rmentaciones | Tenaga def BIOPROSPECCION para encontrar y aislar microorganismos 0 biocata- lizadores con interés biotecnolégico son un campo conocido como bioprospeccién. La necesidad de compuestos nuevos y itiles en diferentes aspectos de la vida del ser humano esté creciendo aceleradamente. La resistencia bacteriana a antibiéticos, la Jas drogas para acompaifiar transplante de Srganos o para sustancias en el am- 4. Los procedimientos y técnicas aparicién de nuevos virus, tratamiento del céncer, son ejemplos de la necesidad de nuevas bito médico. Para la produccién o transformacién de algiin metabolito deseado, se pueden actual- mente conseguir muchas cepas en diferentes colecciones de microorganismos. Estas (0 de reconocimiento mundial, como son la ATCC pueden ser colecciones locales (American Type Culture Collection) en los Estados Unidos de América o la DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) en Alemania. Elaislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayoria de los casos, mediante la produccién de colonias aisladas en cultivos sélidos. El ere~ cimiento exponencial de las bacterias permite producir un gran nimero de ellas a partir de una tnica célula inicial de forma que, tras un periodo de incubacién en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos iguales. Para encontrar microorganismos con las caracteristicas deseadas idealmente se de- en buscar en la naturaleza, en condiciones en las cuales se supone que se pueden encontrar en mayor concentraciones. Por ejemplo, en las aguas de desecho de cur- tidoras es més probable encontrar microorganismos que produzcan colagenasas 0 algiin otro tipo de proteasas. EI porcentaje de los microorganismos en la naturaleza que se han analizado para fines biotecnolégicos es minimo, por ejemplo; un gramo de tierra puede contener 10°-10® bacterias (entre ellas 10*-10° actinomicetes) y 10?-10* hongos, muchos de ellos posibles productores de antibisticos. Independiente del lugar donde se busque el microorganismo, se debe utilizar un método adecuado. El mas utilizado es cultivo en medios y condiciones especiales que leven a una seleccién del microorganismo con las caracteristicas deseadas (cuadro 4.1). Principios pr BrorecnoroGia Microniana 55 Escaneado con CamScannerundro 4.1 ara cain de algunos microorganismos P' MO DESEADO- CONDICIONES DE SELECCION MICROORGANIS! ‘Temperatura de incubacién entre Oy 15 °C Condiciones de cultivo toi Temperatura de incubacién entre 50 y 100°C coed pH del medio entre 15 y 4 la pH del medio entre 9 y I4 aa ‘Alta concentracién de cloruro de sodio ‘aaa § Condiciones libres de oxigeno proetres depres Medios casera Medio agar almidén ductores de amilasa e a Medio agar emulsién de aceite Productores de lipasa Fuente: Leuchtemberger (1998) Este método se efectiia al colocar un volumen pequefio de una suspensién de mi- croorganismos o de la muestra a analizar, en la superficie de una placa Petri con medio de cultivo en agar al 1,5-2,0 9. En dicho medio de cultivo se debe colocar el substrato que hard que el microorganismo deseado crezca en forma de colonias ‘Ademis del substrato en otros casos lo que se puede variar son condiciones de cul- tivo, como el pEI del medio o Ia temperatura a la que se incube. Una vez que se desarrollen colonias, estas deben aislarse del resto, esto se hace repicando la colonia en una placa o tubo de agar. De esta manera se obtiene un cultivo puro. Se denomina cultivo puro al que contiene solo un tipo de microorganismo. Los cultivos puros se inician, a partir de colonias aisladas, de manera que todos los in- dividuos tengan la misma composicién genética. Los cultivos puros son esenciales Para estudiar las caracterfsticas de los microorganismos, identificarlos con seguridad Y posteriormente cultivarlos. jorment Los cultivos puros deben ser cultivados y mantenidos con técnicas asépticas y microl 2 eae bioldgicas ya conocidas, para evitar su contaminaci6 Y mantener sus caracteristicas productoras. En muchos casos, antes de iniciar e lamiento de icroorganismos en placis sos, antes de iniciar el aisl gal i : de los micro ist 4 ctuar un enriquecimi : posi qu el micsoee ee ucSient en un medio liquide, eon una cn = ictoorganismo buscado si se ji 6 se mukipliquey sumer se encuentra en baja concentracist, lun volumen del cultivo en la placa Petr cog ots Poblaciones. Ass, al colo es ‘tri con agar es més probable poder aislar cl En algunas ocasiones se sel leccionan to i B mca ml li hsp ce colonias que demuestren I a los del cuadro 4.1 ionarse | : fa produccién de las ens; ei a a P € las en: a un halo claro alrededor 56 Avo.ro Quesapa Cuanto Escaneado con CamScannerJo cual evidencia Ia hidr6lisis dela casefna. En el caso de los prod i ea ea productores de lipasas se escogen, Por ¢ » £Olonias que muestren un halo turbio debido a la precipita- cién de los écidos grasos libres con el calcio en el agar emulsién de aceite. En otros casos se pueden variar difere ici je i i miento en un medio donde la tnica fuente de carbono sea pen wee, el pH del