Biotecnología Animal

Docente: Irina Trejo

Nombre: Nicolle Vargas

Grupo:1

PROCESO PARA EL SEXAJE DE EMBRIONES EN EL BOVINO Y

MEDIANTE MICROMANIPULACION.

Una de las tecnologías que se está utilizando en los ú ltimos añ os es

el uso de semen sexado, el cual es un avance tecnoló gico que permite asegurar

el sexo del ternero, sin embargo, es una tecnología que aporta un 90% de

efectividad al momento de emplearla (Weigel 2004), es por eso por lo que es

importante conocer si en realidad es factible implementar esta técnica en la

utilizació n de la transferencia de embriones. Una técnica por la inseminació n

artificial, que se puede definir como una técnica que se utiliza para el

mejoramiento genético de un hato bovino, donde se busca tener animales de

alta productividad (Roa 2014). Dentro de esta tecnología ha sido desarrollada

para mejorar los diferentes aspectos necesarios de la reproducció n y también

mejorar el valor genético de cada animal seleccionando las características

deseadas, ya que esta prá ctica permite escoger lo que se busca y necesita

cambiar.

El sexaje por PCR es especialmente ú til en procesos de investigació n en

los cuales se requiere determinar el sexo de los embriones obtenidos (por

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ejemplo, cuando se utilizan aditivos en los medios y se quiere determinar su

efecto sobre la proporció n de sexos). Los pasos bá sicos para el sexaje de

embriones bovinos por PCR.

Transferencia de embriones

Se realiza la selecció n de las donadoras está regida por criterios

de productividad, mejoramiento genético y valor agregado de las crías, ya que

sus costos tienden a reducirse en la medida que aumentan estos aspectos.

La aspiració n folicular de las vacas donantes, se realiza con la

intenció n de obtener oocitos inmaduros pero viables, que consiste en la

punció n de los folículos y la extracció n del líquido que contiene los oocitos,

para el procesamiento de los mismos en el laboratorio. Dicho procedimiento se

debe realizar por lo menos 8 días antes de la fecha de transferencia de

embriones. Se registra en una planilla de trabajo, de tal forma a tener trazado

la combinació n del oocito y el espermatozoide.

Procedimiento para la aspiración folicular

1. Contenció n de los animales, sujetá ndolos en un cepo.

2. Aplicació n de anestesia Epidural baja con Lidocaína al 2% (6 ml

en cebuínas y 8 ml en taurinas).

3. Limpieza y desinfecció n de la vulva, retirando todo posible

material contaminante.

4. Palpació n rectal con ecó grafo para localizar y evaluar las

condiciones ová ricas (Cantidad de folículos a ser aspirados). Separació n de los

labios vulvares e introducció n de la guía de aspiració n folicular acoplado a un

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 transductor transvaginal microconvexo y una aguja nú mero 20 conectado a la

bomba de aspiració n y ecó grafo de buena resolució n, asegurando éste al techo

de la vagina en contacto con los ovarios.

5. Localizació n de los folículos y activació n de la bomba de aspiració n folicular

procediendo a la punció n de cada folículo y aspiració n de los oocitos.

6. Aspiració n de los folículos de mayor tamañ o (5 mm de diá metro en adelante,

dependiendo de la raza), para luego ser seleccionados.

7. Registro del nú mero o registro particular (RP) de la donante. El manejo de

criterios estrictos de selecció n asegurará la superioridad genética y un alto nivel de

éxito, lo que hace que el procedimiento sea má s econó mico.

Fecundació n In vitro en Laboratorio (FIV) La FIV en el laboratorio se efectú a en

varias etapas, ellas comprenden:

1) Recepció n de las muestras seleccionadas a campo.

2) Maduració n de los cú mulos de oocitos (COCs).

3) Fertilizació n con registro de los datos de la donante y el semen del toro

utilizado.

4) Cultivo de desarrollo de los cigotos.

Para la transferencia se prepara un inyector estéril con una cá nula

rígida en la base y flexible en la punta donde son colocadas las pajuelas de

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 embriones. Se debe considerar la presencia de cuerpos lú teos en los ovarios y

se define si se depositan uno o dos embriones.

