Temas 6 y 7

CROMATOGRAFIA-TEMAS-6-7.
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luciaynz
Técnicas Instrumentales
3º Grado en Farmacia
Facultad de Farmacia
Universidad de Santiago de Compostela
Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
La IUPAC (1993) recomienda la siguiente definición: La cromatografía es un método físico de separación en el
que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria (fase
estacionaria) mientras que la otra (la fase móvil) se mueve en una dirección definida.
- Las cromatografías se denominan según la naturaleza de la fase móvil.

- Atendiendo al mecanismo tenemos los TIPOS de Cromatografías.
- Atendiendo a la forma de realizar el proceso tenemos las TÉCNICAS cromatográficas en columna o

planas.
La sigla HPLC es un acrónimo de High Perfomance Liquid Chromathography (Cromatografía Líquida de Alta
Eficacia/Resolución, que se denomina en español CLAR o CLAE). El flujo de la fase móvil se consigue por:
- GRAVEDAD: Cromatografía Líquida Clásica.

- PRESIÓN: Cromatografía de Gases, HPLC y Supercríticos.
- CAPILARIDAD: Capa fina y Papel.
- FLUJO ELECTROOSMÓTICO: Electrocromatografía Capilar.
Si la fase móvil es líquida el proceso se suele denominar ELUCIÓN. A veces a la fase móvil líquida se la denomina
ELUYENTE o DISOLVENTE
Cromatograma: Representación gráfica del proceso

cromatográfico. Representación gráfica de la respuesta
del detector, concentración del analito en el eluyente
u otra cantidad usada como medida de concentración
del eluyende frente al volumen del ismo o del tiempo.
En la cromatografía plana, cromatograma se refiere al
papel o bloque con zonas separadas.
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TIPOS DE CROMATOGRAFÍA
FASE MÓVIL, FASE ESTACIONARIA Y MECANISMO
PROCESO CROMATOGRÁFICO
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CROMATOGRAMA

.

En cromatografía de adsorción la fase estacionaria consta de un sólido activo, las que tengan afinidad por
dicho sólido avanzarán con más velocidad. K es la cte de distribución, concentración de las partículas en
superficie de la fase estacionaria activa partido por la concentración de la fase móvil. El fabricante Podrá
darnos dicho dato.
El factor de retención está influido por:
- Cromatografía Líquida: Naturaleza de la fase estacionaria y de la fase móvil

- En cromatografía de gases depende de la fase estacionaria
- En todas depende de la temperatura
En las columnas tal como vienen de fábrica están fijadas:
- Naturaleza de la fase estacionaria

- La relación de fases
- La Longitud de la columna
Factor de separación (a) – selectividad

Describe la posición relativa de un compuesto con respecto a otro adyacente.
- T’R = tiempo de retención corregido del compuesto que sale inmediatamente antes o después
- Mediante esta definición obtenemos el factor de separación.
- T0 = tiempo muerto
Retención relativa (r):

Describe la posición relativa de un compuesto con respecto al pico de un patrón. Los picos no tienen por qué
ser adyacentes y el patrón puede salir más tarde que el compuesto.
- Si el compuesto sale más tarde que el patrón la retención relativa será < 1.
- Si el compuesto sale antes que el patrón será < 1
A y r dependerán de los mismos factores de los que hemos

visto que dependía el factor de retención k.
Para un determinado tipo de columna (columna con igual

fase estacionaria), con una determinada fase móvil y a una
determinada temperatura su valor es el mismo,
independientemente del instrumento utilizado. Esta es la
base del ANÁLISIS CUALITATIVO. Si una sustancia da un pico
reconocible en el cromatograma se puede utilizar como
referencia y pueden tabularse los factores de separación de
los otros picos con respecto a éste.
Dos cromatogramas de las mismas sustancias 1 y 2 realizados

