OBJETIVOS:

 Determinació n de la concentració n de quinina presente en una muestra comercial

de agua tó nica mediante las técnicas de está ndar externo y agregado patró n por
fluorescencia molecular.
 Analizar la influencia de la matriz para la cuantificació n de un analito.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
Calibración por estándar externo:
Se prepararon 6 soluciones patrones con diferentes concentraciones de quinina y se midió
su intensidad de fluorescencia a 487nm (longitud de onda donde la fluorescencia medida
era má xima), los valores obtenidos se pueden ver en la Tabla 1.
Tabla 1: Concentraciones e intensidad de fluorescencia a 457nm de las muestras patró n
preparadas.

Muestra Concentració n (ppm) Fluorescencia (ua)

A 12,5 216,4
B 25 383,75
C 30 462,49
D 37,5 806,48
E 50 10006,01
F 100 2882,62

Así, se obtuvo la siguiente curva de calibració n para la concentració n de quinina:

1400
f(x) = 12.9920473684211 x + 54.7579868421052
Intensidad de fluorescencia (ua)

1200

1000

800

600

400

200
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Concentración (ppm)

Figura 1: concentració n de quinina vs la intensidad de fluorescencia de la muestra.

RESULTADOS Y ANÁLISIS:
Como se puede ver en el Figura 1 la intensidad de la muestra en funció n de su
concentració n sigue una tendencia lineal, por lo que se podría utilizar esta curva de
calibració n para determinar la concentració n de quinina en la muestra incó gnita. Sin
embargo, la fluorescencia medida de la muestra incó gnita (luego de realizarle una dilució n
1:2 por agregado de 5 ml de muestra a 5 ml de H 2SO4 0,1M) fue de 137,65 ua, como dicho

1
valor no entra en el rango de linealidad de la curva, no se puede asegurar que la
concentració n de quinina y la intensidad de la fluorescencia obtenida se mantenga para
dichas fluorescencias.
Por esta razó n, se preparó otra solució n patró n, de 2,5ppm y se midió su intensidad de
fluorescencia, obteniéndose la siguiente curva de calibració n:

1400
f(x) = 13.2479994165694 x + 38.814307176196
Intensidad de fluorescencia (ua)

1200

1000

800

600

400

200

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Concentración (ppm)

Figura 2: concentració n de quinina vs la intensidad de fluorescencia.

En la figura 2 se puede ver que el valor obtenido para la fluorescencia de la muestra de 2,5
ppm se desvía levemente de la linealidad, lo cual se puede deber a un error del equipo
para la determinació n de la intensidad de fluorescencia a valores tan bajos de
concentració n. Igualmente, se empleó la siguiente curva para obtener una aproximació n
de la concentració n de la muestra, ya que en este caso la absorbancia medida para la
muestra incó gnita está incluida en el rango de linealidad:

I = 13,248 ∙ C + 38,814

De modo que empleando este método la muestra incó gnita diluida presentó una
concentració n de quinina de 7,46 ppm, y la muestra incó gnita una concentració n de
14,92ppm.
En este caso, en vez de realizar la medició n de otro patró n de menor concentració n
hubiese sido má s recomendable realizar una dilució n menor de la muestra (teniendo en
cuenta que la concentració n final de H2SO4 debería ser 0,05M para coincidir con la
concentració n de dicho ácido en los patrones realizados), ya que así se evitarían los
errores del equipo al medir fluorescencias pequeñ as y, ademá s, al realizarlo de la manera
anterior, la fluorescencia de la muestra incó gnita queda muy cercana al final de la curva
obtenida, donde hay un mayor error en la determinació n de la concentració n, y no en el
medio de esta, donde este error es mínimo.
Calibración por estándar interno:
Se midió la intensidad de fluorescencia de 2 ml de la muestra incó gnita y luego de 6
agregados sucesivos de 100 μl de la muestra patró n de quinina de 250 ppm.