Diagnóstico de preñez

Con este procedimiento se puede determinar el nú mero de vacas

receptoras que lograron preñ ar con éxito los embriones transferidos. El

proceso de diagnó stico de preñ ez se realiza a los 30 días luego de la

transferencia de embriones y la confirmació n de la gestació n a los 90 días del

mismo. En ambos casos el diagnó stico de la preñ ez se debe realizar con

ultrasonografía de tal manera a identificar los embriones implantados y demá s

estructuras del ú tero. Esta actividad tiene que registrarse en la planilla

correspondiente, para su posterior seguimiento en cuanto a registro de los

animales que van a nacer.

PCR

Remoción de zona pelúcida de embriones bovinos

El proceso de remoció n de zona pelú cida se debe realizar con el fin de

evitar que los espermatozoides adheridos en la zona pelú cida interfirieran con

los resultados del sexaje, dando falsos machos positivos.

El Procedimiento: En cabina de flujo laminar:

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 Seleccionar los embriones en estadio transferible (mó rula compacta,

blastocisto temprano, blastocisto expandido) o aquellos a los que se les desee

realizar extracció n de DNA o RNA.

Lavar cada embrió n pasá ndolo por 4 gotas de 100 μl de PBS

suplementado con PVP al 0,3%.

Pasar a una gota de 100 μl de solució n de pronasa al 0,5% durante 2 a 5

minutos en observació n permanente bajo estereoscopio, vigilando

constantemente los cambios en la zona pelú cida.

Al presentar cambios que indiquen degradació n, pasar inmediatamente

a una gota de 100 μl de PBS+PVP al 0,3% y pipetear manualmente hasta

desprender la zona pelú cida restante.

Tomar las células embrionarias y pasar a tubos de micro centrífuga de

1,5 ml con 20 μl de solució n de lisis (RTL) activada.

Almacenar a -80°C hasta el momento de su procesamiento.

Figura 1. Diagrama de remoció n de zona pelú cida.

Purificación de ADN total a partir de células

Se Adiciona 125 ml de etanol al 100% al buffer AW1 para obtener 220 ml

de buffer, y 160 ml de etanol al 100% para obtener 226 ml de buffer AW2.

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 A los embriones Re suspendidos en solució n de lisis en un tubo de 1,5

ml, agregar 200 µl de PBS 1X y 20 µl de proteinasa K y mezclar varias veces.

Figura 2 A. Adición de PBS y proteinasa K; B. Adició n de buffer de lisis e incubación de la muestra.

Adicionar 200 µl de buffer de lisis AL, agitar en el vó rtex e incubar en el

bañ o seroló gico a 56°C durante 10 minutos, temperatura en la cual la

proteinasa K es funcionalmente activa.

Pasados los 10 minutos, retirar los tubos del bañ o seroló gico, agregar

200 µl de etanol al 100% a la muestra y mezclar por vó rtex. Es importante que

la muestra y el etanol se encuentren bien homogenizados.

Con una micropipeta de 1000 µl, tomar la mezcla y transferirla a la

columna Mini Dneasy.

Centrifugar a 6000 xg (8000 rpm) durante 2 minutos y descartar el tubo

dejando libre la columna.

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 Transferir la columna a un nuevo tubo de colecció n y agregar 500 µl de

buffer de lavado AW1.

Centrifugar nuevamente a 6000 xg (8000 rpm) durante 2 minutos, y

descartar de nuevo el tubo dejando libre la columna.

Transferir la columna a un nuevo tubo de colecció n y agregar 500 µl de

buffer de lavado AW2.

Centrifugar a 20000 xg (14000 rpm) durante 4 minutos.

Transferir la columna a un tubo de micro- centrífuga de 1,5 ml y

agregar 50 µl de buffer de elusió n AE.

Centrifugar a 6000 xg (8000 rpm) durante 2 minutos y adicionar

nuevamente 50 µl de buffer de elusió n, centrifugar por ú ltima vez a 6000 xg

(8000 rpm) durante 2 minutos y descartar la columna.

