Universidad del Noreste.

Biología Molecular.
Licenciado en Químico Farmacéutico Biólogo.
Docente: M. en C. Marco A. Pineda Mtz.
Plantilla ADN Recombinante II

Alumnos:

Antes de realizar la plantilla, deberás leer y analizar los siguientes temas:

 Propiedades físico-químicas del DNA.
 Clonación molecular.
 Técnicas y herramientas de la Ingeniería Genética y el DNA recombinante.
 Genómica y proteómica.

1. Investigue y describa brevemente el método de réplica en placa.

R. La réplica en placa es una técnica que consiste en presionar un disco cubierto de
terciopelo  sobre una placa con colonias celulares de forma que se adhieran al material
algunas células de las colonias originales y, luego, volver a presionar con el disco de
terciopelo  en placas secundarias para volver a trasladar las células, pero esta vez del
terciopelo a la nueva placa virgen. 
Generalmente, la réplica en placa se usa para la selección negativa de colonias. Es
decir, comparar las colonias presentes en la placa primaria con las colonias presentes
en  las placas secundarias  creadas que poseen medios selectivos, la presencia o no de
estas colonias nos indicara si una colonia en particular posee un genotipo tolerante a
ese medio.

R. Investigue y describa cómo se realiza la selección negativa de transformantes.

S. Genere una lista en la que compare y contraste los siguientes métodos de

secuenciación. Sea breve y conciso al exponer sus puntos.

Método de Sanger Pirosecuenciación

o Aprovechan los beneficios de la o Va añadiendo uno a uno los
PCR nucleótidos y están marcados
o Laborioso con marcador fluorescentes
o Existencia de marcadores cuando se lo añade en la cadena
fluorescentes en los nucleótidos complementaria del ADN se une
o Se necesita una cadena sencilla de y se libera fluorescencia un
DNA como molde detector lo registra cuando no se
o Se utiliza un primer, generalmente une nada no hay señal, se hace
cortos, actúa como un cebador lavado y se agrega el siguiente
para una nueva cadena nucleótido, en cada nucleótido un
complementaria, siguen el mismo lavado.
régimen de la replicación. o Cuatro enzimas: ADN polimerasa
o Los cuatro desoxirribonucleótidos (que cada vez que añade un
trifosfatos (dATP, dGTP, dCTP y nuevo desoxirribonucleótido
dTTP) trifosfato a la cadena naciente
 o La enzima ADN-polimerasa genera una molécula de PPi),
o Los cuatro didesoxirribonucleótidos ATP sulfurilasa (que convierte el
trifosfato (ddATP, ddGTP, ddCTP y PPi en ATP en presencia de APS),
ddTTP) que son utilizados por la luciferasa (que, en presencia de
ADN polimerasa para construir la ATP, convierte la luciferina en
nueva hebra pero, una vez oxiluciferina y genera un fotón de
incorporados, impiden la adición luz visible) y apirasa (que
de nuevos nucleótidos. degrada los nucleótidos que no
se han incorporado a la cadena
naciente y el ATP generado por la
sulfurilasa).
o Muy costoso requiere muchos
reactivos.
o Cada ciclo un lavado.
o Un ADN de cadena sencilla que
actúa como molde
o Un cebador para iniciar la síntesis
de ADN tres
desoxirribonucleótidos trifosfato
(dGTP, dCTP y dTTP)

T. Genere una lista con un mínimo de 7 aplicaciones prácticas (cualquier uso:

industrial, médico, científico, etc.) de la tecnología del DNA
recombinante/Ingeniería genética.

