lisozima de clara de huevo.
MUESTRA A ANALIZAR:
Tratamiento de la muestra:
 Clara de huevo diluida ¼ con agua destilada.
 Buffer muestra 2X (dos veces concentrado): Tris-HCl 0,125 M, pH 6,8, SDS 4 %, 2-
mercaptoetanol 5 %, glicerol 20 %, azul de bromofenol 0,02 %.
PAGE-SDS:
 Solución de Acrilamida-Bisacrilamida 30:0,8.
 Buffer gel de resolución: Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8.
 Buffer gel de apilamiento: Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8.
 Solución de SDS 10 %.
 Buffer de corrida: Tris 0,025 M, Glicina 0,192 M, pH 8,3, SDS 0,1 %.
131
 Vasos de precipitados.
 Pipetas de vidrio, pipetas Pasteur y pipetas autmomáticas y tips.
 Dispositivo de armado de geles, placas de vdrio, separadores, peine, broches.
 Cuba de electroforesis y fuente de poder.
Electrotransferencia e inmunorevelado:
 Buffer de Transferencia: Tris 0,025 M, glicina 0,192 M, metanol 20 %, pH 8,3.
 Colorante de membrana reversible: Rojo Ponceau S 0,5 % en ácido tricloroacético 5%.
 Decolorante Rojo Ponceau: agua destilada.
 Buffers:
TBS: Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M.
TBS-Tween 20 0,1 % (solución de lavado).
TBS-Leche descremada 5 % (solución de bloqueo).
TBS-Tween 20 0,1 %-Leche descremada 1 % (solución para la dilución de
antisueros).
 Segundo anticuerpo: conjugado anti-IgG de conejo obtenido en cabra marcado con
peroxidasa en dilución adecuada.
 Sustrato: disolver 30 mg de 4-cloronaftol en 10 ml de metanol en un tubo protegido de
la luz con papel aluminio. Por otro lado agregar 300 l de agua oxigenada (30 vol) en
50 ml de TBS. Mezclar ambas preparaciones y usar inmediatamente.
 Recipientes de fondo plano.
 Grillas y esponjas para armar el sándwich, papel de filtro, membrana de nitrocelulosa.
 Cuba de transferencia y fuente de poder.
PROTOCOLO:
Tratamiento de la muestra con SDS
 Mezclar partes iguales de la clara de huevo diluida y buffer muestra 2X. Llevar a baño
de agua a 100 °C durante 3 min. Retirar y dejar enfriar.
PAGE-SDS
 Armar y ajustar el dispositivo donde se formará la placa de gel vertical.
132
 Preparar la mezcla del gel de resolución y agregar lentamente en el dispositivo de

armado. Sobre la mezcla del gel de resolución agregar agua destilada que nivela y
elimina burbujas de la superficie y minimiza el contacto con el aire. Esperar hasta
gelificación total.
 Retirar el agua por sobre el gel de resolución. Situar el peine que formará las calles de
siembra. Cargar la mezcla del gel de apilamiento. Esperar hasta gelificación total.
PAGE-SDS Gel de Resolución 15 % Gel de Apilamiento 4 %
Buffer gel 3,8 ml 1,7 ml

Acrilamida-Bisacrilamida 7,5 ml 0,9 ml
SDS 10 % 150 μl 66 μl
Agua destilada 3,6 ml 4,1 ml
Mezclar
Persulfato de amonio * 75 μl 33,4 μl
TEMED 5 μl 3,3 μl
 Armar la cuba electroforética con la placa de gel.

 Cargar el buffer de corrida en los compartimentos catódico y anódico.
 Retirar el peine con cuidado. Sembrar las muestras en cada calle (el volumen será
determinado en el momento).
 Conectar los electrodos a la fuente de poder. Programar las condiciones de corrida:
voltaje, amperaje y tiempo.
V 200
mA 30
Tiempo (h) 2
 Finalizado el tiempo de corrida desconectar la fuente de poder, descartar los buffers y

conservar la placa de gel. Hacer un corte de referencia en el extremo inferior derecho o
última calle.
 Es posible colorear irreversiblemente el gel con Coomassie Brilliant Blue R-250 0,05 %
para detectar las bandas de proteínas separadas o continuar con la electrotransferencia
como será nuestro caso.
133
Electrotransferencia
 Diez minutos antes de finalizar la corrida electroforética embeber la membrana de
nitrocelulosa, los papeles de filtro y la grilla con esponjas en buffer de transferencia.
 Terminada la corrida electroforética, retirar el gel y sumergirlo en buffer de transferencia
durante 10 min aproximadamente para equilibrar, eliminar sales y SDS.
 Proceder al armado del “sándwich” con los elementos mencionados, sobre la grilla y
bajo buffer de transferencia:
1. Colocar una de las esponjas sobre una de las grillas.
2. Colocar sobre ella 3 papeles de filtro.
3. Colocar la placa de gel.
4. Colocar la membrana de nitrocelulosa sobre el gel desde un extremo hacia el otro
para evitar que queden atrapadas burbujas.
5. Sobre la membrana colocar otros 3 papeles de filtro.
6. Eliminar con cuidado posibles burbujas deslizando suavemente un tubo de ensayo
sobre el conjunto formado.
7. Colocar la esponja restante y cerrar el conjunto con la otra grilla.
 Llevar el conjunto armado a la cuba de transferencia, sumergir el “sándwich”, tapar y
conectar los cables a la fuente de poder.
 Programar las condiciones de corrida: voltaje, amperaje y tiempo.
V 75
mA 350
Tiempo (h) 1
 Para constatar la transferencia eficiente de las proteínas realizar una coloración

reversible con Rojo Ponceau S durante 3 min y decolorar con agua destilada hasta
visualizar las bandas. Luego proseguir con el lavado hasta decoloración total.
Inmunorevelado
 Realizar el bloqueo de la membrana de nitrocelulosa con TBS-L durante toda la noche.
 Lavar con TBS-T por 5 min 2 veces.
134
 Incubar la membrana con la dilución adecuada del suero de conejo durante una hora a
temperatura ambiente.
 Incubar la membrana con la dilución adecuada del segundo anticuerpo durante una hora
a temperatura ambiente.
 Agregar la solución que contiene al sustrato. Tapar y dejar revelar. Frenar la reacción
enzimática por lavados con agua destilada.
Observar la aparición de una banda de color en la membrana de nitrocelulosa. De ser
así, calcular gráficamente el PM aparente.
La presencia de una banda de 14 kDa (lisozima) indica la presencia de anticuerpos
específicos.
NOTAS:
 Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente.
 El oxígeno retarda la gelificación por lo que se debe minimizar la formación de burbujas
durante la preparación de las mezclas.
 La placa gelificada puede conservarse en la heladera para ser usada más tarde.
MODELO DE INFORME
Investigación de anticuerpos por western blot
Objetivo:
Sistema:
Resultado:
Positivo, indicar PM aparente/Negativo
Adjuntar la curva Rf vs. log PM.
Interpretación:
135
APÉNDICES
APÉNDICE I Guía Teórico-Práctica de Inmunolgía
UNS
BIOSEGURIDAD
El término bioseguridad está compuesto por el vocablo “seguro” que significa libre de
peligro, daño o riesgo, y el prefijo “bio” que significa vida. Bioseguridad se puede entender,
entonces, como protección a la vida, o bien seguridad biológica o también ausencia o
control de riesgos para los seres vivos, en particular el ser humano. Como se ve, el término
es un neologismo que posee una acepción amplia en su significado.
Pero, en cualquier caso, el control de riesgos o el logro de una condición segura para
el hombre están íntimamente relacionados con el modo de evitar accidentes, y esto se
consigue definiendo todos los factores y todas las situaciones potenciales de riesgo en
las maniobras que se realicen dentro del Laboratorio de Inmunología. Este análisis permitirá
elaborar rutinas de prevención de accidentes, en particular en la manipulación de material
potencialmente patógeno.
Con respecto a los factores de riesgo que se ponen en juego en una tarea
específica, la Organización Panamericana de la Salud (OPS) define como riesgo a una
probabilidad para que se produzca un daño en un individuo o un grupo poblacional en un
ámbito determinado. Los riesgos potenciales de los laboratorios en general, se pueden
clasificar en: químicos (ácidos, bases, sustancias cancerígenas, mutagénicas, teratogénicas,
isótopos radiactivos); ambientales (térmicos, eléctricos, etc.); y biológicos (bacterias, virus,
hongos, parásitos y animales o vegetales de laboratorio).
Sin embargo, también debe considerarse otro aspecto importantísimo como son las
situaciones potenciales de riesgo asociadas con las conductas al ejecutar el trabajo. De
esta manera, a modo de ejemplo, se pueden señalar situaciones o conductas que ponen en
riesgo: impericia (ignorancia o falta de conocimientos), imprudencia (obrar
descuidadamente sin poner toda la atención requerida), negligencia (obrar
deliberadamente mal o de una manera desaprensiva), y muchas situaciones que se podrían
encuadrar en algunas de las tres descriptas, por ejemplo, excesiva confianza, falso coraje,
falta de atención, acostumbramiento a una determinada situación, y muchas otras variantes.
Los objetivos de la bioseguridad son abarcativos no solamente de la protección del
individuo, sino también de la comunidad y del medio ambiente. Esta es la razón por la que
139
UNS
todo residuo contaminado con líquidos potencialmente patógenos debe eliminarse de

manera segura.
CONTAMINACIÓN E INFECCIÓN
Cuando un microorganismo toma contacto con un individuo se dice que hay
contaminación. El concepto también es válido cuando el contacto se produce con objetos
inanimados, por ejemplo una mesada, pipetas, tips, varillas, etc.
Las vías y modos principales de contaminación se resumen en la tabla siguiente:
VÍA MODO
Aérea  Inhalar aerosoles microbianos.

