ALCANCES TECNOLOGICOS ANO 2, No. 1: 43-49. 2004 CONTROL BIOLOGICO DE Rosellinia bunodes EN HELECHO HOJA DE CUERO (Rumohra adiantiformis), CON EL HONGO Trichoderma lignorum Bemardo Mora’, José Arturo Solérzano’ RESUMEN Una formulacién comercial del hongo (Trichoderma lignorum) (Mycobac® 50 WP) se evalud en el cultivo de Helecho Hoja de Cuero, en Follajes El Espino, Sabanilla de Alajuela, entre sotiembre del 2002 y abril del 2003, para medir su eficacia como controlador bioldgi co del hongo Roseliinia bunodes. El producto biolégico formulado cémercialmente se ev: {ud en las dosis de 40 y 20 gramos de producto comercial an cinco metros cuadrados (cin 0 repeticiones de un metro cuadrado cada una). Ainbas’dosis 'sé aplicaron de forma Curativa y preventiva en el cuitivo, con ef objetivo de realizar un control practico del patége- no, El estudio se tealiz6 de setiembre a abril con el fin de observar el desarrollo de la en- fermedad durante los meses lluviosos (12 aplicaciones) y los meses de menor precipitacion (seis aplicaciones). En el Laboratorio de Proteccién de Cultivos del INTA se determiné me- diante la técnica de Unidades Formadoras de Colonias (UFC).(Uribe 1999, Vélez y Mon- toya 1997), una buena recuperacién del hongo Trichoderma lignorum en la dosis de 40 gra- mos en clitco metros cuadtados, aplicados de forma preventiva sobre plantas de Rumorha adiantitormis atectadas por Rosalinia bunodes, ejerciendo el hongo Trichoderma biocontrol de esta enfermedad (Freeman y Sztejnberg 1997). Los fesuliados dal estudio determinaron que el Mycobao® 50 WP fue eficiente para controlar al hongo Foseliinia bunodes, en el cul- tivo de Helecho Hoja de Cuero, al cabo de seis meses, aplicado dé forma curativa 0 pre- ventiva, en las dosis de 40 y 20 gramos de la formulacion del hongo, EI cultivo de helecho tiene varias limita ciones agronémicas donde les plagas y las enfermedades de follaje y rizoma constituyen INTRODUCCION EI Helecho Hoja de Cuero Rumohra adiantiformis constituye una especie oma- mental de gran importancia econémica, que se cultiva de forma intensiva en las faldas de la Cordillera Volcénica Central, en alturas que oscilan entre los 900 y los 1.800 metros sobre el nivel del rar; las plantaciones estan distri buidas desde Juan Vifias en Cartago a San Ramon en Alajuela. La agroindustria de esta actividad genera gran cantidad de empleo, constituyendo un factor de desarrollo social y econémico muy importante, en las comunida- des donde $e encuentran establecidas las plantaciones un papel importante, causando grandes pér- didas en el rendimiento, ya qué el mercado internacional es bastante exigente en la cali- dad del producto, El hongo Aosellinia bunodes y R. pepo, producen en Helecho Hoja dé Cuero la puidri- cién del rizoma, que constituye una enferme- dad de importancia econémica, también muy conocida en el cultivo de café, cultivos rade- tables y otros frutales tropidales; donde A. necatrix = Demathophora necatrix es la de mayor importancia econémica por su amplio * Instituto Nacional de Innovacién y Transferencia en Tecnologia Agropecuara (NTA), Costa Rica.ALCANCES TECNOLOGICOS, ANNO 2, NUMERO 1 grupo de hospederos (Szteinborg 1980). En el cultivo de Helecho, el patégeno ha sido re- portado pero atin no se conoce una forma efi clente de manejo de la enfermedad. Ei mi croorganismo se caracteriza por producir un marchitamiento gradual de las frondas, en cualquier etapa do desarrollo de {a planta. ‘Cuando la fronda es afectada en la fase de violin, su crecimiento se afecta de forma drdstica. La fronda se marchita en el lapso de tres a cuatro semanas, su raquis adquiere una coloracién café y se dobla a la altura de la primera pinnula, Las pinnulas adquieren un color amarilento, y algunas personas lo de- nominan como “Vena amarilla’: Cuando el ii zoma es afectado en la fase