medio aun valor entre 1y Sy se incuba a bajastemperatirs Un amplio panorama se abre con Ja posibilidad de encontrar nuevos metabolites d interés en endéfitos. Los microorganismos endéfitos son microorgeuniemoe que vi. ven en los tefidos de las plantas; de acuerdo con las 300,000 especies de planter en el planeta Tierra y con el conocimiento de que cada planta convive con ute o més en- défits, esto ofrece una idea del gran nimero de microorganismos que pueden esti diarse; pues la mayoria de ellos producen diferentes metabolites que oftecen tun gran potencial farmacéutico, agroquimico e industrial. Hasta el momento se han descu- bierto nuevos metabolitos con actividades antibacterianas, antfiingicas, antivirales, inmunosupresoras, insecticidas, antioxidantes y para el tratamiento de diabetes. Existen procedimientos de enriquecimiento del ntimero de bacterias de ambien- tes naturales para facilitar su aislamiento. Uno de ellos es la Columna de Wino- gradski, en Ia cual se crea un microcosmos para enriquecer el mimero de ciertos tipos de microorganismos presentes en ambientes naturales con el objeto de fa- cilitar su aislamiento. Otra estrategia es la utilizacién de reactores de columna empacada, donde se cultiva una muestra de agua, tierra u otro material, manteniendo las condiciones que faci- liten el crecimiento del microorganismo deseado. Estos reactores de columna estén empacados con algiin material que facilite la colonizacién por parte de los microor- ganismos; el sistema se alimenta continuamente con flujo de medio de cultivo de abajo hacia arriba. Un sistema como el anterior, fue inoculado con suelo de la Antér- tica, mantenido a 10 °C y alimentado con un medio rico en caseina, para asi lograr que el sistema se enriqueciera con microorganismos productores de proteasas psicr6- filas. Después de 25 dias de cultivo, se obtuvo una concentracién en la fase liquida del sistema de 10® cells mI". Estos microorganismos se sembraron en placas con 8 microorganismos productores de proteasas medio de caseina y se lograron aislar 2 lados pertenecen a los en concentraciones importantes. Estos microorganismos aisl: géneros Brevundimonas, Masslia, Chryseobacterium, Planococcus, Stenotrophomonas y Paenibacillus. La diversidad encontrada demuestra la eficiencia de este tipo de reac- tor con respecto a otros métodos de enriquecimiento y aislamiento. Nuevas estrategias se han desarrollado para aislar microorganismos que todavia no han sido aislados. Métodos moleculares han mostrado que los microorganismos, hasta ahora aislados y cultivados, pueden corresponder tan solo al 1% del total de los microorganismos. El acceso a esta reserva metabdlica y genética de estas poblaciones atin sin aislar, es de gran interés en Areas tales como Ia produccién de alimentos, medicina, biorremediacién y agricultura. Pi p1os DE BioTecNoLoGia Microsiana PrinciPlo Escaneado con CamScanner 57A metabolito © Diocatalizado, rod ina o enzima deseada, , Un método més moderno para la rotein 0 ifica para la protec” : Tuo es localizary aslar el ADN ave codific Pe con la sintesis de un metabo, 7 ia eto. FE; a ima: * poorganismo completo. Est. el ADN relacionado cool be necesita aislat ah oer oTBTADN de genes gu . sag sdentificar deseado; de tal mane ‘ontrar, identi ido utilizado para encontrar, IOSD! ora. método ha sido utiliza” de interés en el m! . codifiqun para boctalizad re ge ls microorganiamos no cultvabls, Jos genom , aa itos de interé siste ED .6n de metabolitos ters El metagenome com pvaluable de genes para produces cuales son una fuent ‘ ede haber hasta 4,000 diferentes especies ac Se calcula que en un gramo de He PLT .5 se pueden cultivar por los métodos microorganismos; pero solamente el idos de cultiv. 7 a venemientoy posterior clonaje de estos ADN metagentmios en or Jo tanto, ¢' i fail cultivo como E. coi resultan promisorios, it microorganismo de ei ven E. coy producir enzimas como lipasas o metabol- clonar genes me tee Nerobiana. Los nichos que se ban estudiado en busca de este ambientes extremos como las profundidades marinas. 4.2. CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS 4.2.1, Multiplicacién de los microorganismos Enel caso de los microorganismos se entiende bajo crecimiento el aumento en el ni- mero de células. Por tanto, no se hace referencia al crecimiento de una tinica célula, sino en general se refiere a crecimiento de una poblacién. Durante el ciclo celular de una bacteria se replica del material genético, se sintetizan componentes celulares, se elonga la bacteria hasta alcanzar un tamafio con el cual puede dividirse por fisién binaria, para dar lugar a dos células hijas iguales que con- tengan los mismos elementos estructurales y potencialidades (figura 4.1). . Elongacién celular y replicacién bL bi del ADN » Formacién de septo Separacién de células ‘én de una célula b; terian: act Puente Adsptade de Madigan 2005) 58 Avotro Qvesava Cuanto. Escaneado con CamScannerEnel caso de las levaduras, se multiplican asexualmente por un proceso denominado gemaci6n. Durante