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Revista Internacional de
Ciencias Moleculares

Artículo

Caracterización radiobiológica de caninos

Líneas celulares de melanoma maligno con diferentes
tipos de radiación ionizante y evaluación de eficacia con
Agentes citotóxicos
Hiroto Yoshikawa 1 , Shigeaki Sunada2, Hirokazu Hirakawa 3
, akira fujimori 3
,
4 y Takamitsu A. Kato 4,5,*
Suad Elmegerhi 4,5, Del Leary
1
Departamento de Ciencias Clínicas, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Estatal de Carolina del Norte, Raleigh,
NC 27606, EE. UU.; hyoshik@ncsu.edu Departamento de Genética Molecular, Instituto de Investigación Médica,
2
Universidad Médica y Dental de Tokio, Tokio 113-8510, Japón; sunada.mgen@mri.tmd.ac.jp Departamento de Ciencias
Médicas Básicas para Daños por Radiación, Instituto Nacional de Ciencias Radiológicas, Chiba 263-8555, Japón;
3
hirakawa.hirokazu@qst.go.jp (HH); fujimori.akira@qst.go.jp (AF)

4
Departamento de Ciencias de la Salud Ambiental y Radiológica, Universidad Estatal de Colorado, Fort Collins, CO
80523, EE. UU.; hanoyara@rams.colostate.edu (SE); Del.Leary@colostate.edu (DL)
5 Programa de Biología Molecular Celular, Universidad Estatal de Colorado, Fort Collins, CO 80523, EE .
UU . * Correspondencia: tkato@rams.colostate.edu; Teléfono: +1-970-491-1881

Recibido: 1 de febrero de 2019; Aceptado: 12 de febrero de 2019; Publicado: 15 febrero 2019

Resumen: El melanoma maligno canino (MMC) es un cáncer local y sistémicamente agresivo que
comparte muchas características biológicas y clínicas con el melanoma mucoso humano. Se han utilizado
protocolos de radiación hipofraccionada para tratar la CMM, pero se sabe poco sobre su biología de radiación.
Este estudio piloto está diseñado para investigar la respuesta de las líneas celulares de CMM a diversas
radiaciones ionizantes y agentes citotóxicos para comprender mejor este cáncer canino. Se evaluaron cuatro
líneas celulares de CMM mediante un ensayo de supervivencia clonogénica en condiciones aeróbicas e hipóxicas
y se calcularon parámetros como la proporción alfa beta (ÿ/ÿ) , la proporción de aumento de oxígeno (OER) y la
efectividad biológica relativa (RBE) después de 137Cs, 6 megavoltaje ( MV) fotones o irradiación de iones de
carbono. También se evaluó la eficacia de seis agentes citotóxicos (cisplatino, camptotecina, mitomicina C,
bleomicina, metanosulfonato de metilo y etopósido) . En condiciones aeróbicas con fotones de 6 MV, la relación ÿ/
ÿ de las cuatro líneas celulares osciló entre 0,3 y >100, lo que indica una amplia variación de la sensibilidad celular.
La proporción aumentó en condiciones hipóxicas en comparación con las condiciones aeróbicas y esto fue más
dramático en los tratamientos con fotones de 137Cs y 6 MV. La OER de carbono fue inferior a 137Cs en D10 en 3
de las 4 líneas celulares. Los valores de RBE generalmente aumentaron con el aumento de LET. Diferentes líneas
celulares mostraron sensibilidad/resistencia a diferentes agentes citotóxicos. Este estudio reveló que la CMM tiene
un amplio rango de radiosensibilidad y que la hipoxia puede reducirla, lo que indica que los protocolos
hipofraccionados ampliamente utilizados pueden no ser óptimos para todos los pacientes con CMM. Varios
agentes citotóxicos que nunca se han evaluado clínicamente pueden mejorar el resultado del tratamiento.

Palabras clave: melanoma maligno canino; radiación ionizante; fotón; ion de carbono; hipoxia tumoral

1. Introducción

El melanoma maligno canino (CMM) es un tumor oral y cutáneo común en perros, y recientemente los CMM
se han considerado como un modelo animal grande para los melanomas mucosos humanos [1]. Estudios previos
revelaron varios factores pronósticos para el resultado clínico luego de intervenciones de tratamiento tales como