con dos cromatógrafos diferentes. En la columna A el tiempo
muertO es 2 y en la B es 1. Varían los tR y K pero el factor de
separación y la retención relativa dará lo mismo.
Número de Platos (N)
Los primeros cromato grafistas tuvieron que establecer un parámetro que midiera la capacidad de separar
compuestos: la eficacia de la separación.
Sabían que en la destilación fraccionada al aumentar el número de platos aumentaba la eficacia de la

separación y decidieron llamarle a este parámetro: Número de platos teóricos
Destilación fraccionada: Más platos, más logro separar la sustancia más volátil de la menos volátil, más puras
serán ambas. Están a diferentes temperaturas.
Proceso: introduzco una sustancia pura y a medida que avanza el proceso una sustancia avanzará más que
otras, se va haciendo más ancho el pico.
Nos interesa que los tR sean altos y que la desviación estándar sea lo menor posible (anchura del pico
pequeña) y así será más eficaz. Por lo tanto, el número de platos se calcula con el tR/alfa.
- W: anchura en la base del pico cuando se trazan las tangentes por el punto de inflexión que es igual a
4ª -> llegamos a otra fórmula: N = 16 x (tR/w)2
- Wa: anchura a la semialtura = 2,355ª
- ¡El número de platos es un número sin unidades!
- Debemos pasar a las mismas unidades tanto tR como W (cm), para ello debemos conocer la velocidad
del registro.

Altura equivalente del plato teórico (AEPT)
Para aumentar N podemos aumentar la longitud de la columna o disminuir la altura equivalente del plato
teórico. H depende de la velocidad de la fase móvil principalmente y de otros factores. Todos los que hagan
que disminuya H aumentarán la eficacia.
Resolución: Mide la capacidad de separar los compuestos.
Hay solapamiento en la gráfica que observamos. Estarían bien
resueltos cuando NO hay solapamiento entre ellos. La
resolución es un parámetro CUANTITATIVO. Resolución de
compuestos adyacentes.
- Algo de solapamiento, cortan en la línea base: R = 1

- Cuando sale uno inmediatamente sale el otro: R = 1,5
- Resoluciones mayores de 1,5 son buenas
- Resoluciones menores de 1,5 malas

Distinguir entre resolución y separación:
Los compuestos pueden estar muy separados y mal resueltos

y viceversa. Nos interesa aumentar la resolución aunque
estén menos separados.
Resolución y eficacia:
Demostración para llegar desde la fórmula medida en el

cromatograma. No es necesaria saber la demostración de la
fórmula, solo la primera.
La resolución depende de:
- K y a: Parámetros termodinámicos
- N: Parámetro cinético
- Para aumentar la resolución debemos aumentar cada
una de las magnitudes entre paréntesis de la ecuación
anterior

𝛂−𝟏
- 0, cuando α = 1 Los tiempos de retención de los dos compuestos son iguales. No hay
𝛂 separación.
- 1, cuando α = ∞
- 0, cuando k = 0 (t R = t 0) Compuesto sale mismo tiempo que el soluto no retenido. No

𝐤𝟐 hay separación.
𝟏 + 𝐤𝟐 - 1, cuando k = ∞
En la práctica no se aumenta k por encima de k = 5, ya que
para valores de k > 5 el aumento relativo de (k/1+k) es
pequeño tal como se muestra en la figura.
Asimismo, para aumentar N2 (recordemos que N = L/H)

debemos aumentar la longitud de la columna o disminuir
la altura del plato. La altura del plato depende de la
velocidad de la fase móvil según una ecuación del tipo:

Para cada tipo de cromatografía (gaseosa o líquida) y cada columna, los parámetros A, B y C varían. La
representación de H en función de la velocidad de la fase móvil se muestra en la figura para una cromatografía
líquida y otra gaseosa
Existe una velocidad óptima que hace que la AEPT sea

mínima y por lo tanto se consiga el máximo número de
platos teóricos y máxima eficacia.
Sin embargo, en cromatografía líquida esta velocidad