este proceso se forma una pequefia protuberancia o gema que aumenta progresivamente de tamafio, luego se produce la divisién en el nucleo y mi- gra hacia la goma, la cual al llegar a un tamafio dado se despega de la célula readve Las levaduras pueden ser tanto haploides como diploides, Ex las levaduras puede darse reproduccién sexual con formacién de ascosporas, en este caso ve da fueron de Jos dos niicleos haploides, formacién de un nticleo diploide, reduccién cromosémica, formacién de niicleos haploides, ruptura de la membrana nuclear e individualizacion de las esporas. Este tipo de reproduccién solo se da en ciertas condiciones, Los hongos filamentosos crecen de diferente manera. Estos crecen en forma de filamentos a partir de su apice o célula terminal. Estos filamentos microscépicos se denominan hifas. Las hifas miden de 5 a 10 um de didmetro y su longitud es variable pero pueden alcanzar hasta metros. Los nticleos se dividen por mitosis sin divisin celular y migran hacia donde se da el crecimiento de la hifa. Las hifas se ramifican formando marajias de hifas. En los hongos filamentosos se da reproduccién asexual yen algunos casos sexual. (Mas informacién capitulo Principios de microbiologia) 4.2.2. Fases de crecimiento de un cultivo En el caso de un cultivo en donde se posee un volumen de medio dado y no sea re~ tirado medio agotado ni sea afiadido nuevo medio (cultivo discontinuo), se darn las cuatro fases caracteristicas: fase de crecimiento lag, fase de crecimiento exponencial o log, fase estacionaria y fase de muerte. Cuando se grafica el crecimiento celular (logi0 de la concentracién celular) contra el tiempo de cultivo se obtiene la curva caracteristica con las cuatro fases como se observa en la figura 4.2. Estacionaria Muerte ¢ 3S § a a 9 3 2 = bo Q a) ‘Tiempo de cultivo Figura 4.2 : Curva de crecimiento de un microorganismo Fuente: Adaptado de Madigan (2005) Princrpios DE BrorecnoLocia Microsiana 59 Escaneado con CamScannerismos se adaptan al medio y con. ducir los sistemas de transporte y de cultivo, Se caracteriza po, células aunque 1a masa lular si puede aumentar, fase depende de las condiciones fisiol6gicas activos se encuentren los mj. sera la fase Lag. La duracign fermentaci6n y, por lo en esta fase los microorgan rganismos van a pro dio y las condiciones Fase Lag o de retardo: diciones de cultivo. Los microo! enzimiticos necesarios para el me no haber aumento en niimero de ion de esta n de inéculo. Entre mas ncentracién, mas corta tendimiento final de una aunque es minimo. La durac’ del indculo y la concentraci6: croorganismos y mayor sea su CO! de esta fase va a redundar en el tanto, en su productividad. Fase Log 0 de crecimiento exponencial 0 logaritmico:.en esta fase los microorga- nismos ya adaptados al medio, alcanzan la mayor velocidad de crecimiento en esas condiciones, Mientras, haya substrato en exceso y NO Se acumule ningtin metabo- lito téxico, el aumento de la cantidad de células o la biomasa sera exponencial y a esta fase se le conoce también como fase de crecimien- constante: Por esta razén, to logaritmico. Durante esta fase se producen la mayoria de metabolitos primarios importantes. En la fase log se alcanza la tasa maxima de crecimiento (Umax). bajo esas condicio- nes y.sustrato. El inex depend ick ino ROR: i Pores nde de las condiciones ,de cultivo BOF ¢ gable la temperatura i \Cuadro 4.2 ‘Tasa maxima de crecimiento al variar la temperatura MICROORGANISMO TEMPERATURA °C ne) ! max Aspergillus niger A 30 j 0,20 ‘Aspergilus nidulans : 20 0,09 2 Ks 0,148 0,215 7 ; 0,360 Fuente: Crueger (1989) Escaneado con CamScannerEl pmax también es diferente para cada microorganismo (cuadro 4.3). Cuadro 4.3 ‘Tasa maxima de crecimiento de diferentes microorganismos MICROORGANISMO. See eee ee Beneckea natriegens Methylomonas methanolytica Penicilium chrysogenum Fuente: Crueger (1989) El nae depende del medio de cultivo, por ejemplo un mismo microorganismo va a tener mayores pimax si utiliza azticares simples} y crecer més lento si la fuente de carbono es mas compleja (cuadro 44). Cuadro 4.4 Crecimiento de Fusarium gramineum en diferentes substratos SUBSTRATO Glucosa (monosacérid) Maltosa (disacérido) Maltotriosa (trisacérido) Fuente: Grueger (1989) én de bacterias en crecimiento en ambientes favorables, pue- den ser muy cortos (20 min). Esto lleva a que una tinica célula creciendo con un tiem- pode generacién de 20 min, llegue a poder producir 4,7 x 10% eélulas en 24 horas. ‘ede observar la presencia de més de 7 beat log. a fend- ty diauxia y se da en fermentaciones con medios de cultivo com- Hsp, donde pee haber ebre odo ms de una ented carbon, Por oto primera fase log corresponderd al consumo de Ia fuente de carbono mG reel asequible. Una vez que se acaba esta fuente de carbono habré una pequefta fase lag donde el microorganismo no se multiplica, sino que prepat el equipo enzimético se dard la segunda fase log, Pueden existir ara otra fuente de carbono y después la fase a fases log, segin las diferentes fuentes de carbono