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como la ubicación del tumor dentro de la boca, el tamaño del tumor y la integridad del margen histopatológico [2,3].
CMM es altamente invasivo localmente y tiene una alta tendencia a propagarse regional y sistémicamente, lo que
produce tiempos de supervivencia significativamente más cortos [4]. Numerosos estudios no han logrado desarrollar un
régimen de tratamiento local y sistémico más efectivo para mejorar los tiempos de supervivencia [2], y actualmente la
escisión quirúrgica con terapia adyuvante local y/o sistémica se considera el estándar de atención. La radioterapia es un
tratamiento locorregional de uso común para las CMM [3,5–8]. En la radioterapia veterinaria se han utilizado diferentes
protocolos de radioterapia. En un estudio previamente informado que evaluó los resultados clínicos después de diferentes
protocolos de radioterapia para tratar la CMM, no se encontró una ventaja significativa en el resultado del tratamiento en
perros que fueron tratados con un protocolo fraccionado en comparación con aquellos que fueron tratados con un
protocolo hipofraccionado. [7]. Este informe puede ser parte de la razón por la cual los protocolos de radiación
hipofraccionada con una gran dosis por fracción se usan más comúnmente para tratar la CMM canina [8–10]. Otras
razones pueden incluir que el protocolo de radiación hipofraccionada generalmente es bien tolerado por los pacientes
caninos y en la oncología radioterápica veterinaria, los pacientes deben estar bajo anestesia general o sedación para
inmovilizarlos, por lo que tener menos sesiones de tratamiento es más práctico y conveniente. Sin embargo, no se puede
lograr una respuesta completa en todos los casos clínicos y, de hecho, el gran volumen del tumor fue parte de un factor
pronóstico conjunto en el estudio mencionado.
La biología de fondo de esta variación en el resultado del tratamiento no ha sido bien estudiada. Los parámetros que
ayudan a comprender la radiobiología de una célula incluyen la relación alfa beta, la fracción de supervivencia (SF) a
una dosis de radiación específica (es decir, SF a 2 Gy; SF2) y la dosis de radiación que resulta en una tasa de
supervivencia celular específica (es decir, 10% de supervivencia ; D10). Conocer esos parámetros puede ayudar a
comprender mejor la radiobiología de CMM y crear un protocolo de radioterapia más efectivo.
Hay varios tipos diferentes de radiación ionizante que se utilizan actualmente para tratar pacientes humanos y
veterinarios con cáncer, aunque el más común es la radiación de haz de fotones de megavoltaje administrada con
aceleradores lineales. Sin embargo, más recientemente, en las últimas décadas, se han construido instalaciones de
radiación de iones pesados con fines clínicos y de investigación, equipadas con la capacidad de acelerar partículas más
pesadas, como protones, e iones pesados, como núcleos de carbono y hierro. Los haces de iones pesados tienen una
característica física única que se llama Pico de Bragg, donde la dosis aumenta rápidamente y localmente en lo profundo
del tejido. La profundidad se puede controlar y está determinada por la energía inicial del ion y este pico también se
puede extender para cubrir un área amplia mediante la entrega de un rango de energías, conocido como el pico de
Bragg extendido (SOBP). Es importante destacar que, a medida que el ion se ralentiza, la radiación depositada puede
ser muy densa al final de la SOBP, lo que aumenta el nivel de transferencia de energía lineal (LET) y, potencialmente, la
eficacia biológica relativa (RBE). Al colocar el pico de Bragg extendido (SOBP) en la lesión objetivo, se puede administrar
una dosis muy alta a la lesión objetivo sin afectar los tejidos distales y minimizando los tejidos proximales, ya que los
iones tienen poca interacción antes del pico de Bragg. Además, los haces de iones pesados, como los iones de carbono
y hierro, crean picos de Bragg muy prominentes y son más eficientes para dañar las células y dependen menos del nivel
de oxígeno del microambiente tisular a diferencia de los haces de fotones [11]. Debido a esas ventajas biológicas y
físicas, los haces de iones pesados se utilizan en la investigación biológica y en el tratamiento del cáncer humano [12–
14], aunque la disponibilidad es limitada.

Dado que la CMM es una enfermedad altamente metastásica y muchos pacientes clínicos finalmente desarrollan
diseminación sistémica tal como metástasis pulmonar, también se han usado fármacos quimioterapéuticos para tratar las CMM.
El carboplatino y los antiinflamatorios no esteroideos, especialmente el piroxicam, son los dos fármacos más utilizados
en las prácticas veterinarias. Su eficacia para el control tumoral local, así como para prevenir el desarrollo de progresión
sistémica, se ha estudiado clínicamente con conclusiones contradictorias [7,8,15,16]. Otros fármacos quimioterapéuticos
que se evaluaron previamente para tratar las CMM incluyen fosfato de toceranib, temozolomida, doxorrubicina,
dacarbazina, lomustina, ciclofosfamida, cisplatino y mitoxantrona, pero su eficacia sigue siendo controvertida [9,10,15,17–
19]. Para los melanomas humanos de diferente origen , se han evaluado in vitro y / o
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en vivo. Según el conocimiento de los autores, no hay estudios que hayan investigado la
eficacia de esos agentes contra las CMM en oncología veterinaria en el momento de escribir
este artículo.
Este estudio piloto fue diseñado para caracterizar cuatro líneas celulares de CMM
establecidas mediante el uso de diferentes tipos de radiaciones ionizantes y agentes
citotóxicos para profundizar nuestra comprensión sobre las CMM y, finalmente, ayudar a la
creación de un régimen de tratamiento multimodal más efectivo.

2. Resultados

2.1 Curvas de supervivencia

Las curvas de supervivencia celular generadas a partir de los ensayos de formación de
colonias para cada línea celular y cada calidad de haz se muestran en la Figura 1. La
supervivencia celular fue más alta en todas las líneas celulares para el tratamiento con LET
más bajo, 137Cs, seguido de fotones de 6MV y luego de carbono. Todas las líneas celulares
se volvieron más resistentes a la radiación en condiciones hipóxicas, en comparación con las
condiciones aeróbicas. Esto fue más notable por las calidades de haz de LET inferiores
(137Cs y 6MV). El cambio en la radiosensibilidad entre las condiciones aeróbicas e hipóxicas
fue mínimo con la irradiación de iones de carbono en comparación con los haces de fotones
de 137Cs y 6MV.
Estos hallazgos pueden cuantificarse mediante D10, D1, SF2 y SF8, todos interpolados a
partir de la curva de supervivencia. (Cuadro 1 y Figura 2). Cuando se comparó entre líneas
celulares, CML-10C2 fue la línea celular más radiosensible, mientras que otras tres líneas
celulares fueron más radiorresistentes en un grado similar. La diferencia en la
radiosensibilidad entre líneas celulares fue subjetivamente más prominente con 137Cs en
comparación con el carbono.
Para 137Cs, los valores RBE en condiciones hipóxicas no estaban disponibles en las líneas
celulares Jones y 17CM98 en D1, ya que los valores D1 no se podían calcular a partir de los
gráficos del modelo cuadrático lineal.

Figura 1. Resultados del ensayo de supervivencia clonogénico realizado con 137Cs, fotón 6MV e iones de carbono
radiación en condiciones aeróbicas (negras) e hipóxicas (rojas). Curvas de supervivencia celular lineales-cuadráticas
fueron ajustados y utilizados para calcular parámetros radiobiológicos. Las barras de error indican el error estándar de la
medias de al menos tres experimentos independientes.
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Tabla 1. Resumen de SF2 y SF8, fracción de supervivencia a 2 y 8 Gy de irradiación de cuatro líneas

celulares de melanoma maligno canino irradiadas con 137Cs, fotones de 6MV o radiación de iones de
carbono en condiciones aeróbicas e hipóxicas. Los valores son la media de al menos tres experimentos
independientes.

