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    LA MICROSCOPIA: HERRAMIENTA PARA ESTUDIAR CELULAS Y TEJIDOS CAPITULO 6 TECNICAS ESPECIALES DE MICROSCOPIA sm Capito ‘Linagsn Sims gos se Caples, Gants. {64 -Microscopio de contraste por interferencia diferencial ‘Blmisustopoclendain « 5 -Microscopio de flvorescencia nCapto 6 85 Técnicas epevinles 3 § 6 -Microscopio de luz ultavileta serscopie sm Cepia Suvasiendeacias sm Conctusines 6.7-Microscopio confocal: O Microscopio laser de barrido En la microscopia foténica clésica el tejido debe cortarse finamente para ser ‘examinado y mientras més delgado sea, mas nitida sera la imagen; pero con este orale sehtcbgalretxicorowenMONOWEDIaSt 7 ‘ Bibogaa método se pierde la informacisn tridimensional durante el corte. Si una muestra ‘gruesa es observada al microscopio foténico, la imagen que se enfoca se ve contaminada por la superposicién de los elementos del tejido que estén fuera de {oc0, tanto por encima como por debajo del plano enfocado; la imagen enfocada se deteriora a causa de las estructuras superpuestas borrosas o no enfocadas. Con el microscopio confocal estas limitaciones han sido superadas, ya que es un instrumento que permite realizar cortes épticos finos a muestras de tejidos mas 0 menos gruesos y realizar reconstrucciones en tres dimensiones a partir de cortes sefiados. Fue inventado en el afio 1955 por el cientifico estadounidense Marvin Minsky (116) al estudiar neuronas. Su mecanismo, basado en el micrascopio de fluorescencia hace posible la oblencién de imagenes de la arquilectura tridimensional de células y tejdos. Los detalles de la éptica del micrascoplo confocal son complejos y complementado por métodos electrénicos y de computacién, este instrumento permite enfocar tinicamente un plano determinado del espécimen, eliminando la luz (fluorescencia) procedente de las regiones que no estan en el plano de enfoque (fig. 6-25). Figura 6-25.- Comparacién entre dos micrografias de una célula en mitosis, contrastada con un doble marcaje fluorescent, tanto para los eromosomas (verde) y la actina (rojo). A la izquierda se aprecia una imagen donde la profundidad de campo abarca practicamente todo el espesor de la célula y en consecuencia la imagen se ve un tanto borrosa a pesar de estar enfocada. A ja derecha se observa tuna imagen obtenida con el principio confocal, que consiste en un corte éptico de la Célula donde se captura la fluorescencia que proviene exclusivamente de las, ‘muro sh vaatbseraraeniceaceaneo MONOWEDIepSsbt 72m estructuras que estén en el plano de enfoque, obteniéndose una imagen mas nitida, Este microscopio tiene mucho éxito en el mundo cientifco gracias a la alta calidad de las imagenes que proporciona a partir de especimenes preparados con las técnicas de laboratorio habituales para la microscopia de fluorescencia y por supuesto, al creciente nimero de aplicaciones, 6.7.1.-Ventajas del roscopio confocal + Uso de la fluorescencia (epistuorescencia). + Enfoca un solo plano del espécimen + Elimina la informacién proveniente de otros planos no enfocados del espécimen. + Obtencién de cortes épticos seriados a partir de muestras con cierto grosor 0 cuyo corte fino se dificulta, + Gracias a programas de computacién, se combinan los cortes épticos seriados y a partir de ellos se reconstruye en tres dimensiones la estructura observada, 6.7.2.-Principio de la microscopia confocal El microscopio confocal aftade el principio de luminar el espécimen punto por punto y olimina la luz proveniente de los planos no enfocados. Para ello se necesita una fuente de luz muy potenta, asi como también un fitro con un agujero que se coloca en el trayecto del rayo de luz (118) (figs. 6-26, 6-27). Minsky lo logré con una ampara de arco de zirconio, pero en los microscopios modernos se emplea un rayo laser, cuya longitud de onda puede estar disponible en un amplio rango de frecuencias. stchgatretunicorcomenMONOWEDIapt 7 Sense agujera confocal cespojo dicroico detector objetivo espécimen Figura 626.Esquema que muestra de manera simplificada el principio del microscopio confocal y el trayecto de la luz. El rayo laser (luz