Universidad de Concepcin

Facultad de Ciencias Naturales y Oceanogrficas

Ingeniera en Biotecnologa Marina Y Acuicultura

Laboratorio N8:
Osmorregulacin.

Integrantes:

Docentes: Fecha de entrega:

Jonathan Alarcn Guantecura Alonso Daz Alarcn Marcela Espinoza Nancabil Javier Garrido Veloso Alejandra Llanos Rivera Eduardo Tarifeo Silva 14 de Junio de 2011

Fisiologa de organismos acuticos martes 7 de junio del 2011

Introduccin.
El agua es indispensable para que exista la vida, dado que todos los procesos vitales se realizan en medios acuosos. La capacidad de sobrevivir en un medio osmtico desfavorable se ha desarrollado en los animales ms evolucionados gracias a la adquisicin de un medio interno estable con una determinada concentracin de agua y sales que amortigua los efectos del medio externo. (Decir que el medio interno es estable, quiere decir que la cantidad de ingresos es igual que los de salidas). El mecanismo que se encarga de este equilibrio en todos los animales acuticos, en este caso, corresponde al proceso de Osmorregulacin. Los mecanismos osmorreguladores se refieren a la regulacin de la presin osmtica y de las concentraciones inicas del compartimento extracelular del cuerpo del animal. (Relacin medio intracelularextracelular, medio extracelular-medio externo). La regulacin de la concentracin de sales de animales en el medio externo e interno se consigue en los vertebrados de diferentes formas, segn el medio en el que vivan. Los peces de agua dulce viven en un medio hipotnico, por lo que el agua tiende a entrar en su cuerpo de forma continua por smosis y a travs de las branquias. Por ello, tienen que eliminar el exceso de agua, para lo cual los riones reabsorben las sales pero muy poca agua, con lo que la orina est muy diluida y es abundante. Por el contrario, los peces de agua salada estn expuestos a una prdida continua de agua por smosis, ya que el medio en el que viven es hipertnico. (Eckert, 1989) Las concentraciones de los solutos individuales de los fluidos corporales pueden diferir sustancialmente de las del medio, aunque permanezcan isosmticos con l. Es aqu donde aparecen los conceptos de animales osmoconformistas y osmorreguladores. Los primeros se adaptan a la del medio (permanecen en condicin isosmtica con l), y los segundos mantienen una osmolaridad interna diferente de la del medio externo. Los animales orsmorreguladores dependen de la regulacin osmtica del lquido extracelular para mantener el volumen de sus clulas. Dependiendo de la condicin de osmoticidad del plasma, los procesos de difusin del agua y del intercambio de compuestos organicos e inorgnicos tienen diferentes direcciones entre el medio interno (plasma o liquidos intersticiales) y el medio externo (agua). En el laboratorio se analiz los comportamientos adquiridos y el nivel de tolerancia (a nivel de individuo) que el pez mosquito (Gambusia affinis) obtuvo al ser sometido a medios con distintas concentraciones de salinidad. As como tambin el cambio sufrido a nivel celular por la trucha arcoris (Oncorhynchus mykiss) al llegar al estado de

Hemlisis.

Objetivos. Observar los efectos del cambio agudo de salinidad ambiental en animales acuticos, a nivel de individuo y a nivel celular.