Figura 2. Resumen de D10 y D1, que son dosis de radiación para destruir el 90 % y el 99 % de las
células, respectivamente, utilizando cuatro líneas celulares de melanoma maligno canino irradiadas
con 137Cs, fotones de 6MV o radiación de iones de carbono en condiciones aeróbicas (negras) e
hipóxicas. (rojo) condiciones. Las barras de error indican el error estándar de las medias de al menos
tres experimentos independientes.

2.2. Relación ALFA/BETA

La relación A/B se calculó para condiciones aeróbicas e hipóxicas. Hubo variaciones notables en las
proporciones A/B al comparar diferentes líneas celulares, así como entre condiciones aeróbicas e hipóxicas
dentro de cada línea celular (Tabla 2). En general, la relación A/ aumentó en condiciones hipóxicas en
comparación con las condiciones aeróbicas y este cambio fue más drástico en los tratamientos con fotones
de 137Cs y 6MV.
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Tabla 2. Resumen de la proporción de cuatro líneas celulares de melanoma maligno canino

irradiadas con 137 Cs, fotones de 6MV o radiación de iones de carbono en condiciones
aeróbicas e hipóxicas. Los valores presentados aquí provienen de la interpolación de curvas
de supervivencia celular cuadráticas lineales utilizando valores medios de al menos tres
experimentos independientes.

2.3. Relación de mejora de oxígeno

La relación media de aumento de oxígeno varió de 1,3 a 1,9 para el fotón de 6MV, de 1,3 a 2,0
para el carbono y de 0,7 a 2,3 para el 137Cs (Figura 3) en D10 y D1

Figura 3. Resumen de la proporción media de aumento de oxígeno de cuatro líneas celulares de melanoma
maligno canino irradiadas con 137Cs (blanco), fotón 6MV (azul) o radiación de iones de carbono (negro). Las
barras de error indican el error estándar de las medias de al menos tres experimentos independientes

2.4. Eficacia biológica relativa

Los valores de RBE obtenidos en condiciones aeróbicas e hipóxicas variaron de 1,2 a 2,3 y de 1,5 a
3,7 para fotones de 6MV, y de 1,9 a 3,0 y de 1,7 a 4,0 para iones de carbono, respectivamente (Figura
4). En general, los valores de RBE aumentaron a medida que aumentó LET.

2.5. Prueba de sensibilidad a drogas

Los resultados de las pruebas de sensibilidad a fármacos con cisplatino, bleomicina, camptotecina,
etopósido, metanosulfonato de metilo y mitomicina C se resumen en la Figura 5. En general, la fracción
de supervivencia disminuyó de manera dependiente de la dosis en todas las líneas celulares y con
todos los tratamientos. CML-10C2 mostró una mayor sensibilidad a todos los fármacos, lo que la
convierte en la línea celular más quimiosensible entre las cuatro evaluadas
líneas celulares. Las células 17CM98 mostraron una mayor sensibilidad a la bleomicina y la mitomicina
C. CML-6M mostró una resistencia relativa a todos los fármacos probados. Jones mostró una mayor
sensibilidad a la bleomicina y al etopósido.
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Mol. ciencia 2019, 20, x PARA REVISIÓN POR PARES 6 de 13

Figura 4. Resumen de la eficacia biológica relativa de cuatro líneas celulares de melanoma maligno canino
irradiadas con 137Cs, fotones de 6MV o radiación de iones de carbono, en condiciones aeróbicas
(negras) e hipóxicas (rojas). Los valores presentados aquí son la media de al menos tres experimentos
independientes.

Figura 5. Resumen de las pruebas de sensibilidad a fármacos de cuatro líneas celulares de melanoma maligno canino
con diferentes agentes citotóxicos. Las barras de error indican el error estándar de las medias de al menos tres
experimentos independientes.
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3. Discusión