disponibles. Los tiempos de generac En algunos casos, se pu Princrpios DE BrotecNoLoci{a Microntana Escaneado con CamScanner 6162 Avouro Que mero ni la masa eS bacterias, en esta fase n Las células en fase estacio. a} er a otras. i as células ayuda a manta fase exponencialy, durante ela, Ca oe “Fe netabolitos secundarios que pueden Fase estacionaria: o se incrementa el nti fase est 2 La lisis de las primer: naria desarrollan un met se produce una acurmulacién 5 saieaetdal ner importancia industrial. : — tener imp: cntran en fase estacionaria porque se ag0e8 an butrcnt = entra ductor de desecho que han liberado durante ly re ‘ara el crecimiento microbiano, .edio sea toxico Pp = Serena pues probablemente represente, con vtabdlico real de os microorganismos en los am. Los microorganismo: esencial del medio 0 fase exponencial hacen qi La fase estacionaria tiene grat mayor fidelidad, el estado m ientes naturales. i. Lace tes energia se genera la muerte ylisis celular en de de muerte: agotadas las reservas : Fase de mcr Ala duracign de esta fase depende del microorganism, en algunas pie | d ddan muy pocos organismos viables; mientras especies, después de pocas horas quedan muy pocos ismos vi a en otros puede durar meses 0 hasta afios persistiendo eélulas viables, Esta fase no es importante en la industria, pero sien la supervivencia enla ae re el punto de vista microbiolégico, un microorganismo muere Cuan: se le de forma irreversible la capacidad de dividirse. Como consecuencia de esta pérdida, fo se pro- duce aumento en el ntimero de microorganismos y, por tanto, NO hay crecimiento, Sin embargo, un microorganismo puede estar muerto desde el punto de vista micro- biolégico y continuar desarrollando una actividad metabélica que se traduzca, por ejemplo, en liberacién de toxinas. Por otra parte, hay que considerar que la capacidad de multiplicacién (crecimiento) de un microorganismo puede verse transitoriamente afectada por lesiones o por las condiciones fisicas 0 quimicas del entorno. En estos casos, podriamos considerar como muertos a microorganismos que pueden reanudar su crecimiento si las condiciones son de nuevo favorables. 4.3. FACTORES F{SICOS Y QUIMICOS QUE INFLUYEN EN EL CRECIMIENTO 4.3.1. Temperatura Ja temperatura afecta la estabilidad y la actividad biolégica de diferentes moléculas is rans, expeciaente las enzimas y también afecta los lipidos; interfiere con organelac y ot ane Afecta asimismo la estabilidad del material genético, de "eanclas y otras estructuras intracelulares como los tibosomas jit microrganismo tiene una temperatura de creci variacion de la velocidad de crecimi lava imiento en funcién eats fempersne por debajo de la que no Produce un incremento [i alcanzar la temperatura 6pti ene ra Optima a la que la veloci pe ci temperatura éptima, la velocidad de erchiaaetaaa c imiento dptima. Si se estudia de la temperatura de cultivo, hay crecimiento. A mayores velocidad de crecimiento hast es maxima. Por encima de est! ‘ae bruscamente, SADA CHANT Escaneado con CamScannerSegin el rango de temperatura éptima de crecimiento de los microorganisms se dividen en varios grupos como se muestra en cuadro 4.5, Cundro 4.5 Clasificacién de los microorganismos segiin temperatura Sptima de crecimiento TEMPERATURA EJEMPLO ‘AMBIENTES OPTIMA °C Psicréfilas 0-20 Flavobacterium Océanos, polos Psicrotrofos 25-45 Listeria Meséfilas 25-45, Ecol Flora de organismos de sangre caliente Terméfilas, 45-80 Bocilus Fuentes termales, stearothermophilus voleanes Hiperterméfilas 80-115 Pyrodictium brockit Volcanes, voleanes Thermococeus submarinos Fuente: Madigan (2005), Crueger (1989) Los microorganismos psicrétrofos 0 psicrotolerantes son mes6filos que pueden crecer a temperaturas bajas; por tanto, se les puede considerar como psicrofilos facultativos. Esto es importante desde el punto de vista aplicado, porque cuando se ‘encuentran contaminando alimentos, son capaces de crecer en condiciones de refri- geracion (4-8 °C) y producir infecciones en los consumidores del alimento. Desde el punto de vista biotecnol6gico, los microorganismos més cultivados son los mes6filos por ser condiciones de cultivo suaves. En los tiltimos tiempos, los psicréfilos, terméfilos ¢ hiperterméfilos han ganado mucha importancia; a partir de ellos se puede producir enzimas y obtener genes para productos muy importantes a nivel industrial. Es de imaginar los problemas técnicos que genera el cultivo de microorganismos terméfilos ¢ hiperterméfilos. Este pro- blema se ha obviado, aislando genes de estos microorganismos ¢ insertandolos en microorganismos meséfilos, los cuales se cultivan a temperaturas entre 25 y 45 °C y sintetizan el producto de interés. La necesidad de mantener la temperatura de cultivo en el valor éptimo, hace que los biorreactores cuenten con dispositivos destinados con tal objetivo, Importante es recalcar que, en muchos casos, la temperatura ptima de crecimiento puede ser diferente a la temperatura éptima para la produccién del metabolito deseado. Por lo tanto, en procesos