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Práctica N°6 Espectrofotometría
Práctica N°6 Espectrofotometría
ESPECTROFOTOMETRIA
RELACIÓN DE EXPERIMENTOS:
OBJETIVOS:
INTRODUCCION:
Como se ha visto en la parte teórica, estos métodos hacen uso del espectro
electromagnético como fuente de radiación para hacer las mediciones.
La espectrofotometría utiliza como fuente, luz visible o del espectro ultravioleta (UV)
empleando los aparatos llamados Espectrofotómetros; en tanto que la fotocolorimetría que
vendría a ser una parte de la espectrofotometría, solamente utiliza luz del espectro visible
(400 a 800 nm), para hacer las determinaciones, empleando el aparato llamado
fotocolorímetro el cual emplea filtros de color para seleccionar un intervalo de longitud de
onda correspondiente al filtro usado. Tanto a la espectrofotometría como a la
fotocolorimetría, en conjunto, se les da el nombre de fotometría, pero en la actualidad este
término ya casi no se usa.
En la presente práctica sólo usaremos el fotocolorímetro
Abst Cst
----------- = ----------- (Ecuación 1)
Abx Cx
En una buena parte de los métodos fotocolorimétricos que se usan para determinar
una sustancia, se emplea, no una solución estándar sino varias, esto con el objeto de dar
mayor precisión a la medida; por lo tanto antes de emplear la ecuación 3, se deberá obtener
un factor de calibración para cada solución estándar, luego sacar el promedio y recien
emplearlo en la ecuación 3.
Otro método que con frecuencia se usa para obtener Cx , es mediante la curva de
calibración. Esto consiste en hacer un ploteo de las concentraciones de los estándar en el eje
“X” , frente a sus absorbancias ( usar siempre absorbancias netas ) en el eje “Y”. Con esta
gráfica se puede extrapolar, usando la absorbancia neta de la muestra X, para ver cual será
su concentración.
EXPERIMENTO 1 .
Reactivos:
Absorbancia o D.O
Absorbancia Neta ------
Concentración en mg % ------ ------
de los estándar de A. M.
Factor de Cali ------ ------
bración
Concentr. de la muestra ------ ------ ------ ------ ------ ------
Con los datos de las absorbancias netas de los tubos del 1 al 5 y sus respectivas
concentraciones, construir la curva de calibración para el anaranjado de metilo. Usar papel
milimetrado haciendo en cada eje las escalas adecuadas, en el eje X colocar
concentraciones de Anaranjado de Metilo y en el eje Y las absorbancias o Densidades
Ópticas netas. Trazar la línea tomando los puntos medios. Colocar o pegar la gráfica en el
siguiente espacio:
Figura Nº 1.2 .- Curva de calibración para el anaranjado de metilo
Nota (1): Hay fotocolorímetros que nos dan la absorbancia o densidad óptica (D.O)
directamente. Otros aparatos como los fotocolorímetros Klett dan en unidades
Klett (UK), que son unidades proporcionales a la densidad óptica. Para convertir
D.O. en U.K., multiplicar la D.O. por 500; en tanto que para convertir U.K. en
D.O., multiplicar U.K. por 0.002 ó dividir la U.K. entre 500.
Nota (2): Si por alguna razón no está operativo el fotocolorímetro del laboratorio se puede
trabajar con las siguientes D.O. : Tubo 1: 0.320; tubo 2: 0.460; Tubo 3: 0.650;
Tubo 4: 0.840; Tubo 5: 0.950; Tubo 6 (Muestra x): 0.720 y tubo 7 (blanco):
0.00
EXPERIMENTO 2.
DETERMINACION DEL ESPECTRO DE ABSORCION DEL ANARANJADO DE
METILO.
La determinación de un espectro de absorción siempre debe hacerse usando un aparato
que pueda seleccionar una longitud de onda determinada. Como se sabe, para determinar un
espectro de absorción de una sustancia, hay que medir la D.O. en varias longitudes de onda
determinadas, una por una, y luego hacer un gráfico donde se plotea las D.O. ( en el eje Y)
frente a las longitudes de onda ( en el eje X ). Cada sustancia en solución tiene su espectro
de absorción característico y así podemos identificar de que sustancia se trata.
Procedimiento:
De la solución de Anaranjado de Metilo del experimento 1, que tiene una
concentración de 1 mg %, hacer una dilución 1: 2.5 con agua destilada.
Longitud de Absorbancia
onda (nm) (D.O)
400 0.290
420 0.320
440 0.380
460 0.420
480 0.375
500 0.200
520 0.180
550 0.090
Cuál es la longitud de onda con la que se obtiene mayor absorbancia para el Anaranjado de
Metilo? ___________
INTERROGANTES BIOQUIMICAS.
1. Que es transmitancia y que es Absorbancia. Qué relación existe entre estos términos?
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3. Que es una curva de calibración y que es Factor de calibración. Como se las obtiene?
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