La radioterapia de haz externo se usa comúnmente para tratar las CMM, especialmente en casos no quirúrgicos
o después de una escisión quirúrgica incompleta. Históricamente, esos tumores se han tratado con protocolos
hipofraccionados con una dosis mayor por fracción [5–7,31]. Aunque el protocolo hipofraccionado es clínicamente
más conveniente y ampliamente utilizado (es decir, menos episodios anestésicos, menos costoso en comparación
con los protocolos fraccionados convencionales), ningún estudio ha evaluado la radiobiología de las CMM, por lo
tanto, la racionalidad de elegir el protocolo hipofraccionado no está clara. Nuestro estudio actual indicó que las líneas
celulares de CMM que evaluamos tienen una amplia gama de la relación alfa-beta, que es uno de los indicadores de
la sensibilidad a la radiación de las células analizadas. Con el fotón 6MV, que es la radiación ionizante ampliamente
utilizada en la radioterapia clínica veterinaria, la relación alfa beta osciló entre menos de 1 y más de 100. Esto puede
indicar que muchos pacientes experimentaron un fracaso del tratamiento local después de que la radioterapia
hipofraccionada recibió un protocolo subóptimo [3] . Un estudio futuro para correlacionar el patrón/tasa de fracaso
del tratamiento local con el régimen de radioterapia o los índices biológicos (es decir, el índice mitótico) puede
ayudarnos a elegir el protocolo de radioterapia más efectivo para cada paciente.
Curiosamente, la relación alfa beta aumentó en la mayoría de las líneas celulares CMM evaluadas en condiciones
hipóxicas. Este hallazgo indica que la eficacia de la radiación ionizante para eliminar las células de CMM puede verse
influida de forma espectacular por el nivel de oxígeno en el tejido tumoral. Los OER en el estudio actual fueron
generalmente más altos con 137Cs que con fotones de 6MV y los OER con iones de carbono tienden a ser los más
bajos. Esto sugiere que la radioterapia con iones de carbono es más eficaz para matar las células cancerosas de CMM
independientemente del nivel de oxígeno en el tumor. El RBE se utiliza para comparar el efecto biológico de la radiación
de prueba (muerte clonogénica) con el de una radiación de referencia (137Cs). Como era de esperar, tanto la radiación
de fotones de 6MV como la de iones de carbono mostraron un RBE superior a 1 (137Cs) en condiciones aeróbicas e hipóxicas.
El ion de carbono mostró un RBE más alto que el fotón de 6MV. En base a esos hallazgos, la radioterapia con iones
de carbono es más eficiente para llevar a las células CMM a la muerte clonogénica y su eficacia depende del estado
de oxigenación del tumor. Esto también puede indicar que la radioterapia con iones de carbono puede permitir a los
oncólogos radioterápicos veterinarios tratar perros con CMM con incluso menos fraccionamientos para lograr el
mismo o mejor control del tumor locorregional, gracias a su mayor eficacia biológica. Se requiere un estudio clínico
futuro para validar este hallazgo in vivo.
Los agentes citotóxicos se usan comúnmente junto con medicamentos antiinflamatorios no esteroideos, cirugía,
radioterapia o una combinación de estos. El cisplatino, la bleomicina, la camptotecina, el etopósido, el metanosulfonato
de metilo y la mitomicina C se evaluaron de manera in vivo e in vitro para evaluar su eficacia clínica potencial para
tratar diversas neoplasias malignas caninas [15,31–41]. Entre ellos, el cisplatino es el agente citotóxico más estudiado
para tratar las CMM. Sin embargo, el resultado del tratamiento clínico de las CMM aún no es muy bueno debido al
fracaso del tratamiento local y/o a la diseminación sistémica, lo que hace que el papel del tratamiento sistémico con
los agentes citotóxicos actualmente utilizados sea anecdótico. El estudio actual evaluó la eficacia de los agentes
citotóxicos contra las líneas celulares de CMM con la esperanza de identificar un nuevo agente candidato para una
mayor investigación clínica. Como se mostró en estudios anteriores, nuestros datos actuales respaldaron su actividad
citotóxica. La bleomicina, la camptotecina, el etopósido y la mitomicina C nunca se han evaluado por su beneficio
clínico contra las CMM. Nuestro estudio sugiere que esos agentes citotóxicos, especialmente la camptotecina
(inhibidor de la topoisomerasa I) y el etopósido (inhibidor de la topoisomerasa II), pueden valer la pena evaluar su
beneficio clínico. El estudio actual puede servir como punto de partida para una futura evaluación in vivo de esos
agentes citotóxicos para los melanomas malignos caninos. La evaluación de los efectos de combinación entre la
irradiación de iones de carbono y el inhibidor de topoisomerasa puede ser un estudio importante para las líneas celulares de CMM.

4. Materiales y Métodos

4.1. Líneas celulares

El Dr. Douglas Thamm (Universidad Estatal de Colorado, Fort Collins, CO, EE. UU.) suministró generosamente
cuatro líneas celulares de melanoma oral canino (Jones, 17CM98, CML-6M y CML-10C2) y se cultivaron en Medio
Mínimo Esencial (MEM/EBSS , Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.)
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suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (FBS: Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.), vitaminas MEM al 1 %,
aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, penicilina, estreptomicina y Fungizone. Esas líneas celulares se caracterizaron previamente
en la literatura publicada anteriormente [42-44].

4.2. Tratamiento hipóxico

La condición hipóxica se creó usando un generador de CO2 absorbente de oxígeno disponible

comercialmente colocado en un contenedor dedicado siguiendo el protocolo del fabricante (Anaeropack
Kenki 5%, Mitsubishi Gas Chemical Company, INC., Tokio, Japón). Luego se controló el nivel de oxígeno
colocando un indicador dentro del contenedor (Anaero-indicator, Mitsubishi Gas Chemical Company, INC.) [45].

4.3. Irradiación

Irradiación de fotones: la irradiación de fotones se realizó a temperatura ambiente mediante el uso de un

acelerador lineal clínico (Varian Trilogy, Varian Medical Systems, Inc., Palo Alto, CA, EE. UU.) ubicado en el Centro de
Cáncer Animal Flint de la Universidad Estatal de Colorado. Solo se utilizaron haces de fotones de 6MV (6 Gy/min) de
un tamaño de campo único de 30 × 30 cm. La dosis fue uniforme y plana dentro del área donde se colocaron las
células. Las células se asentaron en el fondo de los matraces con 2 mm de medio encima y 10 cm de agua sólida para
una retrodispersión adecuada. Esto permitió que la dosis se corrigiera a una dosis de profundidad porcentual de 2 mm
a una distancia de la fuente a la superficie de 100 cm, que son parámetros de configuración comunes para la calibración
absoluta y, por lo tanto, la dosis podría calcularse fácilmente a partir de tablas de dispersión estándar.
Irradiación de iones de carbono: Los experimentos de irradiación de iones de carbono se llevaron a cabo en
el Instituto Nacional de Ciencias Radiológicas (NIRS) en Chiba, Japón. Los detalles relacionados con las
características del haz de la radiación de carbono, los procedimientos de irradiación biológica y la dosimetría se
han descrito en otra parte [46–48]. Brevemente, los iones de carbono se aceleraron a 290 MeV/nucleón de energía
inicial y se distribuyeron con un filtro de cresta creando una SOBP de más de 6 cm. El cultivo celular en monocapa
se irradió en el centro (50 keV/µm de LET promedio) del SOBP a una distancia de 119 mm de la entrada (1 Gy/min)
[49].
Irradiación de 137Cs : la irradiación de rayos gamma se realizó a temperatura ambiente utilizando un
irradiador de rayos gamma de 137Cs ubicado en la Universidad Estatal de Colorado (JL Shepherd Model Mark
I-68 nominal 6000Ci, JL Shepherd, Carlsbad, CA, EE. UU.) con 2,5 Gy/min. de tasa de dosis.