Digestiva  Pipetear con la boca.
 Inoculación con elementos cortopunzantes.
Cutánea  Contacto con fluidos y elementos contaminados.
 Piel con soluciones de continuidad.
Conjuntiva  Salpicaduras y aerosolizaciones.
 Contacto con lentes contaminadas de microscopios o lupas.
La palabra infección deriva del vocablo latino inficere, que significa meter, introducir.
Infección, entonces, supone la existencia de microorganismos en el organismo del
hospedador y puede definirse como el proceso por el cual esos microorganismos que han
entrado en el hospedador logran establecerse y desarrollar.
NIVELES DE BIOSEGURIDAD
El Centro para el Control de Enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés: Center
for Disease Control), organismo público norteamericano que se dedica al monitoreo y
seguimiento epidemiológico de las enfermedades; y al diseño, regulación de normas y
procedimientos para el control de las mismas, publica un folleto titulado: “Clasificación de
los agentes etiológicos según su peligrosidad”, que desde 1969 ha servido como referencia
para establecer los riesgos relativos al trabajo con agentes biológicos.
140
UNS
Esta clasificación establece cuatro niveles de peligrosidad de acuerdo a la

patogenicidad del microorganismo y al riesgo que implica para el operador, para la
comunidad y para el ambiente.
En el Nivel 1 de bioseguridad se incluyen aquellos agentes que no poseen potencial
patogénico conocido para las personas inmunocompetentes. Presentan escaso riesgo
individual y comunitario. En general, son los que utilizan los alumnos en trabajos prácticos.
Ejemplos de estos microorganismos son: Bacillus subtilis, Escherichia coli y otros.
Los agentes incluidos en el Nivel 2 de bioseguridad son los que se encuentran con
mayor frecuencia en las muestras clínicas. Poseen un riesgo individual moderado y limitado
riesgo comunitario. Incluyen todos los agentes comunes de enfermedades infecciosas, así
como algunos patógenos menos usuales. Por ejemplo: virus de la hepatitis B,
Mycobacterium tuberculosis, especies de Salmonella y Shigella, y otros.
Al Nivel 3 pertenecen ciertos agentes como Brucella spp., algunos arbovirus y
arenavirus, lentivirus (HIV) y el virus de la estomatitis vesicular, que se encuentran
presuntamente en el material biológico a procesar. Implican un riesgo individual elevado y
riesgo comunitario escaso.
Finalmente, en el Nivel 4 de bioseguridad se incluyen ciertos arbovirus, arenavirus o
filovirus, que se encuentran en general en determinadas regiones y presentan elevado
riesgo individual y comunitario.
De lo dicho brevemente en los párrafos anteriores, es fácil concluir que deben
aceptarse e instrumentarse ciertos aspectos referidos a la organización, diseño y
funcionamiento de los laboratorios donde se procesa material potencialmente patógeno, los
que, reunidos, constituyen buenas prácticas de seguridad en todas las áreas
especializadas.
PRINCIPALES NORMAS DE BIOSEGURIDAD

La prevención de accidentes se apoya en el conocimiento de las situaciones
potencialmente peligrosas y en las conductas apropiadas para afrontarlas. Esto ayuda a
disminuir al máximo la posibilidad de que el operador adquiera alguna infección o bien que
se produzca dispersión de patógenos a la comunidad o al medio ambiente por prácticas
incorrectas.
141
UNS
Se mencionan las siguientes:

 Todo material biológico (sangre, suero, plasma, etc.) debe considerarse como
potencialmente infeccioso y manipularse tomando los recaudos apropiados pues
expone a riesgo individual y comunitario.
 Utilizar en el laboratorio ropa protectora (guardapolvo, chaqueta, etc.) que debe
usarse solo dentro del laboratorio.
 El tratamiento posterior al uso de la indumentaria no requiere otro procedimiento
que el lavado en lavarropas en agua a más de 70 °C durante al menos 30 minutos.
Como alternativa, y también en el caso que la indumentaria presente contaminación
con fluidos biológicos o aerosoles, se pueden introducir las mismas en una solución
de hipoclorito de sodio al 1 % (1 ml de lavandina de uso doméstico de 55 g cloro/L
en un volumen final de 100 ml de agua) durante 10 minutos antes del lavado
normal.
 Utilizar guantes de látex, vinilo o nitrilo para la manipulación de tubos o materiales
de laboratorio conteniendo líquidos biológicos humanos.
 Los materiales potencialmente patogénicos (restos de
sangre y sus derivados, guantes, manoplas, algodones,
jeringas, material descartable y otros elementos que
hayan estado en contacto con agentes patogénicos)
deben descartarse en cajas especiales. Estas cajas son
de paredes de cartón grueso, identificadas
convenientemente con el símbolo de residuos patogénicos, contienen bolsas de
polietileno de alta densidad de color rojo, y luego serán recolectadas por
empresas dedicadas al tratamiento de este tipo de residuos.
 Al terminar de trabajar descartar los guantes en la bolsa roja.
 Las bolsas rojas se destinan exclusivamente para la eliminación de material
descartable contaminado o biológico. Nunca se deben utilizar para residuos
domésticos ordinarios (papel, botellas, yerba, restos de alimentos, etc.).
 Utilizar manoplas para tocar elementos de uso común como centrifugas, carpetas,
picaportes, tapas de recipientes, teléfonos, etc.
 Lavarse las manos después de quitarse los guantes, y cada vez que se retire del
laboratorio.
142
UNS
 Utilizar protectores oculares (antiparras) y barbijo en aquellas situaciones que exista

riesgo de salpicaduras o formación de aerosoles.
 No pipetear con la boca ni líquidos biológicos ni reactivos. Utilizar pipetas
automáticas y propipetas.
 Dentro del laboratorio no se debe comer, beber ni fumar.
 No guardar comestibles ni bebidas en las heladeras del laboratorio.
 Evitar la formación de aerosoles, los que se producen por el agitado de tubos sin
tapa, incorrecta centrifugación (tubos con excesivo volumen, sin tapa o levantar la
tapa de la centrifuga antes de tiempo), etc.
 Si durante la centrifugación se rompe algún tubo se debe decontaminar la
centrifuga.
 Extremar los cuidados para evitar pinchazos accidentales, derrames, salpicaduras y
formación de aerosoles.
 Utilizar descartadores de paredes rígidas para eliminar las agujas y elementos
cortopunzantes para que al ser manipulados por cualquier persona no produzcan
heridas. Luego desecharlos en las mismas bolsas rojas que se usan para residuos
patogénicos.
 Las agujas no deben reintegrarse a su capuchón, pues es la principal fuente de
accidentes.
 Para decontaminar pipetas, tubos, portaobjetos, sumergirlos en recipientes plásticos
especiales con hipoclorito de sodio al 10 % durante 30 minutos previo a su lavado.
 Al finalizar la tarea decontaminar con hipoclorito de sodio al 10 % las superficies de
trabajo o inmediatamente cada vez que se derrame material.
 No debe apoyarse en las mesadas de trabajo indumentaria personal, carpetas
cartucheras, que posteriormente serán llevadas a los domicilios particulares.
 Todo personal que manipule material potencialmente patógeno debe vacunarse
contra la hepatitis B como medida profiláctica obligatoria.
143
APÉNDICE II Guía Teórico-Práctica de Inmunología
UNS
MANEJO EN EL LABORATORIO
El objetivo de esta sección es ofrecer al alumno un repaso de algunas prácticas que

serán habituales durante el desarrollo de los Trabajos Prácticos de Inmunología. Es por esto
que recomendamos su lectura cuidadosa para poder utilizar eficientemente el tiempo de
cada Trabajo Práctico y lograr resultados confiables. Luego de esta lectura, el alumno podrá
familiarizarse con las técnicas descriptas y practicarlas en la mesada de trabajo antes de la
realización de las actividades correspondientes a ese día. Finalmente encomendamos el
cuidado del equipamiento provisto teniendo en cuenta los consejos para el buen uso de los
mismos. Al finalizar el día de trabajo, deberá dejar los elementos utilizados en iguales
condiciones que cuando los recibió.
MEDICIÓN DE VOLÚMENES: PIPETAS MANUALES Y AUTOMÁTICAS

Durante el transcurso de las prácticas será común recurrir a la medición y
transferencia de volúmenes exactos y precisos. Para ello en un laboratorio existen
elementos como pipetas manuales, pipetas automáticas, buretas, probetas o matraces
aforados. El grado de precisión de cada uno de ellos es diferente y su elección
dependerá de la situación. Aquí sólo se introducirá el uso apropiado de las pipetas
manuales y automáticas.
Uso correcto de pipetas manuales