biotecnol6gicos es aiin mas importante conocer y optimizar la temperatura éptima de produccién. si Principios DE BiotECNoLoGia Microniana 63 Escaneado con CamScanner43.2. pH H interno mediant i anismos regulan su P i poe El pH es el “of Hsh, Lon mee wn eneuentra en 1a membrana citoplasmatica ¢ sistema de transporte de p ‘ATP dependiente. En muchos casos, la obtencién de i una bomba de protones ft i i id aon st ae de de la presencia de una diferencia en la concentracién de aces ‘a ambos lados de Ia membrana citoplésmica. Cuando los microorganismos é ‘encuentran en ambientes con niveles de pH externo muy desfavorable, se requiere fs HH interno. un gran consumo de energia para mantener elpl El pH interno, en la mayoria de los microorganismos, se encuentra en el rango de 6,0 a 7,0. El pH externo es un parametro critico en el crecimiento de microorga- nismos; ya que cada tipo de microorganismo solo puede crecer en un rango de pH, fuera de este mueren. La mayoria de los microorganismos crecen en pH cercanos a pH 7,0, pero existen microorganismos que crecen mejor en pH bajos como los hongos e incluso, otros que viven en ambientes con pH extremos crecen 6ptimamente en estos rangos muy altos o muy bajos de pH. En general, las bacterias crecen a pH cercano al neutro, los hongos a pH mas bajos (figura 4.3). Figura 4.3 Efecto del pH sobre tasa Curva A correspondeahonan seamen hongos, curva Ba mae ’ Fuente: Adaptado de Ertola (1994) 64 A Avouro Quesapa Cuanto Escaneado con CamScannerSegiin el rango de pH éptimo de crecimi at 5 iento de los microorgani tos = den dividir en diferentes grupos como se puede observar en puadeo 46. ace oes Cuadro 4.6 Clasificacién de los microorganismos segin pH éptimo de crecimiento CLASIFICACION — pH OPTIMO. EJEMPLOS AMBIENTES: Acidofiicos 1-55 Thiobacills, Sulfolobus, Lagos volcénicos, Lactobacillus drenaje de zonas mineras, suelos de bosques de pinos, contenido gastrico. Escherichia colt Flora de organismos de sangre caliente. Alcalofilico Bacillus sp. Lagos, drenajes alcalinos con alto contenido de carbonato de Calcio. Neutrofitico Fuente: Madigan (2005), Crueger (1989) Como consecuencia del metabolismo, el pH del medio puede bajar durante el cre- cimiento debido, en la mayoria de los casos, a la produccién de acidos orginicos por parte del metabolismo del microorganismo y el consumo de sustancias alcalinas como amonfaco. Este descenso en el pH puede tener ventajas como desventajas. Por ejemplo, en el caso de las bacterias lacticas que producen grandes cantidades de éci- do lictico como consecuencia de su metabolismo primario, reduce el pH del medio de cultivo a niveles no tolerables para otras bacterias (aproximadamente a un pH de 4,5), Esto le confiere a estos microorganismos una ventaja sclectiva frente a otros microorganismos competidores. De esta forma, las bacterias competidoras mueren y las lacticas se convierten en la poblacién dominante. Ademis, los dcidos orgénicos dé cadena corta (férmico, acético, lictico) son téxicos para muchos microorganis mos, En este sentido, se debe considerar que la accién bactericida de estos acidos orginicos de cadena corta es mas potente que Ja debida inicamente a la disminucién del pH que producen. Elefecto inhibidor o letal del pH Acido sobre los microorganismos, tiene aplicacién en la produccién y conservacién de alimentos al acidificarlos, Por cjemplo, la pro duccign de dcidos en el curso de fermentaciones naturales permite prolongar la vida de los alimentos fermentados (Sauerkraut, procesos de ensilaje) En el aspecto téenico, muchas veces este descenso en el pH es recomendable; pues reduce iy velocidad de crecimiento del mismo microorganismo. Por Jo tanto, la Princre1os DE BroTECNOLoGi{A Microsiana 65 Escaneado con CamScannerici control automitico, fa de fermentadores tienen sistemas de a ara del microorganig mayoria Hi del medio de cultiv estable en'el pH 6p . mantener ¢l pi 43,3. Actividad de agua ay in entre la presion de vapor de agua en i ividad de agua (ay) a la relacic : ern PD ya prin de vapor de agua del agua pura (P,) aw = Ps/Pw idea de la cantidad de agua disponible metabélicaments Pi aonb ds es disueltos en ela. Por eemplo: el agua presente en un, | solucién saturada de cloruro de sodio, gran parte de las moléculas de agua particip, | casa dels ions de sl duet, Poro tanto In cantidad de melas | de agua disponible es muy baja para actividad metabélica microbiana. Conforme aumenta la cantidad de solutos en el medio, aumenta la osmolaridad de| medio y disminuye su actividad de agua. Cuando un microorganismo se encuentra cnun substrato con una actividad de agua muy baja (osmolaridad elevada o solucién hiperténica), su crecimiento se detiene. Est. Mevar asociada la muerte del a suspensién del crecimiento no suele microorganismo, sino que se mantiene en condiciones Sangre humana Caulobdecter, Spiriium ‘Agua marina Streptococcus, E.coli 'udomonas, Vibrio 0850-9809 = Jaén 'acllos Gram pdsitivos Coto ram pests | Escaneado con CamScannerPor eta azn, se Pueden encontrar hongos produciendo