4.4. Ensayo de formación de colonias

Las células tripsinizadas se sembraron en placas P-60 para obtener aproximadamente 100 colonias por placa.
Sobre la base de la eficacia de las placas y la radiosensibilidad de cada línea celular, se varió el número de células en placas
(200-200000 células). Las células sembradas se trataron en condiciones aeróbicas normales o en condiciones hipóxicas
antes de la irradiación. Después de la irradiación, las células se cultivaron durante un período de incubación de 7 días para
formar colonias, sin cambiar el medio de cultivo celular, las células se lavaron en cloruro de sodio al 0,9 % y se fijaron en
etanol al 100 %, luego se tiñeron con colorante cristal violeta al 0,1 % (Sigma-Aldrich) . Por último, con análisis microscópico,
las colonias que contenían más de 50 células se puntuaron como supervivientes. La fracción de supervivencia celular se
determinó como la relación entre la colonia de células irradiadas y la de células no irradiadas.

4.5. Estudio de sensibilidad a fármacos

Las células tripsinizadas se sembraron en placas P-60 para obtener aproximadamente 100 colonias por placa.
Sobre la base de la eficacia de la siembra y la sensibilidad al fármaco de cada línea celular, se varió el número de células
cultivadas (200-20000 células). Una vez que las células se unieron, las células se trataron con varias dosis de cisplatino
( entrecruzador de ADN), bleomicina (inductor de ruptura de doble cadena de ADN), etopósido (inhibidor de la topoisomerasa
II), camptotecina (inhibidor de la topoisomerasa I) y mitomicina C (agente alquilante, inhibidor de radicales libres). formación,
reticulador de ADN), metanosulfonato de metilo (agente alquilante) durante todo el período de formación de colonias durante
7 días. Después de un período de incubación de 7 días, las células se lavaron en cloruro de sodio al 0,9 % y se fijaron en
etanol al 100 %, luego se tiñeron con colorante cristal violeta al 0,1 % (Sigma) para el análisis de formación de colonias.
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4.6. Análisis de datos

Todos los experimentos se llevaron a cabo al menos tres veces de forma independiente. El manejo de datos y los
análisis se realizaron utilizando un software disponible comercialmente (GraphPad Prism versión 7.00, GraphPad Software,
La Jolla, CA, EE. UU., www.graphpad.com).
Las curvas de supervivencia se generaron aplicando un modelo de regresión cuadrática lineal. La fracción de
supervivencia (SF) se obtuvo interpolando las curvas de supervivencia cuadráticas lineales. Además del estándar
SF2 (fracción de supervivencia a 2 Gy), también se registró e informó la fracción de supervivencia a 8 Gy, una dosis
comúnmente utilizada en radioterapia clínica para melanomas malignos orales caninos (SF8). La relación ÿ/ÿ se
calculó mediante la siguiente ecuación:

donde D es una dosis de radiación (Gy).

A partir de estas curvas de regresión, los valores D10 y D1 se obtuvieron mediante el software GraphPad Prism.
La relación de aumento de oxígeno (OER) se calculó para cada tipo de radiación mediante la siguiente
ecuación:

OER = Dosis (Gy) en condiciones hipóxicas/Dosis (Gy) en condiciones aeróbicas (2)

La eficacia biológica relativa (RBE) se calculó mediante la siguiente ecuación:

RBE = Dosis (Gy)(137Cs)/Dosis (Gy) (fotón de 6MV o carbono) (3)

Para OER y RBE, tanto D10 como D1 (dosis de radiación que mata el 90 % y el 99 % de las células,
respectivamente) se usaron como punto final.

5. Conclusiones

En conclusión, el estudio actual mostró que las CMM pueden no ser uniformemente sensibles a la radioterapia con
un tamaño de fracción grande y su radiosensibilidad puede verse afectada drásticamente por el estado de oxigenación
local. La radioterapia de alta LET, como la de iones de carbono, puede tener un beneficio biológico y clínico de una
destrucción celular más eficaz, lo que permite a los oncólogos radiólogos veterinarios tratar con un fraccionamiento aún
menor. Además, algunos agentes citotóxicos adicionales mostraron un beneficio clínico potencial, que puede valer la pena
evaluar en un estudio clínico.

Contribuciones de los autores: Conceptualización, HY y TAK; metodología, HY; software, HY y TAK;

validación, HY, DL y TAK; análisis formal, TAK; investigación, HY, SS, HH, AF, SE, DL y TAK; curación
de datos, HY, SS, HH, AF, SE, DL y TAK; redacción—preparación del borrador original, HY y TAK;
redacción: revisión y edición, HY, AF, DL y TAK; visualización, HY y TAK; supervisión, AF y TAK;
adquisición de fondos, HY, AF y TAK
Financiamiento: Esta investigación fue parcialmente financiada por el fondo de puesta en marcha CVM de la Universidad Estatal de Carolina del Norte
(HY), el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón (MEXT) Subvenciones en ayuda para la investigación científica en áreas
innovadoras, número de subvención ( JP15K21745, AF) y el Dr. Akiko Ueno Radiobiology Research Fund (TAK).

Agradecimientos: Los autores agradecen a NIRS-HIMAC por el apoyo al experimento de radiación de iones de carbono.