Existen dos clases de pipetas: una de éstas, están calibradas hasta la punta y deben
llenarse con el líquido a medir, dispensarse y, el líquido remanente en la punta debe
también desalojarse. Este tipo de pipetas se distinguen fácilmente ya que la graduación se
extiende hasta la punta de la pipeta. Por otro lado, existen pipetas que están calibradas
entre dos marcas que no incluye la punta. En este caso, el volumen que se dispensa debe
ser regulado manualmente.
145
UNS
Técnica de pipeteo
En primer lugar se debe seleccionar la pipeta adecuada para el volumen que se
desea medir. Se aconseja elegir en función del volumen a pipetear, de manera que este
volumen esté lo más cercano posible a la capacidad máxima de la pipeta. Por otra parte
debe considerarse la precisión de la medida y para ello se debe observar la graduación de
la pipeta.
Ej.: Se dispone de dos pipetas cuyas capacidades máximas son: 0,1 ml y 1 ml. ¿Cuál
utilizaría para pipetear 100 μl y 550 μl?
En el primer caso se utilizaría la pipeta de 0,1 ml para pipetear 0,1 ml (equivalente a
100 μl) con mayor precisión que si se utilizara una de 1 ml graduada. En el segundo
caso, la pipeta de 1 ml serviría para pipetear 550 μl (0,55 ml) y se debe tomar una
pipeta graduada 1/100, es decir que permita medir las centésimas de ml con precisión.
Luego de escoger la pipeta adecuada se ajusta en la boquilla de la pipeta el

dispositivo que se utilizará para crear vacío y succión: la propipeta o pera de hule (Figura
33) cuyo funcionamiento se detalla a continuación.
Figura 33: Propipeta.
La propipeta cuenta con tres puntos marcados como A, B, C en la Figura 33 y donde

se ejercerá presión. Al presionar uno de estos puntos, un balín interno permitirá la entrada o
salida de aire para que la pipeta pueda succionar (A) o dispensar (B) el líquido que
contiene. El punto C es útil para dispensar la última gota en aquellas pipetas graduadas
hasta la punta. El uso correcto de este dispositivo requiere de práctica.
146
UNS
La pipeta se debe llenar hasta un poco más arriba del inicio de la graduación de la
escala y luego se ajusta, frente a los ojos y en posición vertical, al punto exacto de
graduación de la escala (generalmente 0). Recordar que para líquidos transparentes, el
fondo del menisco del líquido se ajusta a la graduación mientras que para líquidos no
transparentes, los extremos del menisco se ajustan a la graduación de la escala.
A continuación, la pipeta conteniendo el líquido a dispensar se coloca en el recipiente
donde se depositará el líquido, luego se presiona suavemente la propipeta en el punto que
permite la salida del líquido y, una vez descargado el volumen deseado, se retira la pipeta
siempre en posición vertical. Luego se retira la propipeta y la pipeta se descarta en un
recipiente acondicionado para ellas y donde deben estar totalmente sumergidas. Es posible
volver a utilizar la pipeta si se trata del mismo líquido y para ello se deben extremar los
cuidados para no ensuciar o contaminar la punta de la pipeta.
Uso correcto de pipetas automáticas

Las pipetas automáticas permiten medir volúmenes pequeños de soluciones. Existen
pipetas automáticas de volumen fijo y de volúmenes variables. Las primeras sólo pueden
medir un volumen predeterminado por el fabricante (Ej. 10 μl o 25 μl). En cambio, en las
segundas se puede seleccionar el volumen a medir dentro de un rango de valores. Un
esquema general de este tipo de pipetas que poseemos en el laboratorio se muestra en la
Figura 34.
Las pipetas automáticas se caracterizan por utilizar puntas o tips plásticos
descartables que se ajustan al extremo o cono y en ellas se deposita el volumen a medir.
Técnica de pipeteo
Nuevamente, el primer paso en esta tarea es elegir la pipeta adecuada para los
volúmenes que se quieren medir. En general, estas pipetas poseen en el botón pulsador el
rango de volúmenes que se pueden medir con precisión. Los rangos más comunes en las
pipetas de volumen variable son 0,5-10 μl (utilizan tips transparentes); 2-20 μl y 20-200
μl (utilizan tips amarillos) y 100(200)-1000 μl (utilizan tips azules).
147
UNS
Figura 34: 1: botón, 2: rueda dentada de graduación del

volumen, 3: cono de la pipeta, 4: expulsor de tip, 5: tip
descartable.
Para fijar el volumen a medir se debe identificar la rueda de selección de volúmenes

en la parte superior de la pipeta automática y el indicador de volúmenes compuesto por tres
dígitos que se leen de arriba hacia abajo. Dependiendo del rango de la pipeta el último
número será el último dígito o el primer decimal del volumen a fijar (los decimales se
muestran en rojo) excepto en el caso de la pipeta de rango 100 o 200-1000 μl. En esta
última pipeta automática la escala que muestra el indicador es en mililitros, por lo que
volúmenes menores a 1 ml se indican con decimales. Ej. 0,20 ml; 0,90 ml; etc.
Rango de volúmenes 2-20 μl 20-200 μl 200-1000 μl
0 1 0 (rojo)
Indicador 5 5 5
5 (rojo) 0 5
Ej. volumen a medir 5,5 μl 150 μl 550 μl
148
UNS
Fijado el volumen, colocar el tip correspondiente en el extremo de la pipeta con una

suave presión y un leve movimiento giratorio para asegurar el correcto ajuste.
Para tomar y dispensar un volumen de líquido se procede de la siguiente manera:
Apretar el botón de la pipeta hasta el primer tope fuera de la solución que se quiere
tomar. Mantener. Con la pipeta en posición vertical sumergir la punta entre 1 mm y 3 mm
en el líquido. Permitir la aspiración de la solución al quitar lentamente la presión sobre el
botón de la pipeta. Esperar un segundo. Cuidar en este paso de no permitir la entrada de
aire al tip. Si este fuera el caso el volumen de líquido no será el deseado y se deberá
repetir la operación. Retirar la pipeta de la solución y llevarla al recipiente donde se
colocará el volumen medido. Descargar el líquido del tip apretando nuevamente el botón de
la pipeta hasta el primer tope, esperar un segundo, mantener. En caso de quedar líquido
continuar con la presión hasta el segundo tope, mantener y retirar con el botón todavía
presionado para evitar la reaspiración del líquido. Retirar el tip presionando el botón de
expulsión de la pipeta.
Figura 35: A: fijado el volumen se presiona el botón hasta el primer tope. B: la pipeta se
sumerge 1-3 mm en el líquido a tomar. C: aspiración del líquido soltando el botón
lentamente. D: forma correcta de dispensar el líquido medido. E: se puede presionar hasta
el segundo tope para expulsar totalmente el líquido. F: dispensado el líquido se vuelve a la
posición inicial y se descarta el tip presionando el botón de expulsión.
149
UNS
Sugerencias para un buen uso de las pipetas automáticas:

1) Nunca tomar líquido sin el tip puesto en el extremo.
2) Cuidar que el líquido medido nunca entre en contacto con el cono de la pipeta.
3) Nunca colocar la pipeta en posición horizontal si el tip tiene líquido.
4) Nunca ajustar el volumen fuera del rango permitido por la pipeta.
PREPARACIÓN DE DILUCIONES: SIMPLES Y SERIADAS
Diluciones simples
Hacer una dilución significa preparar una solución menos concentrada, y que
generalmente se llama de trabajo, a partir de una solución más concentrada, llamada
solución madre. La dilución se expresa como fracción decimal de la solución más
concentrada (Ej. 1/5; 1/10) donde se expresa el volumen o peso de una sustancia
(numerador) en un volumen o peso total o final (denominador). En el caso de una dilución
1/10 de una solución significa que un volumen de la solución más concentrada se diluye
hasta obtener 10 volúmenes finales de la solución menos concentrada deseada. Para ello
deberá contarse con 9 volúmenes de diluyente que junto al volumen a diluir totalizan los 10
volúmenes. Para calcular la concentración final de una dilución se debe multiplicar la
concentración de la solución concentrada por la dilución expresada como fracción.
Ej. Si se cuenta con una solución 90 g/l de NaCl y se diluye 1/10, la concentración
final de la solución es de 90 g/l x 1/10 = 9 g/l.
En el caso de realizar más de una dilución, la concentración final se obtiene al

multiplicar la concentración original de la solución por el producto de las diluciones
expresadas como fracciones.
Ej. Si se diluye una solución de 90 g/l de NaCl primero 1/2 y luego 1/5, la
concentración final de la solución será de 90 g/l x 1/2 x 1/5 = 9 g/l.
150
UNS
El factor de dilución representa el número de veces que está diluida una solución
respecto de la original y en los ejemplos anteriores es de 10. Este factor de dilución es
muchas veces utilizado para rotular soluciones que se preparan concentradas.
Ej. Si se prepara una solución 9 g/l de NaCl pero 10 veces concentrada se dice que
es una solución 10X de 9 g/l de NaCl que es lo mismo que decir 90 g/l de NaCl.
Diluciones seriadas
Se trata de una serie de diluciones consecutivas a partir de una primera y que se
caracterizan por tener el mismo factor de dilución respecto de la más concentrada anterior.
A continuación se explicará con un ejemplo la preparación de una serie o batería de tubos
de diluciones razón 2, es decir con un factor de dilución 2.
Ej. Se desea preparar para un ensayo una serie de 10 tubos de diluciones de suero
humano razón 2 a partir del primer tubo que tiene una dilución 1/2 del suero. El volumen
final de la dilución debe ser de 250 μl aunque el volumen final de reacción será de 500 μl
cuando se agregue otro reactante. Estas diluciones de suero suelen prepararse en solución
fisiológica.
Para preparar el primer tubo se procederá de la siguiente manera:
Tubo 1: 250 μl de SF + 250 μl de suero, se homogeneizará y se obtendrá una
dilución 1/2 del suero.
En los restantes 9 tubos se puede tener agregado 250 μl de SF y a continuación se
les agregará 250 μl de la dilución previa:
Tubo 2: 250 μl de SF + 250 μl de la dilución del tubo 1. Homogeneizar.
…
Para mantener los mismos volúmenes de diluciones en todos los tubos se tomarán
los 250 μl de la dilución del tubo 10 y se descartarán.
De este modo se tendrán 10 tubos con suero sucesivamente diluido con un factor de
dilución 2. Por otra parte, para la expresión correcta del resultado deberá tenerse en cuenta
el volumen final de reacción. Si se recuerda este volumen es del doble del volumen de
151
UNS
dilución en cada tubo y por tanto no puede despreciarse. Es decir que la dilución del suero
en el primer tubo no será 1/2 sino que luego del agregado del otro reactante será de 1/4.
¿Cómo se llega a este número?
Tubo 1 (T1): 250 μl de SF + 250 μl de suero = 500 μl de dilución T1.
Se extraen 250 μl de dilución para el tubo 2.
Restan 250 μl de dilución en el T1 que contiene 125 μl del suero original.
Se agregan 250 μl de reactivo = 500 μl de volumen de reacción.
Para obtener la dilución final hecha del suero: 125 μl del suero original en 500 μl de
volumen final es una dilución 1/4.
Tubo 2 (T2): 250 μl de SF + 250 μl de dilución T1 = 500 μl de dilución T2.