adulta y la fron: da esta totalmente abierta, se hace presente la caracteristica vena amarilla de forma noto- tia (Mora 2003). ee EI hongo puede avanzar en los:rizomas de uno a dos mottos por afio, razén por la cual algunos productores realizan cortes en las camas de helecho para aislar su avance. Se considera un habitante que puede sobre- vivir de forma saprofitica atacando gran can- tidad de hospederos. Se reporta en cultivos como café, papa, cacao, omamentales y al- gunos Arboles forestales. Practicas cultura- les y control quimico del hongo sf se concen al presente, pero el contro! del hongo es muy limitado (Freeman y Szteinberg 1997). Los Funguicidas Cloraneb, Penta cloro nitroben- ceno (PCNB), asi como la fumigacién con Bromuro de metilo, se reportan como produc- tos eficaces para evitar el.avance del hongo. EI control biol6gico del hongo en el cultivo de Helecho de Cuero no se ha investigado en Costa Rica. Las pérdidas econémicas causa- das por esta enfermedad no se han cuantifi cado, pero en los parches afectados la pér da es del 100 %. ; ; El objetivo general det prasento experi mento fue evaluar una formulacién del hongo Trichoderma lignorum, Mycobac® 50.WP pa- ra medir su eficacia biolégica sobre el hongo Rosellinia bunodes en el cultivo de Helecho Hoja de Cuero. 44 MATERIALES Y METODOS El presente trabajo se realiz6 en la Em- ptesa Follajes El Espino localizada en Saba- nilla de Alajuela, a una altura de 1.425 msnm. Los suelos son de origen volednico del Orden ‘Andisol. La zona presenta dos épocas clima- ticas bien definidas. Una lluviosa, de fines de abril a principios de diciembre, caracterizada por una alta humedad relativa; la otra so ex- tiende de mediados de diciembre a fines de abril, la cual es de minima o escasa precipita- cién y de menor humedad relativa. La tempe- ratura minima promedio 6m ambas épocas del afio es inferior a 20 ®C; lo cual ayuda en gran medida a la colonizacién del hongo; ademas de una Humedad Relativa apropiada para la infeccién del patégeno. El Cuadro 1 presenta los datos de clima durante la época ‘on que se realizé el.experimento. El experimento se realiz6 durante los me- ses de setiembre del 2002 a abril del 2003,en los que se valoré el desarrollo del hongo en dos 6pocas climaticas' bien’ definidas. EI producto formulado Mycobac® 50 WP se evalué con un disefio de Bloques Completos al Azar (BCA), con cinco repeticiones. La parcela total estuvo constituida por una area de 1,0 m x 1,0 m. Los bloques para la evaluacion de los di- ferentes tratamientos, se establecieron en ‘reas de baja, mediana y alta presién de ind- culo, para mantener la homogeneidad do los bloques. Los tratamientos que se evaluaron fueron: ‘Tratamiento 1. 40 gramos de Mycobac® 50 WP para 20 litros de agua en.cinco me- {ros cuadrados de parcela util, aplicados de forma preventiva. En la parcela se eliminaron todos los rizomas y posteriormente se sem- braron de nuevo con helecho sano. Tratamiento 2. 40 gramos de Mycobac® 50 WP para 20 itros de agua en cinco metros cuadrados de parcela util, aplicados de forma curativa. En la parcela se dejé el helecho con | |MORAY SOLORZANO: Control Bioldgica de Rosella bunodes en helecho ho de cuero con ol hongo Tichoderma ignonim Cuadro 1. Datos do procipitacién, temperatura y humedad relativa, ten los meses de setiembre del 2002 a abril del 2008. Fo llajes et Espino, Sabanila, Aajuela, Precipitacion Temperatura Humedad relativa| Mes Minima Maxima Minima Maxima Soliembre 4674168245 GBS 8D. Octubre 4880 183-279 68S 800 Noviembre 178,7-—= 15S 284 55,1. 79.3 Diciemore 141 15928488718 Enero 16 185287476 B19 Febrero 10 160-281 393.2 Marzo 731 15974 45.0 6B.0 7 Abril 423 © 148 «= 282 48,8" 68,0 Tolal/meda 1.2735 160 27.0529 71,5 * 1 objetivo de’ racuperario do la infeccion cau- sada por el hongo. Tratamiento 3. 