Conflictos de interés: Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés.

abreviaturas

CMM Melanoma maligno canino

Relación de mejora de oxígeno OER
RBE Eficacia biológica relativa
SF fracción de supervivencia

SOBP Propagación del pico de Bragg

DEJAR Transferencia de energía lineal
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Referencias

1. Hernández, B.; Adissu, HA; Wei, BR; Michael, HT; Merlino, G.; Simpson, RM Melanoma canino de origen natural como modelo oncológico comparativo

predictivo para la mucosa humana y otros melanomas triples de tipo salvaje. En t. J. Mol. ciencia 2018, 19, 394. [Referencia cruzada] [PubMed]

2. Klein, MK Terapia multimodal para el cáncer de cabeza y cuello. Veterinario. clin. am del norte Pequeño Animado Practica 2003, 33, 615–628.
[Referencia cruzada]

3. Teón, AP; Rodríguez, C.; Madewell, BR Análisis de factores pronósticos y patrones de fracaso en perros con tumores orales malignos tratados con

irradiación de megavoltaje. Mermelada. Veterinario. Medicina. Asoc. 1997, 210, 778–784.

[PubMed]
4. Tuohy, JL; Selmic, LE; Worley, DR; Ehrhart, NP; Withrow, SJ Resultado después de la cirugía con intención curativa para el melanoma oral en perros:

70 casos (1998–2011). Mermelada. Veterinario. Medicina. Asoc. 2014, 245, 1266–1273. [Referencia cruzada]
[PubMed]
5. Bateman, KE; Catton, Pensilvania; Pennock, PW; Kruth, SA 0-7-21 radioterapia para el tratamiento de la enfermedad canina
melanoma bucal. J. Vet. Interno. Medicina. 1994, 8, 267–272. [Referencia cruzada] [PubMed]

6. Blackwood, L.; Dobson, JM Radioterapia de melanomas malignos orales en perros. Mermelada. Veterinario. Medicina. Asoc.
1996, 209, 98–102. [PubMed]

7. Proulx, DR; Ruslander, DM; Esquivar, RK; Hauck, ML; Williams, LE; Cuerno, B.; Precio, SG; Thrall, DE

Un análisis retrospectivo de 140 perros con melanoma oral tratados con radiación de haz externo. Veterinario. Radiol.
Ultrasonido. 2003, 44, 352–359. [Referencia cruzada] [PubMed]

8. Murphy, S.; Hayes, AM; Blackwood, L.; Maglennon, G.; Pattinson, H.; Sparkes, AH Melanoma maligno oral: el efecto de la radioterapia de fraccionamiento

grueso sola o con terapia adyuvante con carboplatino. Veterinario.

compensación oncol. 2005, 3, 222–229. [Referencia cruzada] [PubMed]

9. Boston, SE; Lu, X.; Culpa, WT; Montinaro, V.; Romanelli, G.; Dudley, RM; Liptak, JM; Mestrino, LA; Buracco, P. Eficacia de las terapias adyuvantes

sistémicas administradas a perros después de la escisión de melanomas malignos orales: 151 casos (2001–2012). Mermelada. Veterinario.
Medicina. Asoc. 2014, 245, 401–407. [Referencia cruzada] [PubMed]

10. Cancedda, S.; Rohrer Bley, C.; Aresu, L.; Dacasto, M.; Leona, VF; Pizzoni, S.; Gracis, M.; Marconato, L.

Eficacia y efectos secundarios de la radioterapia en comparación con la radioterapia y la temozolomida en el tratamiento

del melanoma maligno canino medible. Veterinario. compensación oncol. 2016, 14, e146–e157. [Referencia cruzada]
[PubMed]

11. Pasillo, E.; Giaccia, A. Transferencia de energía lineal y efectividad biológica relativa. En Radiobiología para el Radiólogo,

8ª ed.; Wolters Kluwer Health: Filadelfia, PA, EE. UU., 2018; págs. 101–110.

12. Hayashi, K.; Koto, M.; Demizu, Y.; Saitoh, JI; Suefuji, H.; Okimoto, T.; Oh no.; Shioyama, Y.; Takagi, R.; Ikawa, H.; et al. Un estudio multicéntrico

retrospectivo de la radioterapia de iones de carbono para el conducto auditivo externo y los carcinomas del oído medio. Cáncer Med. 2018, 8, 51–
57. [Referencia cruzada] [PubMed]

13. Takagi, M.; Demizu, Y.; Nagano, F.; Terashima, K.; Fujii, O.; Jin, D.; Mima, M.; Niwa, Y.; Katsui, K.; Suga, M.; et al. Resultados del tratamiento de la

terapia con iones de carbono o protones para el cordoma de la base del cráneo: un estudio retrospectivo.
radiar oncol. 2018, 13, 232. [Referencia cruzada] [PubMed]

14. Abe, T.; Oh no.; Koto, M.; Demizu, Y.; Suefuji, H.; Tsuji, H.; Okimoto, T.; Shioyama, Y.; Saitoh, JI; Shirai, K.; et al. Un estudio retrospectivo

multiinstitucional de radioterapia con iones de carbono para tumores malignos de células no escamosas de la nasofaringe: Subanálisis del estudio

1402 HN del Grupo de estudio de oncología radioterápica con iones de carbono de Japón . Cáncer Med. 2018, 7, 6077–6083. [Referencia cruzada]
[PubMed]

15. Boria, Pensilvania; Murry, DJ; Bennett, PF; Glickman, noroeste; Snyder, PW; Merkel, BL; Schlittler, DL; Mutsaers, AJ; Tomás, RM; Knapp, DW

Evaluación de cisplatino combinado con piroxicam para el tratamiento del melanoma maligno oral y el carcinoma de células escamosas oral en

perros. Mermelada. Veterinario. Medicina. Asoc.

2004, 224, 388–394. [Referencia cruzada] [PubMed]

16. Rassnick, KM; Ruslander, DM; Cotter, SM; Al-Sarraf, R.; Bruyette, DS; Gamblin, RM; Meleo, KA; Moore, AS Uso de carboplatino para el tratamiento de

perros con melanoma maligno: 27 casos (1989–2000). Mermelada.