Se extraen 250 μl de dilución para el tubo 3.
Restan 250 μl de dilución en el T2 que contiene 62,5 μl del suero original.
Se agregan 250 μl de reactivo = 500 μl de volumen de reacción.
Para obtener la dilución final hecha del suero: 62,5 μl del suero original en 500 μl de
volumen final es una dilución 1/8. Notar que el factor de dilución es 2 respecto del T1.
Los cálculos son similares en los siguientes tubos y las diluciones del suero en cada
uno de ellos serán:
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10
1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048
Algunas veces los volúmenes de reactivo agregado a los volúmenes de diluciones

son despreciables y en consecuencia la dilución del suero es, en definitiva, la que se debe
tener en cuenta para la expresión de los resultados.
152
APÉNDICE III Guía Teórico-Práctica de Inmunología
UNS
CONCEPTOS BÁSICOS DE
MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA
INTRODUCCIÓN
Un microscopio es un instrumento que amplifica una imagen y permite la observación
de mayores detalles de los que pueden verse a simple vista. Hay dos tipos principales de
microscopio: el microscopio electrónico y el microscopio de luz. El microscopio
electrónico utiliza la propiedad que poseen los haces de electrones de ser desviados por un
campo electromagnético. El microscopio de luz usa un haz de luz para iluminar los objetos a
estudiar. Este haz de luz puede atravesar el objeto o simplemente incidir en cierto ángulo
sobre el mismo. En el primer caso se habla de trans-iluminación y en el segundo caso de
epi-iluminación (Figura 36). En el caso de la trans-iluminación, la imagen se obtiene por
transmisión de la luz a través de la muestra. El microscopio clásico que emplea este tipo de
iluminación es el microscopio de campo claro. En el caso de epi-iluminación, la luz incide
en forma oblicua sobre la muestra y los rayos reflejados son los que se capturan para
formar la imagen.
Figura 36: Mecanismos de iluminación empleados en microscopía.
MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
La fluorescencia es una propiedad que tienen ciertas moléculas llamadas
fluorocromos. Estas moléculas absorben la radiación, al ser excitadas por una luz incidente
de una longitud de onda determinada, y emiten luz de una mayor longitud de onda (menor
energía). El fluoróforo es la parte del fluorocromo responsable de la emisión de la
fluorescencia.
153
UNS
Existen numerosos tipos de fluorocromos y cada uno de ellos tiene su espectro de

absorción y de emisión específico que depende de la composición y estructura de la
molécula fluorescente (Figura 37 y Tabla 1).
Los fluorocromos pueden ligarse a un componente celular y también pueden ser
acoplados químicamente a otras moléculas como es el caso de los anticuerpos que
reconocen específicamente cierto componente celular.
Figura 37: Espectro de excitación y emisión del isotiocianato de fluoresceína (FITC).
Tabla 1: Principales fluorocromos utilizados.
El microscopio de fluorescencia irradia a la muestra con la luz de excitación y es

capaz de separar la luz fluorescente emitida de la luz de excitación por medio de filtros. Así,
solo la luz emitida por la muestra es detectada por el ojo. Como resultado, las partes
fluorescentes de la muestra brillan contra un fondo oscuro con suficiente contraste como
para permitir la detección.
154
UNS
El concepto de microscopía múltiple se refiere a que es posible combinar, sobre una

misma muestra, dos o más fluorocromos siempre que emitan en diferentes longitudes de
onda y el sistema sea capaz de excitar a todos a la vez y discriminar los fotones emitidos
por ellos.
El microscopio de fluorescencia consta de los mismos componentes de un
microscopio óptico normal al que se le añade una fuente luminosa, filtros y espejos
dicroicos.
 Fuente luminosa: Se necesita una intensa fuente de luz para excitar la fluorescencia en
el espectro específico de cada fluorocromo. Estas fuentes generan radiaciones UV,
violeta, azul, verde. Las más empleadas son las lámparas de mercurio a alta presión.
 Objetivos: Deben tener gran capacidad para transmitir la luz y proveer una imagen de
alta calidad. Por ello, están diseñados y construidos para que también funcionen como
lentes condensadores proyectando la energía radiante uniformemente sobre la muestra.
Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiación UV.
 Filtros: Retienen la radiación UV, peligrosa para el ojo humano, dejando pasar
solamente la radiación visible, que no es peligrosa. Existen un gran número de juegos
de filtros de excitación y de emisión para los diferentes fluorocromos.
 Filtros de excitación: Ubicado entre la fuente de luz y el preparado. Es el filtro que
selecciona la luz de la longitud de onda incidente.
 Espejo Dicroico: Permite la separación de la luz de excitación de la de fluorescencia.
Posicionado en 45° respecto al eje óptico, la longitud de onda de excitación (más
corta) es reflejada y la longitud de onda de emisión (más larga) lo atraviesa. Por lo
tanto, permite reflejar hacia el espécimen, la longitud de onda filtrada y seleccionada y
deja pasar las longitudes de onda emitidas.
 Filtros de barrera o de emisión: Ubicado antes del ocular para prevenir daños retinianos
que podrían ser causados por rayos ultravioleta que escapan del espejo dicroico. Es el
filtro que selecciona la luz de longitud de onda fluorescente. Por lo tanto, suprime
completamente la luz de excitación no deseada, es decir selecciona la longitud de onda
de emisión del fluorocromo. Los fabricantes suelen proporcionar bloques o cubos de
filtros que son combinaciones de filtros de excitación y de emisión con los apropiados
espejos dicroicos (Figura 38).
155
UNS
Figura 38: Cubo de filtros para el microscopio de fluorescencia.
En la Figura 39 se muestra un esquema del funcionamiento de un microscopio de

epifluorescencia.
Figura 39: Esquema de funcionamiento del microscopio de epifluorescencia.
La luz procedente de la fuente, atraviesa el filtro de excitación que selecciona la

longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo, antes de incidir sobre la muestra. En el
caso de la figura, en la que la muestra ha sido marcada con isotiocianato de fluoresceína
(FITC), el filtro permite el paso de ondas de luz con longitud de onda que caen en el rango
azul para que el preparado sea alcanzado exclusivamente por ella. Esta luz se refleja en un
espejo dicroico e incide sobre la muestra. El objetivo actúa como condensador porque
enfoca la luz sobre ella. El fluorocromo se excita y emite fotones de una longitud de onda
mayor que la luz incidente. La luz emitida por la muestra no se refleja sino que atraviesa el
espejo dicroico y llega a un segundo filtro que selecciona la longitud de onda de emisión del
fluorocromo. En este caso el filtro de emisión, selecciona la luz de longitud de onda en el
rango del verde, por lo que deja pasar solo la luz verde.
156
GLOSARIO
GLOSARIO Guía Teórico-Práctica de Inmunología
UNS
A
ctivación del complemento: desencadenada por agentes patógenos, serie de reacciones en las
que intervienen los componentes plasmáticos del complemento. Se conocen tres vías de
activación:
 Vía alterna: se activa cuando la proteína C3b se une a las superficies celulares de los
microorganismos, es independiente de los anticuerpos.
 Vía clásica: se pone en marcha tras la unión de los complejos antígeno-anticuerpo a la
molécula C1 y origina una cascada proteolítica en la que intervienen otras proteínas del
complemento.
 Vía de las lectinas: es activada por la unión de una lectina de unión de manosa presente en
el plasma a peptidoglicanos con manosa presentes en la superficie bacteriana.
Adquisición: se refiere al proceso del pasaje de una muestra en la citometría de flujo. Los datos
tales como tamaño, complejidad, intensidades de fluorescencia son guardados en la memoria de una
computadora.
Adyuvante: sustancia que se utiliza para aumentar la respuesta inmune adaptativa contra cualquier
antígeno. Se mezcla con éste último antes de la inoculación.
 de Freund incompleto: emulsión que resulta de la mezcla de un aceite mineral y vaselina
líquida.
 de Freund completo: Freund incompleto al que se le agrega un macerado de bacilos
tuberculosos muertos.
Afinidad: medida de la fuerza con la que un epitope se une a un solo sitio de unión en el anticuerpo
(paratope).
Agente patógeno: organismo, frecuentemente un microorganismo, que es capaz de producir
enfermedad.
Aglutinación: fenómeno visible por formación de grumos que resulta de la interacción secundaria
entre un antígeno particulado y su correspondiente anticuerpo específico.
Alérgeno: antígeno, normalmente inocuo, que produce reacciones alérgicas. Ejemplos: polen, polvo,
caspa animal, etc. Ver Alergia.
Alergia: estado de hipersensibilidad a un alérgeno que se produce como resultado de la interacción
entre éste y anticuerpos o linfocitos T (LT) producidos por la exposición previa al mismo. Ver
Reacciones de hipersensibilidad.
Anafilaxia: forma de reacción alérgica (generalmente hipersensibilidad de tipo I de Gell y Coombs)
de comienzo rápido y mediada por IgE que lleva a la liberación de mediadores químicos por
159
UNS
mastocitos y basófilos causantes de los efectos locales o sistémicos. Ver Anafilaxia cutánea pasiva,
Shock anafiláctico.
 cutánea pasiva (ACP): cuando anticuerpos específicos generados en un animal se inoculan
intradérmicamente en otro, de la misma o distinta especie, generando un fenómeno de
anafilaxia localizado ante un encuentro con el antígeno correspondiente.
Anticuerpos: forma secretada de las inmunoglobulinas producidas por las células plasmáticas. Las
inmunoglobulinas son glucoproteínas que elaboran los vertebrados al ser estimulados por un
inmunógeno y que tienen la capacidad de reaccionar específicamente con el inductor. Se hallan
principalmente en el plasma circulante. Existen varios isotipos o clases posibles según la especie que
los produce. En el hombre existen cinco clases: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y cuatro subclases de IgG
(IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) y dos de IgA (IgA1 e IgA2). Conforman por esto una familia de proteínas.
Son elaboradas por las células plasmáticas o plasmocitos, que derivan de la diferenciación
inmunológica de los linfocitos B (LB). Las inmunoglobulinas poseen una estructura tetrapeptídica de
dos cadenas livianas (L) y dos cadenas pesadas (H), con dominios compartidos y diferenciales entre
los distintos isotipos.
 citotrópicos: con capacidad para fijarse a células.
 conjugado: unido a una marca. Esta puede ser una enzima, un fluorocromo o un
radioisótopo.
 heterocitotrópicos: con capacidad para fijarse a células heterólogas.
 heterófilos: que interaccionan con un mismo antígeno o antígenos similares presentes en la
naturaleza y que pueden estar compartidos por bacterias, hongos, vegetales superiores,
vertebrados, etc. Uno de los más conocidos son los anticuerpos que reaccionan con los
antígenos de Forssman presentes en la membrana del glóbulo rojo, en el hombre.
 homocitotrópicos: con capacidad para fijarse a células homólogas.
 incompletos o bloqueantes: funcionalmente univalentes, es decir, con un solo paratope
disponible para la unión al antígeno.
 monoclonales: producidos por un solo clon de LB y, en consecuencia, son idénticos entre sí
en estructura y especificidad.
Antígeno: sustancia capaz de interaccionar específicamente con los productos de una respuesta
inmune (anticuerpos o receptores de linfocitos T) que no necesariamente generaron. Ver
Inmunógeno.
 particulado: forme. Ej. bacterias, glóbulos rojos, células.
 soluble: que forma soluciones. Ej. solución de proteínas, hidratos de carbono.
160
UNS
 Timo-dependiente: dependen de la participación de los linfocitos T colaboradores o helper