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Materiales y mtodos.
Para determinar la capacidad de osmoregulacin de trucha arcoris (Oncorhynchus mykiss) y el pez mosquito (Gambusia affinis) se prepararon a partir de una muestra de agua de mar con salinidad de 33,5 psu diluciones con una concentracin de 33,5 (muestras sin diluir), 30 psu, 25 psu, 20 psu, 15 psu, 10 psu y 5 psu. Estas diluciones se realizaron mezclando agua de mar con agua dulce hasta obtener las concentraciones mencionadas anteriormente por medio de un conductivimetro (instrumento que mide de forma indirecta la salinidad del agua por medio de la conductividad adems de la temperatura de esta) Paralelamente se prepar una solucin hipersalina a partir de agua de mar agregando 40 gramos aproximadamente de sal de agua de mar artificial obteniendo una dilucin de 64 psu la cual se determin a travs de un refractmetro (instrumento que utiliza el ndice de refraccin para medir indirectamente la salinidad y que necesita solo una gota de muestra para determinar la concentracin de sustancias disueltas) 1. Efectos de osmoregulacin a nivel de individuo Se procedi a llenar 9 frascos de vidrio de un litro aproximadamente con las soluciones preparadas anteriormente y un control positivo (agua dulce, 0 psu) y se procedi a introducir un pez mosquito (Gambusia affinis) en cada uno de estos frascos anotando las alteraciones fisiolgicas que estos presentaban hasta alcanzar el shock osmtico, para su posterior regreso a un frasco de recuperacin con agua dulce y verificar si recuperaba su estado normal inicial. 2. Efecto a nivel celular Se prepar un set de tubos con 5 ml de agua con las salinidades de 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 y 33,5. A partir de una trucha arcoris (Oncorhynchus mykiss) en estado juvenil previamente anestesiada con benzocana (BZ-20) se extrajeron 0,2 ml de sangre con una jeringuilla plstica previamente heparinizada para evitar la coagulacin de la sangre. La extraccin de sangre se realiz desde la arteria caudal la cual se puede encontrar con mayor facilidad en la zona post anal bajo la lnea lateral del pez, insertando la jeringuilla de forma lateral hasta sentir la columna (ya que debajo de esta se encuentra la arteria caudal) y luego se realiz la succin de los 0,2 ml de sangre. De la sangre extrada se agregaron 2 gotas a cada tubo con las distintas salinidades, controlando el tiempo que tardaba en producirse la hemolisis de los eritrocitos (destruccin de la clula por ruptura de la membrana celular, debido a una presin osmtica intracelular exagerada)

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Adems se observ una gota de sangre bajo el microscopio con un aumento de 400 X 3. Efectos de una prolongada exposicin a distintas concentraciones de salinidad Se dejaron durante toda la noche los frasco que tenan salinidades de 33,5 (muestras sin diluir), 30 psu, 25 psu, 20 psu, 15 psu, 10 psu, 5 psu y 0 psu (Control positivo) con un pez mosquito (Gambusia affinis) en su interior y se observaron las capacidades de osmoregulacin de estos peces mediante la observacin de supervivencia o muerte que estos presentaban a una prolongada exposicin (16 horas aproximadamente) a distintas concentraciones de salinidad.

Resultados.
Actividad I: Evaluacin de la tolerancia del pez mosquito Gambusia affinis a la salinidad. En las siguientes tablas se observa el comportamiento que presenta el pez mosquito (G. affinis) al ser sometido a diferentes concentraciones de salinidad.

Tabla I: Se muestra el comportamiento que presenta el pez mosquito (G. affinis) con respecto al tiempo al ser sometido a la concentracin salina de 5 psu. Tiempo (min) 5 10 15 20 30 Comportamiento Disminucin de movimiento de aletas y permanece en el fondo. Aumenta el movimiento de aletas pectorales y caudal. Se mantiene la misma condicin anterior, permaneciendo en la superficie. Presenta movimiento de aletas pectorales y caudal acelerados. Se mantiene la misma condicin anterior

Tabla II: Se muestra el comportamiento que presenta el pez mosquito (G. affinis) con respecto al tiempo al ser sometido a la concentracin salina de 10 psu. Tiempo (min) 5 10 15 20 30 Comportamiento Nada rpidamente y aumenta el movimiento de las aletas caudales Permanece con movimiento agitado de aletas Nado normal por la columna de agua Nada de forma ascendente y descendente por el frasco Movimiento agitado de todas las aletas, nada

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ascendiendo y descendiendo rpidamente en el frasco llegando solo a la mitad del mismo. Tabla III: Se muestra el comportamiento que presenta el pez mosquito (G. affinis) con respecto al tiempo al ser sometido a la concentracin salina de 15 psu. Tiempo (min) 5 10 15 20 30 Comportamiento Nada normalmente en la parte media del frasco Nada de forma acelerada ascendiendo y descendiendo en la columna de agua Se mantiene la misma condicin anterior Nada de forma acelerada en el fondo del frasco Se mantiene la misma condicin anterior

Tabla IV: Se muestra el comportamiento que presenta el pez mosquito (G. affinis) con respecto al tiempo al ser sometido a la concentracin salina de 20 psu. Tiempo (min) 5 10 15 20 30 Comportamiento Nada en el fondo del frasco normalmente Permanece quieto en el fondo de la columna de agua Permanece quieto en el fondo de la columna de agua Permanece quieto en el fondo de la columna de agua Se mantiene la misma condicin anterior