Veterinario. Medicina. Asoc. 2001, 218, 1444–1448. [Referencia cruzada] [PubMed]

17. Wouda, RM; Hocker, SE; Higginbotham, ML Evaluación de la seguridad de la combinación de carboplatino y fosfato de toceranib (Palladia) en perros

con tumores: un estudio de búsqueda de dosis de fase I. Veterinario. compensación oncol. 2018, 16, E52–E60. [Referencia cruzada] [PubMed]
Machine Translated by Google

En t. J. Mol. ciencia 2019, 20, 841 11 de 12

18. Choisunirachon, N.; Jaroensong, T.; Yoshida, K.; Saeki, K.; Mochizuki, M.; Nishimura, R.; Sasaki, N.; Nakagawa, T.
Efectos de la ciclofosfamida en dosis bajas con piroxicam sobre la neovascularización tumoral en un modelo de ratón
con xenoinjerto de melanoma maligno oral canino. Veterinario. compensación oncol. 2015, 13, 424–432. [Referencia cruzada]
[PubMed]

19. Ogilvie, GK; Obradovich, JE; Elmslie, RE; Vail, DM; Moore, AS; Paja RC; Dickinson, K.; Cooper, MF; Withrow, SJ Eficacia de la
mitoxantrona contra diversas neoplasias en perros. Mermelada. Veterinario. Medicina. Asoc. 1991, 198, 1618–1621. [PubMed]

20. Cichorek, M. Muerte inducida por camptotecina de células de melanoma amelanótico y melanótico en diferentes fases
del ciclo celular. Neoplasma 2011, 58, 227–234. [Referencia cruzada] [PubMed]
21. Liu, XP; Zhou, ST; Li, XY; Chen, XC; Zhao, X.; Qian, ZY; Zhou, LN; Li, ZY; Wang, YM; Zhong, Q.; et al. Actividad antitumoral de la
camptotecina encapsulada en N-trimetilquitosano en un modelo de melanoma de ratón.
Exp. J. clin. Cáncer Res. 2010, 29, 76. [Referencia cruzada] [PubMed]
22. Loch-Neckel, G.; Nemen, D.; Puhl, AC; Fernández, D.; Stimamiglio, MA; Álvarez Silva, M.; Hangai, M.; Santos Silva, MC; Lemos-Senna,
E. Nanocápsulas sigilosas y no sigilosas que contienen camptotecina: actividad in vitro e in vivo en el melanoma B16-F10. J. Pharm.
Farmacol. 2007, 59, 1359–1364. [Referencia cruzada] [PubMed]
23. Dora, CL; Álvarez-Silva, M.; Trentin, AG; de Faria, TJ; Fernández, D.; da Costa, R.; Stimamiglio, M.; Lemos-Senna, E.
Evaluación de la actividad antimetastásica y la toxicidad sistémica de microesferas cargadas con camptotecina en
ratones inyectados con células de melanoma B16-F10. J. Pharm. Farmacia ciencia 2006, 9, 22–31. [PubMed]
24. Gottlieb, JA; Luce, JK Tratamiento del melanoma maligno con camptotecina (NSC-100880). Quimioterapia contra el cáncer . Rep. 1972,
56, 103–105. [PubMed]
25. Li, S.; Au, WW; Schmoyer, RL, Jr.; Hsu, TC Línea de base e intercambios cromáticos hermanos inducidos por mitomicina-C en un
melanoma y una línea celular de tumor de colon. Geneta del cáncer. Cytogenet. 1982, 6, 243–248. [Referencia cruzada]
26. Pedersen, JE; Barron, G. Radiación y quimioterapia concurrente para el tratamiento del tumor de pulmón de Lewis y el tumor de melanoma
B16 en ratones C57/BL. En t. J. Radiat. oncol. Biol. física 1984, 10, 1479–1482. [Referencia cruzada]
27. Creagan, ET; Edmonson, JH; Ahmann, DL; Chang, M. Estudio de fase II de mitomicina en diseminado
melanoma maligno. Cancer Treat Rep. 1985, 69, 1451–1452. [PubMed]
28. Nathanson, L.; Wittenberg, BK Estudio piloto de combinaciones de vinblastina y bleomicina en el tratamiento del melanoma metastásico.
Cancer Treat Rep. 1980, 64, 133–137. [PubMed]
29. Nathanson, L.; Kaufman, SD; Carey, RW Vinblastina, infusión, bleomicina y quimioterapia
con cis-diclorodiamina-platino en el melanoma metastásico. Cáncer 1981, 48, 1290–1294.
[Referencia cruzada]

30. Bajetta, E.; Buzzoni, R.; Viviani, S.; Vaglini, M.; Nava, M.; Bonadonna, G. Ensayo aleatorizado prospectivo en melanoma maligno avanzado
con cis-platino, vindesina y etopósido frente a cis-platino, vindesina y lomustina. Soy. J. Clin. oncol. 1985, 8, 401–405. [Referencia
cruzada]
31. Freeman, KP; Hahn, KA; Harris, FD; King, GK Tratamiento de perros con melanoma oral mediante radioterapia hipofraccionada y
quimioterapia basada en platino (1987–1997). J. Vet. Interno. Medicina. 2003, 17, 96–101.

32. Milevoj, N.; Tratar, UL; Nemec, A.; Brozic, A.; Znidar, K.; Sersa, G.; Cemázar, M.; Tozon, N. Una combinación de electroquimioterapia,
electrotransferencia de genes del plásmido que codifica la IL-12 canina y cirugía citorreductora en el tratamiento del melanoma maligno
oral canino. Res. Veterinario. ciencia 2018, 122, 40–49. [Referencia cruzada] [PubMed]
33. Batschinski, K.; Dervisis, N.; Kitchell, B.; Newman, R.; Erfourth, T. Combinación de quimioterapia con bleomicina y arabinósido de citosina
para el linfoma canino recidivante. Mermelada. Animación Hosp. Asoc. 2018, 54, 150–155.
[Referencia cruzada] [PubMed]