(LTh) para inducir una respuesta de anticuerpos adecuada. Ej. antígenos proteicos,
haptenos fijados a proteínas, etc.
 Timo-independiente: pueden inducir una respuesta de anticuerpos sin la participación de
los LTh. Ej. poliósidos, lipopolisacáridos, flagelina polimerizada.
Antisuero: suero enriquecido en una población heterogénea de anticuerpos específicos producidos
contra un antígeno determinado. Esta heterogeneidad hace que cada antisuero sea único. También
se lo llama suero inmune o hiperinmune.
 monoespecífico: suero que contiene en alto título/concentración una población heterogénea
anticuerpos que interaccionan específicamente con un antígeno en particular.
 policlonal: suero producido por más de un clon de LB y, en consecuencia, presenta una
población heterogénea de anticuerpos en estructura y especificidad.
 poliespecífico: suero que contiene en alto título/concentración una población heterogénea
de anticuerpos que interaccionan específicamente con más de un antígeno.
Autofluorescencia: es la luz emitida naturalmente por una partícula que no ha sido coloreada ni
marcada con fluorocromos.
Autoinmunidad: estado de reactividad del sistema inmune adaptativo frente a antígenos propios que
aparece cuando los mecanismos de autotolerancia fallan.
Avidez: fuerza de unión entre un anticuerpo y un antígeno. Depende de la afinidad y de la valencia
del anticuerpo.
B
asófilos: una de las poblaciones de granulocitos, componentes celulares de la sangre. Se
caracterizan por su contenido de gránulos que se tiñen con colorantes básicos.
Bazo: órgano adyacente al estómago. Es un tejido linfoide primario donde terminan de madurar los
LB en el hombre. También es un tejido linfoide secundario que compone el sistema inmune y donde
los LB interaccionan con los patógenos o antígenos transportados por la sangre.
adena liviana: el menor de los polipéptidos que constituyen a las inmunoglobulinas. Posee una
C región variable y otra constante respecto a su composición aminoacídica. Existen dos clases:
cadenas λ y κ. Se unen a una cadena pesada por un puente disulfuro.
Cadena pesada: el mayor de los polipéptidos que constituyen a las inmunoglobulinas. Posee una
región variable y otra constante respecto a su composición aminoacídica. Existen cinco tipos de
cadenas: α, δ, ε, γ y μ que determinan las diferentes clases o isotipos de inmunoglobulinas y en
consecuencia, las distintivas funciones efectoras de los anticuerpos.
161
UNS
Cambio de clase de las Inmunoglobulinas (switch): proceso por el cual un LB cambia la clase de
inmunoglobulina que produce sin perder su especificidad antigénica. El cambio de isotipo implica una
recombinación somática donde el gen que codifica para la región variable se une a un gen que
codifica para la región constante de una cadena pesada diferente a la expresada hasta ese
momento.
CD (Cluster of Differentiation): moléculas presentes en la superficie celular que en muchos casos
sirven para diferenciarlas unas de otras in vitro. La nomenclatura utiliza las iniciales CD seguidas por
un número de orden.
CDR (Complementarity Determining Regions): regiones determinantes de la complementariedad.
Regiones de las cadenas de inmunoglobulina y del receptor de LT que se unen al antígeno y que
determinan la especificidad antigénica. Son las partes más variables de las regiones variables y por
esto se conocen como regiones hipervariables.
Células de Langerhans: células dendríticas fagocíticas que se encuentran en la epidermis y que,
tras endocitar y procesar antígenos, migran hacia los ganglios linfáticos locales para convertirse en
células dendríticas.
Células dendríticas: células presentadoras de antígeno profesionales con una morfología ramificada
dendrítica. También se conocen como células dendríticas interdigitantes. Son las estimuladoras más
potentes de la respuesta de los LT. Son diferentes de las células dendríticas foliculares.
Células dendríticas foliculares: células características del folículo linfático. Poseen prolongaciones
citoplasmáticas que forman un entramado esencial para la arquitectura del mismo. Expresan sobre su
membrana receptores del complemento y para el Fc de Ig que le permiten exhibir antígenos sobre su
superficie destinados al reconocimiento por los centrocitos. Estas células tienen un papel muy
importante en la selección de LB con Ig de alta afinidad durante el proceso de maduración de la
afinidad.
Células plasmáticas o plasmocitos: LB que ha llegado al final de su vía de diferenciación y secreta
anticuerpos.
Célula Presentadora de Antígenos (CPA): células capaces de presentar antígenos a LT vírgenes y
activarlos. Se las distinguen entre profesionales ( células dendríticas, macrófagos y LB) y no
profesionales. Expresan moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) sobre las que
se presenta el péptido antigénico.
Células NK (Natural Killer): linfocitos citotóxicos grandes y granulosos que pueden reconocer y
destruir células tumorales o infectadas por virus y otros patógenos intracelulares. También median la
citotoxicidad mediada por anticuerpos.
162
UNS
Célula NKT: linfocitos que expresan en su membrana moléculas características de los LT (TCR) y
NK (CD 16 y CD56). Tienen una morfología y un contenido granular intermedios entre las células T
y células NK. Además, reconocen antígenos lipídicos presentados por moléculas CD1.
Centroblasto: LB de gran tamaño en división presente en los centros germinales donde ocurren los
fenómenos de hipermutación somática entre otros.
Centrocito: LB que no se divide en los centros germinales. Esta célula ha sufrido cambios de clase
de inmunoglobulinas e hipermutación somática.
Centro germinal: zona del tejido linfoide secundario de intensa proliferación, selección, maduración y
muerte de LB. Los centros germinales se forman alrededor de redes de células dendríticas
foliculares.
Citoquinas: proteínas producidas por células que afectan el comportamiento de células diana. Las
producidas por los linfocitos se conocen generalmente como linfoquinas o interleuquinas.
Citotóxico: con capacidad de destruir células.
Clon: células de constitución genética idéntica derivadas de una única célula.
Complejo mayor de histocompatibilidad o CMH: conjunto de genes codominantes que codifican
para un grupo de glucoproteínas polimorfas llamadas moléculas del CMH que participan en la
presentación de péptidos a los LT.
Complemento: conjunto de proteínas plasmáticas que se activan en cascada. Como resultado se
generan moléculas que pueden recubrir al agente extraño y destruirlo directamente por lisis o bien
mediar la fagocitosis por células fagocíticas (ver Opsonización). Algunos componentes del
complemento son mediadores de la inflamación.
Control negativo: suero no reactivo inactivado (tratado para eliminar componentes patogénicos), es
decir que no contiene el antígeno o el anticuerpo que se investiga.
Control positivo: suero reactivo inactivado, es decir que contiene el antígeno o el anticuerpo que se
investiga.
Cromatografía de intercambio iónico (CII): la cromatografía, en general, es un método de
separación química ampliamente utilizado, basado en la interacción entre solutos, una fase móvil y
una fase estacionaria. En el caso de la CII adquiere relevancia la carga eléctrica de la molécula que
se va a separar. Estas moléculas se unen a una matriz estacionaria o resina de carga opuesta. La
unión entre ellas es del tipo reversible y se puede modificar variando la fuerza iónica y/o el pH de la
fase móvil utilizada para eluir la fracción de interés.
Cromógeno: capaz de generar un compuesto coloreado soluble o insoluble a través de una reacción
química.
Cuadrantes: se refiere a cada una de las cuatro áreas delimitadas al dibujar dos líneas
perpendiculares en un gráfico de citometría de flujo.
163
UNS
D
egranulación: exocitosis de gránulos a partir de células tales como mastocitos y basófilos.
Desnaturalización: pérdida de la estructura tridimensional de una macromolécula, generalmente por