deterioro en alimentos de baja actividad de agua (¢: quesos secos o mermeladas) La reduccién dela actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene importancia aplicada en la in- dustria alimentaria, La utiizacién de almibares, salmuera y el talado de carnes ¥ peces reduce la actividad de agua del alimento para evitar su deterioro. Ciertos microorganismos especializados viven en estos medios hiperténicos y se les conoce como asméfilos. Entre los osméfilos se pueden distinguir los sacarofilos y Jos haléfilos. Los sacaréfilos son representados por los hongos filamentosos y levaduras que re- sisten soluciones con concentraciones elevadas de azticares. Son importantes; pues crecen en alimentos azucarados donde otros microorganismos no crecen, como son concentrados de jugos de frutas, jaleas, almibares, etc. Los Aaléfilos pueden crecer en medios con alta concentracién de cloruro de sodio y se pueden dividir en haléfilos moderados y extremos (hiperhal6filos). Los haléfilos moderados: suelen ser bacterias marinas (Vibrio fischeri) que viven en 3,5 % de NaCl, ysu crecimiento es inhibido a concentraciones mayores o menores de sales. Halofi- los extremos, representados por las arqueobacterias del género Halobacterium, viven en concentraciones saturantes de sales (salitrales, lagunas salinas). Los microorganismos que pueden vivir en ambientes extremadamente secos, se Ie denomina xeréfilos; entre los cuales se pueden encontrar hongos que crecen en alimentos extremadamente secos o bien, algunas bacterias crecen en las rocas de os desiertos que manchan de un color caracterfstico conocido como barniz del de- sierto (desert barniz). Entre estas tltimas se encuentran bacterias de los géneros Metallogenium y Pedomicrobium. 4.3.4, Requerimientos de oxigeno Segiin su relacién con el oxigeno los microorganismos se pueden dividir en dos . grandes grupos: aerobios y anaerobios. Aerobios: utilizan el oxigeno en la respiracién aerébica como aceptor final de equi- valentes reductores para la produccién de ATP. Durante la respiraci6n aerobia se producen muchas sustancias téxicas; por lo tanto estos microorganismos tienen una serie de enzimas para degradar estas formas téxicas, entre estas se encuentran las catalasas, peroxidasas y superéxido dismutasas. Segiin su requerimiento de oxigeno los acrobios se dividen + Obligados: dependen estrictamente de Ia presencia de oxigeno para crecer, * Facultativos: no lo requieren pero crecen mejor en presencia de oxigeno. * Microaerofilicos: requieren oxigeno pero en, concentraciones menores a la atmosférica (2-10 % vs. 20 % atmosférico). Anaerobios: no utilizan el oxigeno como aceptor final de electrones. Su metabolismo “fermentativo”, donde los aceptores de equivalentes energético es, en algunos casos, Principios pi Biotecnotoc{a Microsiana 67 Escaneado con CamScanneri ‘F se Ga por fostorilacis, sas organicas y la produecién de 6" Pp Acidy reductores son sustancias orga! ion os es MOT que ae por sustrato. El rendimiento de los poe ru et ctaeeh oe be st S ser cirativos”; por ejemplo: las bacterias Y juras prodocen menos bom, ‘respirativos”, penne que cuando lo hacen respirando “fe 2} a barony eB zi ‘ni j ao Ico} coor ere producen sustancias organicts de ajo pe fe are q Heidos orginicos (Iéctico, propiénico), solventes Acct" sah aa vemos, viven en ausencia de oxigeno; sin embargo, llevan Otro tipo de microorganisms rm estos casos, en lugar de oxigeno como acept; i tivo. cabo un metabolismo one TON iar nitratos, sulfatos u otros compuestos. A este clectrones, puede! 5, sulfatos $ comp a i se le conoce como respiracion anaerobia. Segtin su resistencia a la presencig roce’ : .S ie ‘oxigeno los microorganismos anaerobios s¢ dividen en: + Aerotolerantes: no requieren oxigeno y su crecimiento mejora en presencia de este. (Lactobacillus). oe a + Obligados (Estrictos): a presencia de oxigeno ¢s etal 0 toxico (Clostridium Bac- teroides; Methanococcus). 4.3.5. Potencial redox Janie El potencial redox nos indica la capacidad del substrato para aceptar o donar clec- trones, sus caracteristicas oxidantes o reductoras. Es analogo al pH; este mide la actividad de protones y el potencial redox mide la de los electrones. Uno de los fac- tores que intervienen en el potencial redox, aunque no el tinico, es la concentracién de oxigeno. Hay microorganismos que requiéren ambientes oxidantes para crecer, mientras otros necesitan ambientes reductores. El metabolismo de ambos tipos de microorganismos presenta diferencias notables. 