azul) es firado por un agujero y un espejo dicroico; luego es enfocado mediante un lente objetivo sobre el espécimen y estimula la fluorescencia presente en el mismo (luz verde). La fluorescencia es recolectada por el objetivo y dirigida al espejo dicroico que la refleja y dirige hacia un detector. Un segundo filtro con agujero se coloca frente al detector y sélo deja pasar la luz proveniente del plano de enfoque (linea continua), La fluorescencia fuera de foco de las zonas que estén por encima y por debajo del soraradialasehtcbgalretunicorcomenMONOWEDIapt 7m enfocado ~ desenfocado plano de enfoque (en lineas discontinuas) no pasa por el agujero y por lo tanto no formara parte de la imagen. La luz coherente del rayo laser es dirigida por espejos hacia el espécimen (el cual hha sido previamente tratado mediante marcadores fluorescentes) iluminéndolo punto por punto y de manera seriada; la luorescencia resultante es medida también punto por punto. Para obtener la informacién completa, el rayo laser debe ser desplazade por todo el espécimen (en los planos x, y,z) y este proceso es lo que se conoce como escaneo o barrido, Para reconstruir las imagenes a partir de los datos ‘obtenidos, se emplean programas de computacién adecuados (119). 6.7.3.-Configuracién del microscopio confocal Los microscopios confocal mademos son instrumentos altamente sofisticados y sus elementos principales son * La fuente de luz: Generaimente emplea una fuente de luz muy poderosa (laser 0 lampara de arco). Se pueden utlizar sistemas de rayos laser mull-frecuencia (en el Tango ultravioleta, luz visible e infra-oja) adaptados a los tipos de marcadores fluorescentes empleados para el contraste de los elementos celulares, Se han desarrollado dos técnicas, la de escaneo con un solo rayo (laser) y el escaneo con miitiples rayos. La primera es la mas popular y emplea un par de espejos ontrolados por computadora para escanear el espécimen. La técnica mult-rayos utliza una lampara de arco y el escaneo se realiza gracias a un disco rotatorio (disco de Nipkow) conformado por micro-lentes y micro-agujeros, Esta dltima {técnica de lluminacién disminuye el dafio a los especimenes © incrementa la deteccion (119). + Sistema éptico: El sistema dptico de los microscopios esté basado en los Principios fundamentales que se mantienen inalterados, sin embargo estén Complementados con los avances en éptica modemna y la tecnologia electrénica, + Filtros de interferencia: Incluyen espejos dicromaticos o dieroicos, barreras con agujaro de diametro variable y diversas fitros de excitacién (para Seleccionar la longitud de onda de excitacién del fluorocramo). + Detectores: Son fotodetectores muy sensibles a la fluorescencia emitida, Para los microscopios con miltiples rayos generalmente se usan cémaras CCD (charge coupled device). stchgatretunizoxcowenMONOWEDIantE 7 + Computadora: Configurada con los requisitos suficientes de memoria y procesador, tarjetas de video de alta resolucién, complementadas con software de Captura, andlisis y procesamiento de imagenes, asi como también de impresoras de muy alta calidad (fig. 6-28) Figura 6-27-Micrografias comparativas entre las técnicas de fluorescencia con iluminacién convencional o de campo amplio (serie superior, a, o, e) y la iluminacién fen microscopia confocal (serie inferior b, d, 1). Nétese en la serie superior la cantidad de seal (fluorescencia) que esta fuera de foco y la contrastante nitidez de las imagenes de la serie inferior en las cuales sélo se obtiene exclusivamente la informacién del plano de enfoque. Las muestras de la izquierda (hipotdlamo de ratén) y centro (musculo liso de rata) fueron marcadas con diversos luorocromos. (dobies y triples marcajes). Las imagenes de la derecha corresponden a un grano de poten do girasol el cual es autofluorascento, renaie de cain Foe aan 2. stchgatretunicorcomenMONOWEDIapt 7 0 Monee Figura 6-28.-Modelo de microscopio confocal. tonne eons ons hn Frtesy tS caer cen 5 6.7.4.-Cortes épticos y reconstruccién 3D Con el microscopic confocal es posible obtener una imagen de un plano

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