Guardar el DNA a -80°C para ser empleado en la PCR.

Figura 3. Paso final en la elusión del DNA

Amplificación de DNA total para sexaje de embriones

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 Los primers empleados en la reacció n de amplificació n se reconstituyen

con agua libre de nucleasas a una concentració n de 100 mM. Para ello hay que

agregar 10 veces la cantidad de nanomoles en agua; por ejemplo, si estos

vienen a 36,5 nanomoles, para dejarlos a 100 mM se agrega 360 µl de agua

libre de nucleasas.

Una vez reconstituidos los primeros, preparar una solució n de trabajo a

10 mM. Los dNTP se preparan también a una concentració n de 10 mM para

emplearlos como solució n de trabajo en la PCR.

Procedimiento para la PCR:

En un tubo de 1 ml agregar cada uno de los reactivos. Es

recomendable agregar por ú ltimo la Taq polimerasa, para evitar reacciones

inespecíficas.

Después de agregar cada reactivo, mezclar por pipeteo y cambiar

de punta.

Una vez mezclados todos los reactivos de la Mix, agregar el DNA en un

lugar fuera de la cabina de PCR.

Finalmente, llevar los tubos para el termociclador y configurar el

siguiente perfil térmico.

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 Figura 4. Esquema de perfil térmico en la PCR.

Electroforesis en gel de agarosa al 1,5%

Procedimiento:

Pesar en una balanza 1,5 gr de agarosa grado molecular y

ponerla en un Erlenmeyer de 100 ml.

Adicionar 100 ml de buffer TAE 1X .

Calentar la mezcla hasta que quede homogenizada por completo.

Enfriar en agua para reducir la cantidad de vapores.

Agregar 10 ul de bromuro de etidio a una concentració n de 5

mg/ml y mezclar suavemente.

Con cuidado y sin inhalar los vapores, depositar la mezcla en la

cubeta de electroforesis y colocar suavemente la peineta.

Una vez realizado el gel:

Retirar la peineta, con cuidado de no dañ ar los pozos.

Agregar dentro de la cubeta buffer TAE 1X hasta cubrir los pozos del gel.

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Figura 5. Medición de la cantidad de agarosa; B. Adición de buffer TAE; C. homogenizació n de la agarosa.

Figura 6. A. Reducción de vapores; B. Adició n de bromuro de etidio;C. Adició n de la mezcla en la

cama

de electroforesis.

Sobre el papel parafilm, agre- gar 3 µl de DNA loading buffer dye 6X y 20 µl

del producto de PCR (el ream- plificado) y mezclarlo con el DNA loading buffer

dye 6X .

Sembrar 3 µl de marcador de peso molecular en el primer pozo del

gel seguido, y sem brar la mezcla de la muestra con el dye 6X en el gel.

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 Instalar los electrodos de la cámara de electroforesis: rojo con rojo

y negro con negro en la fuente de poder.

Correr el gel a 60 V durante 40 minutos.

Pasados los 40 minutos, retirar cuidadosamente la tapa de la

cá mara de electroforesis, retirar el gel y situarlo en la foto documentador.

Encender la luz UV y observar el amplificado. La presencia de dos

bandas (141 bp y 216 bp) indica que el embrió n es macho, y la presencia solo

de la banda de 216 bp indica que es hembra.

Figura 7. A. Retiro de peineta; B. Adición de buffer TAE en la cámara de electroforesis; C. Mezcla dye
con el producto de PCR.

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Figura 8. Gel de agarosa; resultados de sexaje de 10 embriones bovinos producidos in vitro.

Bibliografía

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development in vitro: timing, sex,and viability following vitrification, Biol

Reprod 71, 1671-1676.Kit DNeasy® Blood & Tissue. Quiagen. 25-27.

2. Ferná ndez E. 2014. Producció n de embriones in vivo en tres razas de ganado

lechero [Tesis]. LimaPerú : Universidad Nacional Agraria la Molina. 38 p.

3. Weigel K. 2004. Exploring the role of sexed semen in dairy production systems.

Journal of Dairy Science, 87 (E. Suppl.): E120-E130

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