4.4. METODOS PARA LA MEDICION DEL CRECIMIENTO MICROBIAI Het pede el crecimiento microbiano se ‘necesitan métodos que indiquen la canti- i 9 a lulas ° biomasa en el proceso, ya sea por un. método directo o indirecto. ‘Sen te valizan soon que se basan en la medida de’ algin parimetro del ; el cual permite deducir informacion ivi i smo y evolucién del crecimiento. Los métod: Ee ee Mee coors) i ri los tambié; : Z Seco ae ea 68 Apotro Qvesapa Cnanto Escaneado con CamScanner44,1. Recuento microscépico en camara Consiste en la observacién al microscopi C t »pio de volimenes muy pequefios de suspen- siones et rae haa usan Unos portaobjetos especiales dlenominados clatas de Petroff-Hausser, Thoma o de Neubauer; son portaobjetos modificados con una profundidad esténdar y una rejilla que permite conocer el volumen observado. El procedimiento es rapido y sencillo; pero con este no se distinguen células vivas de células muertas. Ademés, solo se puede utilizar para células grandes como las le- vaduras, para recuento bacteriano no se utiliza este método. En suspensiones muy diluidas el sistema se torna impreciso; por lo tanto, para que la medida sea correcta es necesaria una cantidad de células mayores de 104-105 por ml. Una ventaja es que se necesitan volimenes bajos de muestra. Esta muestra debe estar bien homoge- nizada. Utilizando colorantes especiales se pueden diferenciar las células muertas de las vivas. 44.2. Biomasa seca Se le conoce también como peso seco. Se toma un volumen dado de la muestra ho- mogenizada en un tubo de centrifuga previamente pesado hasta peso constante. Se procede a centrifugar, decantar y resuspender los microorganismos que quedan en el fondo, dos o tres veces con agua o solucién salina; después del ultimo lavado se procede a colocar el tubo a 80 °C por minimo 24 horas. Posteriormente, se coloca en un desecador y se pesa el tubo hasta peso constante. La diferencia entre el peso final y la del tubo vacio equivale a la biomasa seca en los mililitros de muestra. Como la biomasa se reporte en gramos por litro, se multiplicard el valor obtenido por el factor del caso, segtin los mililitros de muestra utilizados. Para hacerlo estadisticamente aceptable deben usarse muestras de 10 a 20 ml, que en algunos casos representan voliimenes muy altos. 4.4.3. Densidad éptica Son técnicas basadas en la medida de la turbidez o en la absorbancia de los medios cen microorganismos unicelulares. La turbidez es pro- de cultivo en los cuales cre unicel ic r porcional a la masa de las particulas en suspensién (células) y su medida permite lar al que se emplea en la medida de la estimarla. Para ello, se utiliza un equipo simil c absorbancia de luz. por disoluciones coloreadas (colorimetro 0 espectrofotémetros). Las medidas se hacen a una longitud de onda adecuada (550-600 nm) y los valores se suelen denominar valores de densidad éptica. iui i bsorbancia esté La suspensién debe ser diluida de tal manera que la medida de absorbancia entre 0,05 0,4, La lectura obtenida debe ser multiplicada por la dilucién utilizada, iets c istingue células vivas de muertas y no es sen Este sistema es muy sencillo pero no d sible en concentraciones celulares muy bajas. Se necesita poco volumen de muestra, Princreios pe Brorecnotocia Microsrana Escaneado con CamScanner 69 ee.4,44, Relacién densidad éptica-masa seca i . n suspension y, por lo tanto, pidez de un cultivo de biomasa en sus : oie ei Ta densidad dptica se puede estimar la biomasa. En cuyo co, lo save hace es preparar diferentes suspensiones con diversas coneentraciones dl m. qrorganisme que se est tilizando. A cada una de esas suspensiones se ls mide a ote aca ona longitud de onda entre 550 y 600 nm y la biomasa seca. Después se procedea hacer una “curva de calibracién’, a graficer los resultados de la biomasa seca de cada suspensin versus los datos de la densidad éptica- La relacién directa entre la absorbancia y el peso seco, solo se aplica para suspensio- tas suspensiones no deben tener una absor- diluidas de bacterias y levaduras. rabrmmconinrinerapien | producen desviaciones de la ley de Beer, bancia mayor a 0,4; pues valores mayores ), Se calcula la pendiente de Ia curva que equivaldré se pierde linerialidad (figura 4.4) va una constante (K), Durante cualquier momento de la fermentaci6n, se toma una ‘muestra del cultivo, se diluye de tal manera que la densidad éptica sea menor de 0,4, yse divide entre el valor de K, asi se obtendré el valor de biomasa seca de esa suspen- sin. Entonces se multiplica este dato por el factor de dilucién y arroja el resultado de la biomasa seca del cultivo. Este método tiene la gran ventaja de que se obtiene tun dato de biomasa seca aproximada muy répidamente, sin medir directamente la biomasa seca lo cual tarda 24 horas. lepende de la 4: £ s 3 3 2 g By = Biomasa seca : Figura 44 Relacién absorbancia versus biomasa medida Fuente: Elaboracion propia Aton 44.5, Peso himedo Se obtiene a part partir de de las células por fitracigg Pension de cult Tee ién de cultivo :, Jes clas puede cere 0 eatfigacion, La behest te pane Ws Por ejemplo, un botén de edhe; be ay acterianas muy 70 A POLO QuEsaDA Cuanro Escaneado con CamScannerempaquetadas puede contener un espacio intercelul me lar que aporta entre el 5-30 % del hiimedo, de acuerdo con la forma celular y grado de empaque. Este método es ripido no es muy exacto. Se puede mejorar est: i decantacién, filtracién y centrifagacion, estandarizando los parémetros de lavado, 44.6. Recuento de células viables por plaqueo Consiste en sembrar un volumen determinado de muestra