calor o tratamiento químico.
Determinante antigénico: zona o región definida del antígeno que genera una respuesta inmune
adaptativa. Es generalmente utilizado como sinónimo de epitope aunque algunos autores distinguen
entre uno y otro (ver Epitope).
Doble difusión bidimensional o método de Ouchterlony: técnica inmunoquímica que aprovecha la
capacidad de las moléculas, en este caso, antígeno y anticuerpo, de difundir a través de un gel
(agar) bajo condiciones adecuadas. Si existe especificidad entre ambas moléculas se formará una
línea o banda opaca en la región donde las proporciones son óptimas (ver Zona de equivalencia).
Dominio de unión: ver Región variable, Paratope.
Dominio efector: ver Región constante, Fc.
E
dema: hinchazón del tejido debida a la acumulación anormal de líquidos en el compartimiento
extravascular.
Electroforesis: técnica que permite separar, mediante la acción de un campo eléctrico, componentes
de una mezcla sembrada en un punto definido en un medio soporte. Los medios soportes pueden
ser el papel, el acetato de celulosa o gel (agar, agarosa, poliacrilamida).
 en geles de poliacrilamida: una de las formas más utilizadas de la electroforesis en gel. La
matriz está formada por acrilamida polimerizada que se entrecruza con unidades de N-N´-
metilen-bisacrilamida. Se utiliza tanto en el estudio de proteínas como ácidos nucleicos.
Electrotransferencia: proceso en el que se transfieren, bajo la influencia de un campo eléctrico,
moléculas previamente separadas por electroforesis en gel a una membrana donde quedan fijadas
para su posterior estudio.
ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay): prueba empleada para la detección o la
cuantificación de un anticuerpo o un antígeno mediante un conjugado enzimático que cambia el color
de un sustrato cromogénico.
Enfermedad autoinmune: ver autoinmunidad.
Enzimoinmunoensayos o ensayos inmunoenzimáticos: técnicas inmunoquímicas donde la
interacción entre un antígeno y su correspondiente anticuerpo específico se detecta a través de una
marca, en este caso, una enzima de cuya actividad se obtiene un compuesto coloreado o luz.
Eosinófilos: una de las poblaciones de granulocitos. Participan principalmente en la defensa contra
las infecciones parasitarias y en las reacciones alérgicas.
164
UNS
Epitope: área que agrupa a unos pocos aminoácidos (5-6) relacionados, en el caso de una proteína,
o unas pocas unidades de hexosas (5-6), en el caso de un polisacárido, que interactúa con el
paratope de un anticuerpo. También se lo utiliza para referirse al área de una proteína que da lugar a
los péptidos que reconocen los receptores de los LT.
 conformacional o discontinuo: formado por aminoácidos separados en la estructura
primaria y que forman un grupo al aproximarse por acción de las estructuras secundaria y
terciaria.
 lineal o continuo: formado por aminoácidos contiguos en la estructura primaria.
Especificidad: propiedad de los anticuerpos y de otras moléculas de unión a antígenos que se refiere
a la interacción selectiva con sólo uno o algunos tipos de molécula o célula.
Extravasación: desplazamiento de células o líquido desde el interior de los vasos sanguíneos hacia
los tejidos circundantes.
F
(ab): fragmento producido por proteólisis de la IgG que está compuesto por una cadena liviana y
la mitad aminoterminal de una cadena pesada unidas por un puente disulfuro intercatenario. Se
comporta frente al antígeno como ligando univalente.
F(ab’)2: fragmento producido por proteólisis de la IgG que está compuesto por ambas cadenas
livianas y las mitades aminoterminales de las cadenas pesadas incluyendo parte de la zona de la
bisagra. Se comporta frente al antígeno como ligando bivalente.
Fc: fragmento sin actividad anticuerpo producido por proteólisis de la IgG que está compuesto por las
mitades carboxiterminales de ambas cadenas pesadas unidas por puentes disulfuro en la región
residual de la bisagra. Es responsable de otras propiedades biológicas inherentes a la molécula
entera.
FcR: receptor que se halla en la superficie de algunas células y que une fragmentos Fc de
inmunoglobulinas.
Ficoll-Hypaque: sustancia que permite la separación de células mononucleares de la sangre
humana total a través de un gradiente de densidad. Está compuesto por un polisacárido (Ficoll) que
aglutina y sedimenta los glóbulos rojos y una sustancia densa (Hypaque) que diluida adecuadamente
otorga una densidad característica a la mezcla, en nuestro caso 1,077 g/ml.
Fluorocromo: sustancia fluorescente, es decir capaz de emitir luz en una determinada longitud de
onda luego de ser excitada por un haz de luz de longitud de onda menor. Se utiliza como marcador
en las técnicas de inmunofluorescencia.
Folículo linfoide primario: zona de un tejido linfoide secundario donde abundan los LB en ausencia
de una respuesta inmunitaria.
165
UNS
Folículo linfoide secundario: zona de un tejido linfoide secundario donde abundan los LB en
proliferación y diferenciación inducida por antígenos. En las respuestas inmunes a antígenos timo-
dependientes aloja en su interior al centro germinal.
G
ammaglobulinas: conjunto de proteínas séricas que migran conjuntamente cercanas al cátodo
en una electroforesis. Incluye a la mayoría de las inmunoglobulinas. Ver Anticuerpos.
Ganglio linfático: tejido linfoide secundario ubicado en muchos sitios del cuerpo donde convergen
los vasos linfáticos. Es el punto de encuentro entre los antígenos y los linfocitos vírgenes a partir de
los que se desencadena la respuesta inmune adaptativa.
Gate o región: ventana que delimita un sector en un gráfico en citometría de flujo.
Granulocitos: una de las poblaciones de leucocitos, poseen el núcleo generalmente multilobulado y
gránulos citoplasmáticos característicos. Se conocen tres clases: neutrófilos, eosinófilos y basófilos.
Granuloma: sitio de inflamación que se genera alrededor de un agente infeccioso persistente o
cuerpo extraño no degradable en el que predominan, en la zona central, macrófagos activados
(generalmente fusionados formando células gigantes multinucleadas) rodeados por LT.
H
apteno: grupo químico definido y de bajo peso molecular que carece de poder inmunogénico
pero es capaz de interaccionar con anticuerpos preformados.
Hemaglutinación: aglutinación donde participa el glóbulo rojo como soporte de un antígeno que se
adsorbe en su superficie celular.
Heterólogo: término que refiere a la procedencia de una molécula, célula, tejido u órgano de un
organismo de una especie diferente.
Hipermutación somática: mutación que ocurre con alta frecuencia en la región variable reordenada
de los genes de inmunoglobulinas en los LB activados lo que da como resultado la producción de
anticuerpos variantes, algunos de los cuales presentan una afinidad más alta por el antígeno.
Histamina: amina vasoactiva almacenada en los gránulos de los mastocitos y basófilos.
Homólogo: término que refiere a la procedencia de una molécula, célula, tejido u órgano de un
organismo de la misma especie.
Humoral: relativo a los líquidos extracelulares, incluyendo el suero y la linfa. En Inmunología refiere a
la respuesta inmune adaptativa mediada por anticuerpos (ver Inmunidad humoral).
I
nflamación: término general que designa a la acumulación de líquido en el compartimiento
extravascular, proteínas plasmáticas como la albúmina y leucocitos ( edema que produce tumor,
dolor) como resultado del aumento de la permeabilidad vascular ( eritema que produce rubor y calor),
que se inicia por un daño tisular, una infección o una respuesta inmunitaria local.
166
UNS
Inmunidad: capacidad de resistencia a la infección.