20 gramos de Mycobac® 50 WP para 20 litros de agua en cinco metros cuadrados de parcela util, aplicados de forma preventiva. (igual forma que en 1) Tratamiento 4. 20 gramos de Mycobac® ‘50 WP para 20 litros de agua en cinco metros cuadrados de parcela til, aplicados de forma curativa (igual forma que en 2). Tratamiento 5. Testigo transplantado. En la parcela util se eliminaron los rizomas y pos- teriormente se sembraron de nuevo con hele- cho sano, Tratamiento 6, Testigo Absoluto. La par- cela titil no recibié tratamiento. Al Mycobac® 50 WP se le adicion6, Kem- kol® 99 EC como activador para mejorar su eficacia. Las dosis a emplear y el orden de mezcla se realizaron siempre de la siguiente manera A. 1 litro de agua + 5 cc de Kemkol® 99 EC + buena agitacién + 40 gramos de My- cobac® 50 WP + buena agitacién, La pre- mezcla se agregé a los restantes 19 litros de ‘agua para la aplicacién de los dos primeros tratamientos (100 %). 45 B. 1 litro de agua + 5 co'de Kemkol® 99 EC + buena agitacién + 20 gramos de Myco- bac® 50 WP + buena agitacién, luego esta premezcla se adiciond a los restantes 19 l- {ros de agua para la aplicacion de los dos se- gundos tratamientos (50 %). Se realizaron doce aplicaciones de Myco- bac® 50 WP en él periodo de septiombre a diciembre (época tluviosa): En la época de verano se hicieron seis aplicaciones de enero a marzo (dos mensuales). La intensidad de la enfermedad‘se determind por medio del conteo del total de plantas y plantas enfermas por parcela. El analisis de los resultados se realizé por medio de un andlisis de variacién (ANDEVA) y una prueba de rango miltiple de soparacién de medias (Duncan P < 0,05). Andlisis de Laboratorio: del hongo Recuperacion En el Laboratorio del Departamento de Proteccién de Cultivos del INTA se determiné las poblaciones del hongo aplicado, mediante cultivo en medio de Agar Nutritivo® en el cual se realizaron las evaluaciones y cuantifica- cién de las Unidades Formadoras de Colonia UFC del hongo (Loynachan 1985). La técnica de determinacién de la eficacia biolégica in vitro de los fungicidas segun i {ALCANCES TECNOLOGICOS, AN}O2, NUMERO 1" Unidades Formadoras de Colonia (UFC), se realizé segun metodologia descrita por Loy- nachan, 1985 asi como por Parkison y Cole- ‘man (1991), la cual se emplea para enumerar las poblaciones de microorganismos en dife- tentes productos (Vélez ef al. 1997). Este protocolo también es utiizado para cuantificar la calidad de los bioplaguoidas (Vélez y Montoya 1998, Lopez ef al. 1995). Consiste en la realizacién de dilliciones seria- das 1/10 (10 mi del hongo en 90 mi de agua destiiada esteril) hasta la dilucién de 1x10"7. Las diluciones se agitan a 80 rpm (Ebertiach model 60 CY) durante 30 minutos y del sobre- natante se toman alfcuotas de 0,1ml que se siembran en medio de cultivo especifico para el desarrollo de las colonias de! hongo, des- puds se dejan-en incubacién (Napco incuba- tor mode! 303) a 23 °C por 96 a 120 horas. En general la composicién del medio depen- de del microorganismo que se fequiera iden- tificar y enumerar (Parkison y Coleman 1991, Uribe 1999). Se cuenta el numero de unida- des de colonias formadas (UFC) que aparace en las placas de petri. En la Figura 1 se des- cribe la metodologia empleada., i El término UFC se refiere al: momento, en el que un microorganismo. entra en contacto con el medio de cultivo y empieza a multipli- + F ‘Tratamiemtos" carse formando una colonia de microorganis- mos que pueden verse y contarse. Por lo tanto, so determina que cada una de estas colonias es un microorganismo en fa muestra inicial. Como en algunos de los casos una sola colonia puede formarse por mas de un microorganismo, y se adopts el término de unidades formadoras de colonia, La preparacién de los medios de cultivo 0 realiz6 en modio MARTIN®, y se adiciona- ron diluciones seriadas de las muestras