en una placa de medio de cultivo sdlido, adecuado para el crecimiento del microorganismo a evaluar. Se co- nocen dos métodos: por chorreado o por esparcimiento. De esta manera, después de una incubacién por un tiempo y temperatura adecuada, se puede estimar el ntimero de microorganismos viables, al contar el ntimero de colonias que se forman; cada una de estas deriva de una célula aislada o unidad formadora de colonias (UFC). Para que la medida sea correcta desde el punto de vista estadistico, es necesario contar entre 30 y 300 UFC por placa. Por lo tanto, se deben hacer diluciones previas de la suspension para que el recuento final se obtenga en el rango citado. En ciertas ocasiones en las que la densidad de microorganismos es baja, se pueden recolectar por filtracién a través de una membrana estéril (de 0,2 ym de tamaiio de poro) y posteriormente, se coloca el filtro en un medio de cultivo sélido adecuado para que se formen las colonias en Ja superficie de la membrana. La ventaja de este método es que mide solo microorganismos vivos y Ia desventaja deriva en que puede tardar més de 24 horas en obtenerse resultados. 4.4.7. Conteo de particulas con sistemas automiticos contadores de células La operacién de estos sistemas es sencilla y permite répidamente determinar el né- mero de particulas presentes en una suspensién. El problema es que no distingue entre células vivas y muertas o particulas que puedan existir en el medio de cultivo: Estos contadores electronicos permiten realizar recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos o microorganismos filamentosos. Estos sistemas son muy caros. acionan con la cantidad de células como la Se utilizan otros métodos que se correl BN neces roteinas totales, nitrégeno total, ADN, los medicién de ATP, la determinacién de p tales cuales no se evaluardn en este texto por su poca utilizaci6n, ta concentracién o masa celular se han adaptado para Ulilizariee corag eistemas “on Line’, 1o cual significa que no es necesario extraer la muestra del eultvo para efecruas Ia media yseobtienen datos constantement, De esta manera, se puede realizar medidas en tiempo teal y disminuye los riesgos de 5 i -aros. contaminacién; dichos mecanismos y sistemas son care Los sistemas de medida de Paincre1os pe Biorecnorocta Microniana 71 Escaneado con CamScannerRMENTATIVO ciones definidas para la transfor. iependiente del sistema de cultive war a cabo una fermentacién son de procesos s¢ Je denomina “up 45, FASES DE UN PROCESO FE ti i di silizan cultivos puros en con Gene sci dun metabolito deseado Ind op von a utilizar, ls etapas para ipo de fermentacién a utiliza, : Se pe en peep is il jiferenciatl a s Ia stream” o coriente axe Y Fo de un metabolto dado producido via bioteenlg Ttcope rane ance an ca. Las prin 4.5.1. Multiplicacién del material de inéculo lel material de indculo es un paso importante, primero para la La multiplicacién d nismos y segundo, para la futura superacién de la mayor cantidad de microorgat r tetivided de dichos wiiLrosaganiathe Por lo general, se parte aS aces de man- tenimiento y se pasa a un erlenmeyer en agitacién. El medio cul ee en este caso es liquido y debe contener todo lo necesario para intentar reactivar la mayor can- tidad de microorganismos posible. El tiempo de crecimiento depende de cémo fue mantenida la cepa, la cantidad de microorganismos vivos y tipo de microorganismo, Si elindculo se efectita a partir de liofilizados, esta etapa puede tardar de 4 a 10 dias, mientras que si se hace a partir de cepas congeladas, varia del tipo de microorganis- ‘mo} para bacterias puede tardar de 8 a 48 horas, para Actinomicetes de 1a 5 dias y para hongos de 1 a7 dias. A partir de cepas refrigeradas, los tiempos van a bajar para bacterias de 4 a 24 horas para Actinomicetes de 1 a3 dias y hongos de 1a 5 dias. 4.5.2. Precultivo 0 inéculo principal Esta fase es muy importante, pues de la activi i » Pues de ia actividad y la calid; i i en esta fase va a influir en la acti Mane ee eat ividad y el rendimiento de la fase d i6 Principal. El medio de cultivo, en este caso, debe poseer el misino m Sr ate siones que la fermentacién pris ae : medio y condi- , para asi. i totalmente adaptados a tales condiciones exnarn nt roorganismos se encuentren fee ndiciones evitando fases lag prolongadas en la fer En muchos casos “i : puede haber va : de inéculo, con respecto al volumen Cat yee Precultivo y el porcentaje de material mictorgenie, Bars basen nt dee fermentacién principal depend del O.1-3 %, para Actinomicetes, Hsia 2 General se puede utilizar un inéculo de inéculo debe ser optim: 210% y para hongos de 5-1 i centrado de célulge ni Btn el proceso y en He 5:10 %. La cantidad de nea "por tants, el volumen del indeulo pase er ae Om" Yolumen de este tanquie sie Puede ser mucho més baj dc mbra 0 ing en fermentaciones @ nivel de lat Bee escala industrial lo puede tener un) volu iboratori ililitros aus rtorioo de hasta So, spon, ce men de mililitro: 100 litros segiin Ia 72 Fi , Arouro Quushps Cuanra Escaneado con CamScanner