 adaptativa o adquirida: ver Respuesta inmune adaptativa o adquirida .
 humoral: mediada por anticuerpos y que por consiguiente puede ser transferida a un
receptor no inmune por el suero.
 innata: ver Respuesta inmune innata.
 mediada por células o celular: mediada principalmente por los LT efectores específicos de
antígeno. No es transferible mediante el suero a un receptor virgen.
Inmunización o inoculación: inducción natural o artificial de una respuesta inmune.
 activa: inducción deliberada y artificial de una respuesta inmune mediante la introducción de
una proteína, polisacárido, toxoide, microorganismo vivo atenuado, muerto o inactivado. La
inmunización activa que tiene como objeto inducir una inmunidad protectora contra una
enfermedad se conoce como vacunación.
 pasiva: transferencia de células sensibilizadas y/o anticuerpos preformados (homólogos o
heterólogos) específicos generados por inmunización activa.
Inmunocompetente: en un individuo se refiere al estado de madurez inmunológica.
Inmunocomplejo: complejo formado por la unión de un antígeno con un anticuerpo específico. Puede
contener también componentes del sistema complemento.
Inmunodeficiencia: Grupo heterogéneo de enfermedades debidas a alteraciones del sistema inmune.
Estas alteraciones pueden ser causadas por un defecto genético en algún componente del sistema,
denominándose inmunodeficiencias congénitas (primaria), o bien por alteraciones adquiridas tras una
infección viral, malnutrición, depresión, denominándose inmunodeficiencias adquiridas (secundaria).
Inmunodifusión: refiere a la difusión de un inmunoreactante a través de una matriz semisólida en
condiciones experimentales adecuadas.
 Radial Cuantitativa (IDRC): técnica inmunoquímica que permite cuantificar un antígeno de
interés. El antígeno difunde a través de un agar que contiene un antisuero monoespecífico,
(donde los anticuerpos están en concentración constante y en exceso), con el que
interacciona. El tamaño del halo de precipitación es proporcional a la concentración del
antígeno.
Inmunofluorescencia: técnica inmunoquímica donde la interacción entre un antígeno y su
correspondiente anticuerpo específico se detecta a través de una marca fluorescente ( fluorocromo).
La visualización de la fluorescencia requiere de un microscopio de fluorescencia o un citómetro de
flujo según el caso.
 directa: cuando el anticuerpo conjugado con el fluorocromo es el primario.
 indirecta: cuando el anticuerpo conjugado con el fluorocromo es el secundario.
167
UNS
Inmunógeno: sustancia capaz de generar una respuesta inmune humoral y/o celular cuando es
introducida en un organismo vertebrado adulto produciendo anticuerpos y/o células sensibilizadas
con los que reacciona específicamente (ver Antígeno).
Inmunoglobulina: ver Anticuerpo.
Inmunoquímica: rama de la Inmunología que estudia y diseña métodos que permiten obtener,
analizar y cuantificar fracciones de antígenos o anticuerpos en mezclas complejas.
Inoculación: ver Inmunización.
Interacción primaria: la primera de las etapas en la que ocurre la interacción entre antígenos y
anticuerpos in vitro o in vivo. Refiere a la unión específica entre un antígeno y su correspondiente
anticuerpo. Es una etapa no visualizable.
Interacción secundaria: etapa que sigue a la interacción primaria in vitro. Los inmunocomplejos
formados se agregan para dar diferentes fenómenos visibles que dependen del estado físico del
antígeno. Estas reacciones se aceleran con la temperatura, la agitación y la concentración de
electrolitos.
Interacción terciaria: fenómenos colaterales que ocurren a continuación de la interacción primaria in
vivo. Estas reacciones dependen del tipo de anticuerpo o células intervinientes, características y
dosis del antígeno, vía de inoculación, etc. Se pueden mencionar: la necrosis en la reacción de
Arthus, los fenómenos vasógenos y de contractura de la musculatura lisa en la anafilaxia, etc.
Isoaglutininas: nomenclatura original con la que se denominaban a los anticuerpos dirigidos contra
los antígenos (isoantígenos) del sistema ABO presentes en la membrana de los glóbulos rojos
sanguíneos.
Isotipos o clases: sinónimo de isoformas. Se refiere a las diferentes formas en una familia de
proteínas que se encuentran en todos los individuos de una especie. En nuestro caso refiere a las
diferentes formas o clases de inmunoglobulinas (ver Anticuerpos).
L
infocitos: una de las poblaciones de leucocitos, son células mononucleadas responsables de la
respuesta inmune adaptativa.
 B (LB): clase de linfocitos que median la inmunidad humoral. Son los encargados de
producir y secretar anticuerpos específicos cuando son activados. Los LB maduros vírgenes
se caracterizan por expresar en su membrana IgM que forma parte del receptor del LB
(BCR).
 B1 (LB1): subconjunto de LB que expresan un repertorio limitado de genes V con escasa
diversidad de unión, responden a antígenos timo-independientes y segregan IgM.
 BZM: subconjunto de LB ubicados en la zona marginal del bazo que responden a antígenos
microbianos con producción de IgM.
168
UNS
 de memoria: LB o LT específicos de antígeno, de larga vida. Son producidos a partir de

linfocitos activados en la respuesta primaria a un antígeno y son reactivados en la respuesta
secundaria y subsiguientes.
 proB: estadio temprano del desarrollo de los LB.
 proT: estadio temprano del desarrollo de los LT.
 T (LT): clase de linfocitos que participan del desarrollo de la inmunidad celular y humoral.
Los LT maduros se caracterizan por expresar en su membrana el receptor de LT (TCR).
 T CD8+ citotóxico (LTc): subclase de LT que se caracteriza por expresar en su membrana
el correceptor CD8 y reconocer antígenos peptídicos presentados por moléculas del CMH
clase I. Son los linfocitos efectores de la inmunidad celular.
 T CD4+ helper (LTh): subclase de LT que se caracteriza por expresar en su membrana el
correceptor CD4 y reconocer antígenos peptídicos presentados por moléculas del CMH clase
II.
 T CD4+ helper 1 (LTh1): LTh que producen un conjunto de citoquinas características.
Participan principalmente en la activación de macrófagos.
 T CD4+ helper 2 (LTh2): LTh que producen un conjunto de citoquinas que inducen en los
LB el cambio isotípico a IgE.
 T CD4+ helper folicular (LThF): LTh que se caracterizan por producir un conjunto particular
de citoquinas. Participan principalmente en la activación de los LB.
 T regulador: LT cuya acción puede suprimir las respuestas inmunes.
 virgen o naive: LB o LT maduro que ha dejado la médula ósea o el timo, respectivamente,
pero aún no ha encontrado su antígeno específico que lo active.
M
acrófago: células mononucleadas fagocíticas que residen en la mayor parte de los tejidos y
que deriva de los monocitos sanguíneos. Participan de la respuesta inmune innata y
adaptativa. En esta última funciona como células presentadoras de antígeno profesionales y como
células efectoras de la inmunidad humoral y celular.
Mastocitos (células cebadas): grandes células derivadas de la médula ósea que se encuentran
presentes en los tejidos conectivos de todo el cuerpo. Sus gránulos contienen una variedad de
mediadores químicos (histamina, etc.) y en su membrana se expresan receptores de alta afinidad
para IgE. Estas células participan de las reacciones de hipersensibilidad tipo I.
Médula ósea: tejido que se encuentra en la cavidad central de ciertos huesos y que constituye el
sitio principal de generación de los elementos celulares sanguíneos, incluidos los linfocitos
inmmaduros y el lugar de maduración de los LB.
Mieloma: tumor de células plasmáticas residentes en la médula ósea.
169
UNS
Moléculas del CMH: productos de los genes que conforman el Complejo Mayor de
Histocompatibilidad (CMH). Se los agrupan en tres clases y participan principalmente en la
presentación antigénica a los LT.
Monocitos: una de las poblaciones de leucocitos, son células mononucleadas precursoras de los
macrófagos tisulares.
Multivalente: refiere a la presencia de más de un sitio de unión para un mismo ligando o ligandos
diferentes. En el caso de un antígeno, refiere a la existencia de más de un epitope capaz de
interaccionar con anticuerpos. También pueden dar lugar a numerosos péptidos que luego serán
reconocidos por los LT.
N
eutrófilos: una de las poblaciones de granulocitos, la más abundante. Son células fagocíticas
que ingresan en grandes cantidades a tejidos que han sido infectados.
O
ntogenia: proceso de diferenciación y proliferación de un tipo celular en un tejido u órgano.
Opsonización: formación de una capa en la superficie de un patógeno u otra partícula con cualquier
molécula (opsonina) que facilite la fagocitosis. Los anticuerpos y el complemento son las principales
opsoninas que facilitan la fagocitosis por neutrófilos y macrófagos.
Órganos linfoides: tejidos organizados que contienen grandes cantidades de linfocitos en un estroma
no linfoide.
 primarios: tejidos donde se generan y maduran los linfocitos. En el hombre son la médula
ósea y el bazo para los LB y la médula ósea y el timo para los LT.
 secundarios: tejidos donde se inicia y desarrolla la respuesta inmune adaptativa. Son los
ganglios linfáticos, bazo y tejido linfoide asociado a las mucosas (amígdalas, placas de
Peyer, apéndice).
P
arámetro: es el término aplicado a señales medidas por un citómetro de flujo.
Paratope o sitio de combinación del anticuerpo: región de la molécula de inmunoglobulina que

establece una unión de tipo no covalente con el epitope.
Período de desencadenamiento: en la reacción anafiláctica experimental (en el caso de Anafilaxia
Cutánea Pasiva) es el período que transcurre entre la introducción de la dosis desencadenante de
antígeno vía intravenosa y el sacrificio del animal.
170
UNS
Período de latencia: en la reacción anafiláctica experimental (en el caso de Anafilaxia Cutánea

Pasiva) es el período en el que los anticuerpos heterocitotrópicos inoculados intradérmicamente se
fijan a mastocitos y basófilos a través de su Fc.
Peroxidasa: hemoproteína que cataliza una reacción de oxidoreducción donde se transfieren
electrones desde un donante (forma reducida de un compuesto cromogénico en las reacciones de
EIA) al peróxido de hidrógeno.
Plan de inoculación: período de inmunización con un antígeno dado en un animal vertebrado e
inmunológicamente maduro que establece frecuencias y vías de administración, uso de adyuvantes, y
otros cuidados a tener en cuenta con el objetivo de generar una respuesta inmune.
Plasma: líquido biológico de color amarillento y aspecto límpido en condiciones basales. Se obtiene
luego de centrifugar la sangre recolectada con anticoagulante.
Precipitación: fenómeno visible por formación de un precipitado blanquecino que resulta de la
interacción secundaria entre un antígeno soluble y su correspondiente anticuerpo específico.
Precipitación salina: fenómeno químico visible generado a partir de la mezcla de dos soluciones y
que da como resultado un precipitado insoluble.
Preparado específico de Ig: Producto derivado de un antisuero que contiene en alta concentración
anticuerpos que interaccionan específicamente con un antígeno en particular.
Preparado inespecífico de Ig: Producto derivado de un suero normal que contiene anticuerpos que
interaccionan específicamente con más de un antígeno.
Prozona: fenómeno propio de la aglutinación. Se caracteriza por la ausencia de aglutinado en las
primeras diluciones de una batería de titulación, donde la concentración de anticuerpo es máxima, y
con aglutinación a diluciones mayores. Este comportamiento se explica por la poca probabilidad que
existe de que los dos sitios activos de un anticuerpo se unan a epitopes de dos moléculas de
antígeno diferentes y en consecuencia se forme la red.
uemoquinas: proteínas pequeñas que intervienen en la conducción de los leucocitos a los sitios
Q en los que se necesitan sus funciones.
R
eacción cruzada: se observa cuando un antisuero elaborado contra un antígeno dado reacciona
con antígenos parcialmente relacionados que poseen uno o más determinantes antigénicos
idénticos o similares.
Reacción de Coombs: prueba diagnóstica en la que se utiliza un suero anti-inmunoglobulina para
aglutinar antígenos particulados (eritrocitos, bacterias) recubiertos por anticuerpos.
Reacción primaria: ver Interacción primaria.
Reacción secundaria: ver Interacción secundaria.
171
UNS
Reacción serológica: reacción antígeno-anticuerpo donde los anticuerpos se encuentran en un suero