to- madas de campo. Se colocé una alicuota de 0,1 ml en cada placa petri con medio de cult vo con las dosis correspondientes de cada producto evaluado. Los tratamientos se com- pararon con un testigo absoluto el cual con- sistié tanto del testigo del ensayo como un testigo de los bordes (testigo limite) de la plantacién cercano al cultivo comercial, don- de no se marearon parcelas. Todos los trata- mientos se colocaron en una incubadora a tuna temperatura de 23°C, la cual es la éptima para el desarrollo de las colonias del hongo. Los resultados se evaluaron a los cinco dias después de inoculadas las placas petri. Se cuantificé Unicamente las poblaciones del hongo de interés (Trichoderma lignorum). El mismo se contirmé mediante la observacién ‘en microscopio de luz. 90 mt eral Seok Incubaciéna! CAC Figura 1: Metgdologia para ta evaluacion de microorgenismos en el contro biol6gicd de plagas (Adaptado de Loynachan 1985 y Vélez y Montoya 1998), 1 | |MORAY SOLORZANO: Control bioligico de seria bunodas en helech hoa de cuero con el ongo Tichoderma hgnonum RESULTADOS Y DISCUSION En el campo se evalué la incidencia de la enfermedad en los diferentes tratamientos, ademas se determind mediante andlisis de laboratorio la colonizacién del medio donde se cultiva el helecho hoja de cuero. Los re sultados se muestran en dos etapas: labora- torio y campo. EI comportamiento de los patogenos de suolo-es impredecible, maxime si el microor- ganismo presenta un periodo de incubacién prolongado. Es posible que Rosellinia spp. sea un pa- tégeno que en el cultivo de helecho su perio- do de incubacién sea de uno a dos meses. En el Cuadro 2, se presentan los datos de in- cidencia de la enfermedad obtenidos de se tiembre del 2002 a abril del 2003. Cuadro 2. Tratamiontos y promedios de incidencia de R. bunodes en el cultivo de helacho hoja de custo on dos fechas de evaluacion Hda, Alsacia, Folajas el Espino, Sabanila, Alajuela. 2003 Tratamiento Primera Segunda fevaluacién evaivacion 204202 10-04.03 Preventivo 40g(P 100) Oa 26a Curatvo 40.9 (C 100) 10,2 ab 80a Preventive 20g (P $0) Oa 48a Curative 209(C 50) 7.2 ab 19,2 @ Teatigo de ansplanto 0a toa a Testigo Absoluto 15> 2580 Medias con igual lera en la misma columna, no son es tadisticamente diferentes de acuerdo a la Prueba de Flangos Mlliples de Duncan (P < 0,06) (SAS 1998). En la primera evaluacién fos dos Trata~ mientos Preventives (40 y 20 g) y el Testigo de Transpiante, no presentaron incidencia de marchites del patégeno, a pesar de haber iranscurrido mas de tres meses de realizada la primera aplicacién del controlador biolégi- co. La explicacién se debe a que los tres tra- a7 tamientos fueron sembrados con helecho sa- no, obtenido de areas libres del patégeno. E1 hongo presente en el suelo, debid cau- sar la infeccion e iniciar un prolongado perio- do de incubacién, desarrollando los primeros sintomas de fa enfermedad. La primera apli- cacién de Mycobac® 50 WP, se realiz6 el 10 de setiembre del 2002 y la primera evaluacion 80 hizo ol 23 de diciembre (104 dias des- pués). Es importante mencionar que entre los 55 y 60 dias después de la primera aplicacién se empezé a notat un amarillamiento alrede- dor de la vena de la pinnula, lo cual se consi- dera un sintoma inicial de la enfermedad. Es probable que el period de incubacién del hongo en el cultivo de Helecho, sea cerca de dos meses, maxime si se considera que en cultivos lefiosos dura varios meses @ incluso afios, para que inicien los primeros sintomas, dependiendo del nivel de indculo en el suelo Los dos tratamientos aplicados en forma curativa con Mycobac® 50 WP a las dosis de 40 y 20 g PC (producto comercial) tuvieron promedios muy similares. El tratamiento del Testigo Absoluto mostré la mayor ineidencia con definida diferencia estadistica con los tra- tamientos preventivos y el