Aplicaciones de la Tecnología del DNA recombinante

1. Estudiar la estructura de los genes, su secuencia y su expresión en órganos,

tejidos y células individuales
2. Expresar proteínas y estudiar su estructura y funcionamiento in vivo; aislar y
purificar proteínas estudiar la estructura de las proteínas y su funcionamiento in
vitro
3. Utilizar proteína purificado para fabricar anticuerpos con fines médicos y/o
fabricar vacunas para el tratamiento de las enfermedades
4. Diagnosticar trastornos en la genética humana y enfermedades infecciosas
5. Utilización en aplicaciones forenses tales como la identificación genética del DNA
6. Forzar la mutación de los genes y estudiar el funcionamiento de la proteína
alterada producida
7. Encontrar la ubicación cromosómica de los genes clonados, determinar el número
de copias de los genes y estudiar su estructura

U. Suponga que transforma una cepa de E. coli con un cósmido que contiene el cDNA
de la mioglobina; el constructo sólo posee una secuencia promotora de E. coli para
permitir su transcripción
a) ¿se traducirá la proteína eucariótica de manera correcta y funcional? Sustente
su respuesta.
R. No se traducirá ya que de una célula procariota a una eucariota, para poder
hacer posible la conversión se necesita de un promotor obtenido por dicho
 plásmido, puede darse la traducción , pero una bacteria no es capaz de realizar las
modificaciones postraduccionales, además tienen diferentes estructuras como la
información genética está más organizada que la procariota aparte que contienen
organelos, como los ribosomas, retículo endoplasmático entres otros y la bacteria
no, para poder obtener una secuencia de a.a que codifica una proteína para poder
hacer el dogma central se podría efectuar en la célula procariota pero no de
manera funcional, pero no habrá una traducción correcta porque no habrá dichos
organelos en la bacteria para efectuar la traducción.

V. Ud. transforma una cepa mutante de E. coli que posee el genotipo Lac I¯ O+ Z+ Y+
A+ con un vector de expresión recombinante que lleva el gen Lac I+
a) En ausencia de lactosa, ¿el gen estructural Z será expresado o reprimido?
Sustente su respuesta.
R. Reprimido, El gen I- está deficiente en el genotipo original, con el vector le agrego
ese mismo gen pero positivo, cualquier gen puede ser reprimió , si no se le inserta
nada a la E. coli, la E. coli no va a tener represor y por lo tanto en presencia y/o
ausencia de lactosa va a seguir produciendo, en presencia de lactosa se unirá al
represor habrá enzimas y va a ver un dogma central en ausencia de lactosa, el gen
inyectado va a reproducir represores y se unirá al operador.

W. El ciprofloxacino es un antibiótico utilizado en gran variedad de infecciones

bacterianas. Uno de los blancos del ciprofloxacino en E. coli es la topoisomerasa.
Explique por qué la topoisomerasa es un blanco eficaz para tratar infecciones.
Sustente su respuesta.

R. La topoisomerasa representa un punto clave en el uso del ADN ya que su función es

el desenrollamiento de las cadenas disminuyendo la tensión sobre ellas, de esta
manera al no poder hacer esta acción no puede llevarse su replicación comenzando por
su abertura para dar origen a una nueva cadena.

X. Valor de 3 puntos (1 por inciso). Un plásmido resistente a ampicilina y a

tetraciclina, pBR322, se incuba con PstI. El plásmido cortado con PstI se recombina
con un cDNA eucariota de interés, el plásmido se liga y se utiliza para transformar
una cepa de E. coli mediante electroporación. Nota: investigar plásmido pBR322.
Indique:

a) ¿Qué antibiótico debe añadirse al medio de cultivo para seleccionar las células
que han incorporado el plásmido? ¿Por qué?
R. Ampicilina, porque el plásmido tiene un gen en particular que le confiere la
resistencia a este antibiótico.

b) ¿Cómo seleccionaría las colonias transformantes de E. coli que han incorporado

el gen de insulina? ¿Por qué?
R. Serian escogidas las colonias que no pudieron crecer en el medio con el antibiótico;
a esto se le llama selección negativa, en donde la bacteria perdería su resistencia y
adquirirá una nueva, la que fue introducida de interés.
 R. ¿Cómo explicaría la presencia de colonias que sean resistentes a ambos
antibióticos? ¿Por qué?
R. Dentro del plásmido existen unos sitios específicos que son cortados por
enzimas de restricción, en donde son introducidos fragmentos de ADN de interés.
Existe uno en particular llamado EcoRI en donde al ser introducido en esta zona no
altera ninguno de los dos genes de resistencia; por lo que la bacteria expresaría
ambas.