2
Se graficó la intensidad de fluorescencia a 457nm ∙ V/V0 vs concentració n de quinina
agregada ∙ Vs/V0, donde V0 es el volumen inicial de la muestra, Vs es el volumen total de
quinina agregado y V es Vs + V0, obteniendose el siguiente grá fico:

1050
f(x) = 11.96584 x + 158.797285714286
(Intensidad de fluorescencia) ∙ V/V0

850

650

450

250

50
-25 -5 15 35 55 75
-150
(Concentración de quinina agregada)∙Vs/V0

Figura 3: la intensidad de fluorescencia a 457nm ∙ V/V0 vs concentració n de quinina

agregada ∙ Vs/V0.

RESULTADOS Y ANÁLISIS:
Al realizar la primera medició n de fluorescencia de la muestra incó gnita luego de la
dilució n 1:2, se obtuvo 173,34 ua, dicho valor difiere a la medició n de fluorescencia de la
misma muestra en el caso anterior. Luego de realizar todos los agregados de patró n se
volvió a medir 6 veces má s la intensidad de la fluorescencia de la muestra incó gnita
diluida, girando la cubeta entre cada medició n, para comprobar si el error en las
mediciones de la fluorescencia se debía a la cubeta, y esta dio una fluorescencia promedio
de 135,71 ua con un desvío está ndar de 2,13 ua, por lo que el error observado no se debía a
la cubeta.
En un primer lugar se pensó que el error se debía a la cubeta porque la ú ltima medició n
realizada de la intensidad para la calibració n por patró n interno dio 822,17 ua, pero luego,
al girar la cubeta y repetir la medició n dio 886,20 ua. Igualmente, esta medició n no se
realizó inmediatamente después de la primera, sino que dejando pasar un tiempo en el
medio, por lo que el cambio en las fluorescencias medidas se puede deber a un cambio en
la intensidad de emisió n del equipo con el paso del tiempo.
Dada estas condiciones, no es posible decidir qué valor de fluorescencia de la muestra
incó gnita utilizar, ya que el de aproximadamente 135,71 ua se obtuvo repetidas veces, por
lo que sería má s preciso, pero la medició n de este valor se realizó tiempo después de las
otras mediciones realizadas para la curva de patró n interno, entonces es posible que haya
cambiado la intensidad de la emisió n de la lámpara del equipo, y que el resto de las
mediciones sean a una intensidad diferente. Por esta razó n decidimos quedarnos con el
valor de fluorescencia de 176,34 ua.
La curva obtenida se realizó corrigiendo los volú menes finales de las muestras, por lo que
el grafico 3 es con todas en un mismo volumen final, 2ml. Así, la raíz de la ecuació n

3
obtenida sería la concentració n de quinina que se le debería sacar a la muestra inicial para
que esta no florezca, es decir, para que la concentració n de quinina sea cero. Entonces, el
mó dulo de la raíz de esta curva representa la concentració n de quinina en la muestra
incó gnita diluida, que da 13.24 ppm, por lo que la concentració n de la muestra incó gnita es
de 26.48 ppm.
CONCLUSIONES
El valor obtenido mediante la calibració n por patró n interno difiere considerablemente al
obtenido al realizar una curva de calibració n por patró n externo. Usualmente, esto
significa que la muestra presenta una interferencia multiplicativa producida por la matriz,
la cual se elimina al realizar la calibració n por patró n externo debido a que la matriz
cambia en una proporció n mucho menor, casi despreciable. Sin embargo, en nuestro caso
no es posible afirmar esto porque se observaron muchos errores en la medició n del
equipo, inclusive en la fluorescencia de la muestra incó gnita, por lo que la diferencia en la
concentració n obtenida se puede deber a estos y no a una interferencia de la matriz.
De este modo, los valores obtenidos no son ú tiles para realizar un análisis de la influencia
de la matriz para la determinació n de la quinina como así tampoco para la determinació n
de su concentració n puesto que carecen de confianza, ya que como se mencionó
anteriormente, las mediciones de la misma muestra medidas en lapsos de tiempos
diferentes daban resultados que diferían considerablemente.
Por lo tanto, los objetivos de la prá ctica no pudieron cumplirse en su totalidad debido a la
gran inestabilidad del equipo para realizar mediciones en periodos de tiempos largos, sin
embargo, se adquirieron los conocimientos bá sicos de fluorescencia molecular como así
también el protocolo de cuantificació n de analitos que presentan fluorescencia y la
confecció n de una curva patró n por está ndar interno.