Tabla V: Se muestra el comportamiento que presenta el pez mosquito (G. affinis) con respecto al tiempo al ser sometido a la concentracin de 25 psu. Tiempo (min) 5 10 15 20 30 Comportamiento Nada lentamente en la parte inferior de la columna de agua Permanece inmvil en el fondo de la columna de agua Nada normalmente en el fondo del frasco. Nado agitado en el fondo de la columna de agua Permanece en la parte inferior del tubo nadando con movimientos agitados de todas las aletas

Tabla VI: Se muestra el comportamiento que presenta el pez mosquito (G. affinis) con respecto al tiempo al ser sometido a la concentracin salina 30 psu.

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Tiempo (min) 5 10 15 20 30 -

Comportamiento Nada ascendiendo y descendiendo de manera normal en la columna de agua Permanece inmvil en el fondo de la columna de agua Nada normalmente en el fondo de la columna de agua Presenta movimientos agitados de las aletas, y nada ascendiendo y descendiendo hasta la mitad de frasco Flota subiendo hasta la mitad del frasco (se demora 10 segundos) y luego desciende con movimientos acelerados de las aletas

Tabla VII: Se muestra el comportamiento que presenta el pez mosquito (G. affinis) con respecto al tiempo al ser sometido a las concentracin salina de 33.5 psu. Tiempo (min) 5 10 15 20 30 Comportamiento Nada agitadamente en la parte inferior del frasco Permanece inmvil en el fondo del frasco Nado normal en el fondo de la columna de agua Presenta movimiento agitado de las aletas , y nada rpidamente en el fondo del frasco Movimiento y nado agitado de todas las aletas. Asciende y desciende flotando por la columna de agua. (se demora 10 segundos en subir, se mantiene 15 segundos y desciende nuevamente demorndose 10 segundos).

Debido a que ninguno de los peces alcanzo el tiempo de shock osmtico, se prepar una nueva solucin con una concentracin de 64 psu, en donde se evalo el comportamiento del pez mosquito (G. affinis) con respecto al tiempo al ser sometido a dicha salinidad. Esto se observa en la siguiente tabla. Tabla VII: Tiempo (min) 0 3 4 5 7 9 Comportamiento Nada lentamente en la superficie del frasco con una leve prdida de equilibrio Permanece inmvil en la superficie de la columna de agua Inicia movimiento de aletas caudales y disminuye el movimiento de aletas pectorales Permanece inmvil flotando en la superficie de la columna de agua Se mantiene la misma condicin anterior Se produce la perdida completa del equilibrio. (Tiempo de shock osmtico)

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Tabla VIII: Muestra la respuesta adaptiva que present el pez mosquito (G. affinis) al ser sometido a un periodo prolongado de salinidad (16 horas aprx.). Ejemplar 1 2 3 4 5 6 Concentracin 5 psu 10 psu 15 psu 25 psu 30 psu 33,5 psu Respuesta Adaptativa + + + -

** (+) Presenta adaptacin a la concentracin salina del agua, por lo tanto existe sobrevivencia del pez mosquito (G. affinis) a la salinidad. ** (-) No presenta adaptacin a la concentracin salina del agua, por lo tanto el pez mosquito (G. affinis) muere.

Actividad II: Efecto de osmorregulacin a nivel celular. Al agregar dos gotas de sangre de la trucha arcoris (Oncorhynchus mykiss) a tubos de ensayos con las distintas concentraciones salinas preparadas anteriormente, se observ que en el tubo de ensayo N1, correspondiente a aquel que solo posea agua dulce, ocurri la hemlisis de los eritrocitos al observar la transparencia de la suspensin de las clulas en el tubo. En el resto de los tubos no sucedi nada ya que solo se observ la turbidez que presentaron desde el inicio, al someter la sangre en las distintas concentraciones de salinidad.

A: 40x

Figura N 1: Se observan glbulos rojos en estado de hemlisis, obtenido en el tubo con 0 concentracin salina.