en estudio.
Reacción terciaria: ver Interacción terciaria.
Reacciones de hipersensibilidad: estados de hiperreactividad a un antígeno. Son respuestas
inmunes excesivas o inadecuadas a un antígeno inocuo que dan origen a reacciones sintomáticas
después de una nueva exposición.
Región constante: dominios carboxiterminales, relativamente invariables, de las cadenas de
inmunoglobulinas pesadas y livianas, y de las cadenas peptídicas del TCR. Conforman el sitio o
dominio efector de las inmunoglobulinas.
Región variable: dominios amino-terminales de las cadenas pesadas y livianas de las
inmunoglobulinas y de las cadenas del TCR. Conforman el sitio o dominio de unión al antígeno.
Regiones hipervariables: ver CDR.
Respuesta inmune: proceso puesto en marcha por el sistema inmune que se desencadena ante la
exposición a un agente patógeno o cualquier molécula extraña.
 adaptativa: respuesta a un antígeno donde participan LB y LT específicos (ver Inmunidad
humoral e Inmunidad celular) y que incluye el desarrollo de memoria inmunológica.
 innata: conjunto de mecanismos de protección que existen antes de la infección, responden
rápidamente a los patógenos y reaccionan de la misma forma antes infecciones repetidas.
Respuesta primaria: respuesta inmune adaptativa que se produce después de la primera exposición
a un antígeno determinado.
Respuesta secundaria: respuesta inmune adaptativa que sigue a una segunda o subsiguiente
exposición a un antígeno determinado. Difiere de la respuesta primaria en la velocidad con que se
inicia y llega a su máximo nivel.
S
alting out: fenómeno que se produce en una solución de proteínas cuando se incrementa la
fuerza iónica del medio por agregado de una sal. Aunque inicialmente el agregado de una sal
aumenta la solubilidad de las proteínas en solución, a medida que se eleva la fuerza iónica, por
aumento en la cantidad de sal, la solubilidad alcanza un máximo que es seguido por una disminución
de la misma. Probablemente se produce una competencia por las moléculas de agua de solvatación
entre las proteínas y la sal. En consecuencia, aumentan las interacciones proteína-proteína causando
su precipitación.
Screening: ensayo o prueba clínica sistemática, en general de bajo costo y gran simplicidad que
permite la investigación de una sustancia o atributo, lo que contribuye a detectar tempranamente la
presencia de una condición o enfermedad.
172
UNS
Shock o choque anafiláctico: reacción anafiláctica sistémica desencadenada en los minutos

siguientes al contacto con un antígeno (alérgeno) para el cual se estaba previamente sensibilizado.
El tracto respiratorio es el tejido más afectado (edema traqueal) y puede sobrevenir la muerte por
asfixia.
Sistema: en las reacciones inmunológicas experimentales, el par antígeno-anticuerpo de interés.
Suero: líquido biológico de color amarillento y aspecto límpido en condiciones basales. Para
obtenerlo se deja coagular la sangre, recolectada sin anticoagulante, 1 a 2 horas en baño a 37 °C,
se centrifuga y luego se separa.
Suero hiperinmune: ver Antisuero.
Suero inmune: ver Antisuero.
Suero pre-inmune: suero que se obtiene de un animal de experimentación previo al primer estímulo
con un antígeno. Se lo estudia para descartar la presencia de anticuerpos preexistentes que
produzcan reacciones cruzadas con el antígeno inoculado.
T
ejido linfoide: ver Órganos linfoides.
Tejido linfoide asociado a mucosas (MALT): acumulaciones de células linfoides en los epitelios
mucosos y lámina propia subyacente. Los principales MALT son el tejido linfoide asociado con el
intestino (GALT) que incluye las amígdalas palatinas, las placas de Peyer del intestino delgado y las
capas de linfocitos intraepiteliales y el tejido linfoide asociado a bronquios (BALT) que se encuentra
en las vías respiratorias.
Timo: órgano linfoide primario situado en el mediastino anterior, donde maduran y se seleccionan los
LT.
Título: en aglutinación, inversa de la máxima dilución que produce la observación del fenómeno de
interacción secundaria. Es una medida semicuantitativa de la presencia de anticuerpos específicos.
U
nidad hemolítica 50%: es la menor cantidad de suero capaz de producir la lisis del 50 % de un
sistema antígeno-anticuerpo, formado por glóbulos rojos de carnero y su correspondiente
anticuerpo (vía clásica) o de glóbulos rojos de determinadas especies animales en condiciones
adecuadas (vía alterna).
V
acunación: ver Inmunización activa.
173
UNS
Valencia: En el caso de un antígeno, refiere al número de epitopes capaces de interactuar con el

anticuerpo. En el caso de un anticuerpo se refiere al número de sitios de combinación funcionales
para el antígeno.
Valor de corte (cut off): valor obtenido estadísticamente a partir del estudio de un determinado
número de sueros negativos, con el que se discrimina si una muestra es positiva o negativa para la
presencia de anticuerpos específicos. En el caso del trabajo práctico de ELISA será el valor de
absorbancia a partir del cual un suero se considera positivo.
W
estern blot: técnica inmunoquímica muy utilizada para el estudio de mezclas antigénicas.
Consiste en una primera separación por electroforesis (PAGE-SDS) tras la cual los
componentes se transfieren, bajo un campo eléctrico, a una membrana donde se fijan. Luego, se
realiza la inmunodetección de uno o más de los componentes antigénicos utilizando anticuerpos.
Z
ona de equivalencia: frente a una curva de precipitación refiere a aquella zona ubicada entre las
zonas de exceso de anticuerpo y la de exceso de antígeno y en la que la precipitación es
máxima.
174
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Alemán. CABA (2003).
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176

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PRÓLOGO

Esta Guía Teórico-Práctica se propone brindar los conocimientos básicos

UNIDAD 1: CONCEPTOS INTRODUCTORIOS

UNIDAD 2: EL SISTEMA INMUNE INNATO

UNIDAD 3: EL SISTEMA INMUNE ADAPTATIVO

UNIDAD 5: EL SISTEMA INMUNE EN PATOLOGÍAS Y RECHAZO DE

APÉNDICE I: BIOSEGURIDAD 139

REACCIONES DE INTERACCIÓN PRIMARIA Y SECUNDARIA

Determinantes antigénicos y epitopes

EPITOPE ANTÍGENO EPITOPE

Figura 1: Representación esquemática de un antígeno con cuatro epitopes diferentes.

El epitope es la zona del antígeno que interactúa de manera complementaria con el

Figura 2: Representación esquemática de un epitope conformacional y un epitope lineal.

INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO IN VITRO

Las técnicas de interacción primaria permiten la identificación de antígenos o

Figura 3: Esquema de inmunomarcación directa.

Inmunomarcación indirecta: emplea un anticuerpo sin marca (primario) que

Figura 4: Esquema de Inmunomarcación indirecta

Clasificación de los enzimoinmunoensayos

ELISA para identificar y semicuantificar antígenos

Figura 5: Distintos diseños de ELISA para la determinación de antígenos.

La etapa de bloqueo sigue a la de la sensibilización. Con este fin se emplean

cromogénica (DH) funciona como donante de electrones y el peróxido de hidrógeno como

2 DH + H2O2 2 H2O + 2 D (cromógeno oxidado coloreado)

En resumen, los pasos de la técnica son:

Donde n es el número de muestra negativas analizadas, m es la media aritmética y xi

El valor de corte (X) estará determinado por: X = XAbs + (3 x DS)

Las reacciones de precipitación, cualitativas, semicuantitativas o cuantitativas

Antígenos hemáticos: Sistemas ABO y Rh

Fuc Gal Fuc Gal Fuc Gal

NAcG NAcG NAcG

Gal Gal Gal

Glu Glu Glu

CERAMIDA CERAMIDA CERAMIDA

GLUCOLÍPIDO BASE ANTÍGENO A ANTÍGENO B

Figura 6: Composición de los isoantígenos del sistema ABO.

El sistema Rh contempla cinco antígenos de los cuales el antígeno D es el de mayor

Figura 7: Esquema de la ubicación del antígeno D en la membrana de los hematíes.

Para la determinación de los antígenos hemáticos del sistema ABO se emplean

Blanco Control (-) Control (+) Muestra

- 100 μl 100 μl 100 μl

 Cubrir la policubeta con cinta adhesiva para evitar la evaporación.

No reactivo < cut off

Grupo sanguíneo Suero anti-A Suero anti-B

Segunda parte: Investigación de antígenos hemáticos por aglutinación

EL SISTEMA COMPLEMENTO EN LA RESPUESTA INNATA

EL SISTEMA INMUNE INNATO

ACTIVACIÓN DEL COMPLEMENTO

VÍA DE LAS LECTINAS VÍA ALTERNA

Se activa por la unión de una Se activa por la presencia de

C3a, C5a C5b-C9 C3b C3bi

formación del favoreciendo la

complejo de ataque fagocitosis

MUERTE DEL PATÓGENO

Figura 8: Activación del complemento en la respuesta inmune innata.

VALORACIÓN DEL COMPLEMENTO

hemólisis en función de la cantidad de complemento agregado, observándose que se

Figura 9: Porcentaje de hemólisis de glóbulos rojos en función de la cantidad de

La expresión matemática de esta curva es la ecuación de Van Krough donde X = K

APLICACIONES DEL ESTUDIO DEL COMPLEMENTO EN EL

La evaluación de la actividad del complemento o la cuantificación de las proteínas

Valoración de la vía alterna del complemento en unidades

Tubo Buffer de Suero o dilución del suero Dilución