34 Han, Carolina del Sur; Kim, DG; Han, EH; Kim, YB; Hwang, CI; Kim, CY Estudio de toxicidad de un nuevo agente anticancerígeno de
camptotecina CKD-602 en perros: dosis intravenosa continua de 4 semanas mediante bomba de infusión y dosis intravenosa repetida
de 4 semanas. Reg. Toxicol. Farmacol. 2010, 58, 275–284. [Referencia cruzada] [PubMed]
35. Boye, P.; Serres, F.; Marescaux, L.; Hordeaux, J.; Bouchaert, E.; Gómez, B.; Tierny, D. Estudio de aumento de dosis para evaluar la
seguridad, la tolerabilidad y la eficacia de la administración intravenosa de fosfato de etopósido en 27 perros con linfoma multicéntrico.
PLoS ONE 2017, 12, e0177486. [Referencia cruzada] [PubMed]
36. Flory, AB; Rassnick, KM; Balkman, CE; Kiselow, MA; Autio, K.; Beaulieu, BB; Lewis, LD Biodisponibilidad oral de etopósido después de la
administración de una dosis única a perros portadores de tumores. Soy. J. Vet. Res. 2008, 69, 1316–1322. [Referencia cruzada]
[PubMed]
Machine Translated by Google

En t. J. Mol. ciencia 2019, 20, 841 12 de 12

37. Abbón, AH; Jones, DR; Maestría, AR; Stewart, JC; Fourez, L.; Knapp, DW Ensayo clínico de fase I y farmacocinética de mitomicina C intravesical
en perros con carcinoma de células de transición localizado de la vejiga urinaria. J. Vet. Interno. Medicina. 2010, 24, 1124–1130. [Referencia
cruzada] [PubMed]
38. Shapiro, W.; Kitchell, BE; Fossum, TW; Couto, CG; Theilen, G. Cisplatino para el tratamiento de células de transición
y carcinomas de células escamosas en perros. Mermelada. Veterinario. Medicina. Asoc. 1988, 193, 1530–1533.
39. Shapiro, W.; Fossum, TW; Kitchell, BE; Couto, CG; Theilen, GH Uso de cisplatino para el tratamiento del osteosarcoma apendicular en perros.
Mermelada. Veterinario. Medicina. Asoc. 1988, 192, 507–511.
40. Knapp, DW; Richardson, RC; Bonney, PL; Hahn, K. Terapia con cisplatino en 41 perros con tumores malignos.
J. Vet. Interno. Medicina. 1988, 2, 41–46. [Referencia cruzada]

41. Kitchell, BE; Marrón, DM; Suerte, EE; Maderas, LL; Orenberg, EK; Bloch, DA Implante intralesional para el tratamiento del melanoma maligno oral
primario en perros. Mermelada. Veterinario. Medicina. Asoc. 1994, 204, 229–236.
42. Maeda, J.; Frente, CE; Brent, California; Rosa, BJ; Thamm, DH; Kato, TA Radiosensibilidad intrínseca y caracterización celular de 27 líneas
celulares de cáncer canino. PLoS ONE 2016, 11, e0156689. [Referencia cruzada] [PubMed]
43. Wolfe, LG; Oliver, JL; Smith, BB; Toivio-Kinnucan, MA; Poderes, RD; Brawner, WR; Henderson, RA; Hankes, GH Caracterización biológica de

líneas celulares de melanoma canino. Soy. J. Vet. Res. 1987, 48, 1642–1648.
[PubMed]

44. Aves, JS; Dailey, DD; Gustafson, DL; Thamm, DH; Duval, DL El panel de líneas celulares tumorales caninas del Flint Animal Cancer Center
(FACC): un recurso para el descubrimiento de fármacos veterinarios, la oncología comparativa y la medicina traslacional. Veterinario.
compensación oncol. 2017, 15, 481–492. [Referencia cruzada] [PubMed]
45. Carretillero, IM; Su, C.; Haskins, JS; Salinas, VA; Sunada, S.; Yu, H.; Uesaka, M.; Hirakawa, H.; Chen, DJ; Fujimori, A.; et al. Células de ovario de
hámster chino deficientes en reparación de ADN que exhiben sensibilidad diferencial a la radiación de partículas cargadas en condiciones
aeróbicas e hipóxicas. En t. J. Mol. ciencia 2018, 19, 2228. [Referencia cruzada]
[PubMed]

46. Suzuki, M.; Kase, Y.; Yamaguchi, H.; Kanai, T.; Ando, K. Eficacia biológica relativa para el efecto de destrucción celular en varias líneas celulares
humanas irradiadas con un acelerador médico de iones pesados en haces de iones de carbono de Chiba (HIMAC). En t. J. Radiat. oncol. Biol.
física 2000, 48, 241–250. [Referencia cruzada]
47. Kamada, T.; Tsujii, H.; Tsuji, H.; Yanagi, T.; Mizoe, JE; Miyamoto, T.; Kato, H.; Yamada, S.; Morita, S.; Yoshikawa, K.; et al. Eficacia y seguridad
de la radioterapia con iones de carbono en sarcomas de huesos y tejidos blandos.
J. Clin. oncol. 2002, 20, 4466–4471. [Referencia cruzada] [PubMed]

48. Carretillero, IM; Campana, JJ; Maeda, J.; Genet, MD; Romero, A.; Fujii, Y.; Fujimori, A.; Kitamuta, H.; Kamada, T.; Chen, DJ; et al. Efectos de las
mutaciones del sitio de fosforilación dirigidas en el dominio de fosforilación de ADN-PKcs en la sensibilidad a la radiación LET alta y baja.
oncol. Letón. 2015, 9, 1621–1627. [Referencia cruzada]
49. Mc Millan, DD; Maeda, J.; Campana, JJ; Genet, MD; Phoonswadi, G.; Mann, KA; Kraft, SL; Kitamura, H.; Fujimori, A.; Yoshii, Y.; et al. Validación

de 64Cu-ATSM que daña el ADN a través de la emisión de electrones Auger de alta LET. J. Radiat. Res. 2015, 56, 784–791. [Referencia
cruzada]

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