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Discusin.
Un posible rango de tolerancia de Gambusia affinis por ser un pez de agua dulce, parte de la cantidad de salinidad en agua dulce 50 mosm.L- 1 hasta los 20 PSU aproximadamente, debido a que hasta los 20 PSU los peces mosquitos (Gambusia affinis ) se mantuvieron vivos, a partir de 25 PSU hubo mortalidad y el control positivo (agua dulce) igual se mantuvo vivo. La explicacin del rango de tolerancia de Gambusia affinis se sustenta en que es un pez que es capaz de tolerar un amplio rango de variacin de salinidad que va desde los 50 mosm.L-1 (hill R, 1980) hasta los 20 PSU, por ende tiene caractersticas de un organismo eurihalino. Si el cambio de salinidad o de la concentracin de sales fuera gradual, un mismo individuo podra tolerar un poco ms debido a la produccin de orina diluida, dado que la reabsorcin de sales tiles a la sangre es a partir del ultrafiltrado de los tbulos del rin. Una explicacin de la mortalidad a partir de los 25 PSU, es que a esa cantidad de solutos disueltos en el agua, el pez no puede tomar del ambiente sales esenciales biolgicamente como lo son KCl, NaCl y CaCl2 a travs de los epitelios de transporte ubicado en las branquias debido a la prdida de esta sales a travs de la orina. La respuesta fisiolgica al aumento de la concentracin de sales, es de tipo adaptativa debido a que Gambusia affinis debe lidiar con la entrada de agua debido al gradiente osmtico produciendo orina diluida, adems del aumento de la actividad branquial debido a que es el principal rgano osmorregulador en peces. Los lquidos corporales de los peces marinos son hipotnicos con el agua de mar (Randall, 1998), al someterlos a un gradiente decreciente de salinidad, estos tendran tendencia a perder agua hacia el medio externo y a la vez beber agua salobre para reemplazar el volumen perdido de agua y eliminar las sales a travs del epitelio branquial, despus al someter al pez marino a salinidades bajas este tendra una tendencia a retener sales en el medio interno y a producir orina diluida para minimizar la perdida de sales biolgicamente importantes por esta va. La evaluacin a nivel celular del punto de hemolisis se realiz mediante observacin a ojo desnudo y a microscopio mediante un frotis, las observaciones al ojo desnudo evidenciaron el punto de hemlisis celular en eritrocitos de trucha arcoris, que se observ a una salinidad de 0 psu. En donde produce una desintegracin o ruptura de la membrana celular debido a que la concentracin de sales en el interior de la clula, es

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menor por lo tanto se produce un desplazamiento de sales hacia el medio externo producto a la diferencia de presiones parciales entre los compartimentos.

Conclusin
Los animales que mantienen una osmolaridad interna diferente de la del medio en la que se encuentran se denominan osmoreguladores, los animales que no controlan la condicin osmtica de sus lquidos corporales y se mantienen conforme a la osmolaridad del ambiente se denominan osmoconformistas. Los animales acuticos eurihalinos pueden tolerar un amplio rango se salinidad y los animales acuticos estenohalinos pueden tolerar un rango osmtico estrecho, los animales dulceacucolas son hiperosmoticos respecto al ambiente acutico y por ello hacen frente a dos tipos de problemas de Osmorregulacin, primero a una constante entrada de agua a sus cuerpos por el gradiente osmtico y segundo estn sometidos a una perdida continua de sus sales corporales al medio que los rodea que es de baja concentracin en sal. Los telesteos marinos se enfrentan a problemas osmticos opuestos, es decir han de evitar la prdida de agua y el exceso de sales, esto lo consiguen bebiendo agua de mar y luego eliminando las sales por diferentes mecanismos como son los riones y las branquias.

Referencias bibliogrficas:
Eckert, 1989. Fisiologa animal mecanismos y adaptaciones. Cuarta edicin. Editorial McGraw Hill Interamericana. 800 pp Fangel L., Hiriart M. y Fernndez F.1998. Biologa funcional de los animales. Segunda edicin. Editorial Roca. 584 pp Hill R.,1980 Fisiologia animal comprada: un enfoque ambiental. Segunda edicin, Editorial revert, 901 pp

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Randall D., Burggren W. & French K. 1998. Fisiologa Animal 4ta Edicin. McGraw-Hill-Interamericana de Espaa. 790 pp.