óptima suele ser demasiado pequeña, por lo que trabajando
a esa velocidad óptima teórica el proceso cromatográfico
sería muy lento. Se prefiere, en este tipo de cromatografías,
sacrificar eficacia (trabajando por encima de la velocidad
óptima) para disminuir el tiempo necesario para la
realización del cromatograma. No ocurre lo mismo en las
cromatografías gaseosas donde se debe trabajar a la
velocidad óptima o próxima a ella.
- Si no se varía ningún parámetro o condición durante el proceso cromatográfico: RÉGIMEN ISOCRÁTICO

- Si se varía algún parámetro o condición durante el proceso cromatográfico: RÉGIMEN NO ISOCRÁTICO
- En CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA Se varía la COMPOSICIÓN DE LA FASE MÓVIL: Elución en gradiente.
- En CROMATOGRAFÍA GASEOSA Se varía la TEMPERATURA: Temperatura programada (con gradiente
de temperatura).
- En CROMATOGRAFÍA IÓNICA Se varía la FUERZA IÓNICA DE LA FASE MÓVIL
- En CROMATOGRAFÍA DE FLUIDOS SUPERCRÍTICOS Se varía la PRESIÓN

Si lo que se pretende es separar cantidades apreciables de componentes: CROMATOGRAFÍA PREPARATIVA
- FASE ESTACIONARIA: Polar (o más polar que la fase móvil): Cromatografía en FASE NORMAL.
- FASE ESTACIONARIA: Apolar (o menos polar que la fase móvil): Cromatografía en FASE REVERSA.
El triángulo cromatográfico
Fases estacionarias en Cromatografía de Reparto
Columnas empaquetadas:
- Polar (Fase Normal): Polietilenglicol (PEG) y Carbowax (Nombre comercial para mezclas de
polietilenglicoles)
- Apolar (Fase Reversa) Polímeros hidrocarbonados: Apiezón: Mezcla indefinida de hidrocarburos
Escualano: Hidrocarburo poliisoprénico isopreno:
Siliconas (polisiloxanos) No Polar, Polaridad intermedia, Polar. A temperatura de trabajo son fluidas.
FASE ESTACIONARIA LIGADA: No se utiliza
Fase estacionaria líquida:

La fase estacionaria juega el papel protagonista puesto que la fase móvil es inerte. Es líquida tanto en la
cromatografía gas-líquido como en la gaseosa de reparto y debe reunir una serie de condiciones:

- Temperatura de ebullición superior a 200ºC a la T de operación
- Estable a la temperatura de operación
- Inertes respecto al gas portador y solutos de la muestra
- Baja viscosidad
- Disolver en cierta medida a los componentes a separar: igual disuelve igual

DETECTORES:


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- Cromatografía Líquida: Naturaleza de la fase estacionaria y de la fase móvil

En las columnas tal como vienen de fábrica están fijadas:

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Factor de separación (a) – selectividad

Retención relativa (r):

A y r dependerán de los mismos factores de los que hemos

Para un determinado tipo de columna (columna con igual

Dos cromatogramas de las mismas sustancias 1 y 2 realizados

Sabían que en la destilación fraccionada al aumentar el número de platos aumentaba la eficacia de la

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- Algo de solapamiento, cortan en la línea base: R = 1

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Los compuestos pueden estar muy separados y mal resueltos

Demostración para llegar desde la fórmula medida en el

La resolución depende de:

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- 0, cuando k = 0 (t R = t 0) Compuesto sale mismo tiempo que el soluto no retenido. No

Asimismo, para aumentar N2 (recordemos que N = L/H)

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Existe una velocidad óptima que hace que la AEPT sea

Sin embargo, en cromatografía líquida esta velocidad

- Si no se varía ningún parámetro o condición durante el proceso cromatográfico: RÉGIMEN ISOCRÁTICO

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