Testigo de Trans- plante. En la evaluacién realizada en abril ‘se aprecia que los.dos tratamientos-preventivos con Mycobac® 50.WP, mostraron niveles re- lativamente bajos de infeccién y que el trata- miento Testigo de Transplante presento un ni- vel de incidencia de la enfermedad de 10,4. Estos tres tratamientos en la primera evalua- cién no tuvieron presencia de la enfermedad debido al largo periodo de incubacién del hongo como se explicé anteriormente. El tra- tamiento Testigo Absoluto se diferencié esta- disticamente de los demés tratamientos, ex- hibiendo la mayor incidencia de la ‘enfermedad. También es importante sefialar la tendencia que existe en él tratamiento pre- ventivo de superar al tratamiento curativo. Sin ‘embargo, desde el punto de vista practico el tratamiento curativo es el tratamiento ideal y econémico en una plantacién afectada porALCANCES TECNOLOGICOS, AfIO 2, NUMERO 1 parches de la enfermedad. Ademas, ambos fratamientos en un periodo de ocho a diez meses se llegan a uniformizar, debido a que el tratamiento transplantado se comporta de la misma manera que el no transplantado en ‘cuanto al crecimiento fenolégico del cuttivo. En el laboratorio se determind tas unida- des formadoras de colonia del hongo aplica- do Trichoderma sp. (Cuadro 3). En el mismo se observa que los tratamientos que mejor se adaptaron son Preventive 40 g (P100) y Cu- rativo 40 g (C100) tienen una recuperacién muy buena del hongo Trichoderma sp. Los tratamientos testigo absoluto y testigo limite ho mostraron unidades formadoras de colo- ria del hongo aplicado. En el Cuadro anterior se observa que en los tratamientos testigo absoluto y testigo li- mite no hubo presencia de! hongo Trichoder ma spp. Esta conciusién nos permite visual zar el efecto supresivo de Rosellinia bunodes que se ejercié sobre las parcelas aplicadas por el hongo Trichoderma lignorum. En el ca- 80 de los tratamientos Curativo' 100 y 50 no se produjo esporulacién a los cinco dias de evaluacién (Figura 2), por lo tanto este trala- miento no se adapté de la forma en que si lo hizo el tratamiento P10 en el cual se deter- minaron altas poblaciones del hongo esporu- lado (conidias), esta situacién permite una mayor reproduccién en campo del controla- dor biolégico aplicado. El tratamiento Preven- tivo P50 no mostré poblaciones del hongo Tr- choderma, por lo que su dosis aplicada dista de la requerida para ejercer un buen control de la enfermedad en campo (Figura 2). oa Figura 2: Unidades formadoras de colonia de hongos segin tratamiontos aplicados (1X108) en medio de cutiva Marin, Folajes el Espino, Sabanila. Aajuela. 2003, Cuadro 3. Cracimianto en medio de culiivo Martin del hongo Trichoderma spp. segun trata- ‘mianta y dilucién, Laboratorio de Proteccién de Cullvos. INTA, 2003. Dilueione ‘Tratamlento/ dias 1X08 _1K10" 1X105 1X10 Observaciones 1.Proventve 100 +100 48 2.Prevenivo50 0 o 0 3, Testigo Limite 0 0 0 4.Qurativo 100-350 40S 5.CurativoSO Cont!’ «2 G.TestigoAbsouto 0» 0 0 13 Diluciones § y 6 muy osporuladas 0 Pocos cortaminantes 0 Contaminantes, Aspergilus 0 No esporuiado, sola micetio 3 No esporuiado varios contaminantos 0 _Pocos contaminantes : j \MORAY SOLORZANO: Control biclgico de Rosella bunades en heleco hoja de cuero con el hongo Tichoden lignonam CONCLUSIONES Del presente estudio se concluye que el controlador biolégico Mycobac® 50 WP, cuyo ingrediente activo es el hongo Trichoderma lignorum tue efectivo para controlar a Rosell nia bunodes, en helecho, en su forma preven- tiva 0 curativa, en las dosis de 40 y 20 gra- mos, distribuidos en cinco metros cuadrados, en un volumen de 20 litros de agua aplicados con regadera, Ademas, no se observaron otros efectos colaterales dafiinos al cultivo que pudiera causar el controlador biolégico sobre el cultivo. 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