BMC Cancer

Artículo de investigación
.

Un nuevo extracto de la planta caléndula officinalis produce un

efecto dual in vitro: actividad citotóxica anti-tumoral y activación
de los linfocitos.
Eva Jiménez-Medina, Angel García-Lora , Laura Paco, y Federico Garrido - Servicio de Análisis Clínicos e
Inmunologia, hospital Universitario Virgen de las Nieves, Universidad de Granada, Av. de las Fuerzas Armadas 2,
18014 Granada, España
Ignacio Algarra – Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad de Jaén, España.
Antonia Collado - Unidad de Investigación, hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada, España

BMC Cáncer 2006, de 6:119: 10.1186/1471-2407-6-119

La versión electrónica de este artículo es la completa y se puede encontrar en línea en:

http://www.biomedcentral.com/1471-2407/6/119

Recibido 1 de marzo de 2006

Aceptado 5 de mayo de 2006
Publicado 5 de mayo de 2006

© Jiménez-Medina 2006 y otros; Ltd. central de BioMed del concesionario

Esto es un artículo abierto del acceso distribuido de conformidad con la licencia creativa de la atribución de los campos
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Fondo

Los estudios de Fitofarmacoógicos de diversos extractos de Calendula (LACE) han demostrado

características anti-inflamatorias, antiviral y contra-genotóxicas del interés terapéutico. En este
estudio, evaluamos el anti-tumor citotóxico in vitro y las actividades inmunomoduladoras y el efecto
anti-tumor in vivo del extracto de Calendula activado con rayo láser (LACE), un extracto novedoso de
la planta Calendula Officinalis (Asteraceae).

Métodos

Un extracto acuoso de Calendula Officinalis fue obtenido por un novedoso método de la extracción
para medir sus actividades anti-tumoral e inmunomoduladoras in vitro. Las variedades de células del
tumor derivaron de las leucemias, melanomas, fibrosarcomas y los cánceres del pecho, de la próstata,
de la cerviz, del pulmón, del páncreas y de la cavidad colorectal fueron utilizados y la proliferación de
la célula tumoral in vitro fue medida por la incorporación de BrdU y la cuenta viable de la célula. El
efecto del LACE en la proliferación periférica humana del linfocito de la sangre (PBL) in vitro también
era analizado. Los estudios del ciclo y del apoptosis de la célula fueron realizados en células LACE-
tratadas. La actividad anti-tumoral in vivo fue evaluada en los ratones que llevaban en el tejido
subcutáneo las células humanas del melanoma Ando-2.

Resultados

El LACE mostró una potente inhibición in vitro de la proliferación de las células tumorales cuando
fue testado en una amplia variedad de líneas celulares tumorales en humanos y roedores. La
inhibición se extendió entre el 70 y el 100%. Los mecanismos de la inhibición fueron identificados
como detención del ciclo de la célula en la fase G0/G1 y el apoptosis de Caspase-3-inducida.

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Interesante, el mismo extracto demostró un efecto opuesto cuando estaba probado en la variedad de
células de PBLs y de NKL, en la cual la inducción in vitro de la proliferación y de la activación de estas
células fue observada. La inyección intraperitoneal o la administración oral del extracto del LACE en
ratones inhibe el crecimiento in vivo del tumor de las células del melanoma Ando-2 y prolonga el
periodo de supervivencia de los ratones.

Conclusión

Estos resultados indican que el extracto acuoso del LACE tiene dos actividades complementarias in
vitro con efecto terapéutico anti-tumoral potencial: actividad de la célula tumoral y activación
citotóxicas de los linfocitos. El extracto del LACE presentó actividad anti-tumoral in vivo en ratones
contra el crecimiento del tumor de las células del melanoma Ando-2.

Fondo

Las plantas tienen una historia larga del uso en el tratamiento del cáncer. Los principios activos del
roseus de la angélica Gigas, de Catharanthus, del peltatum de Podophyllum, del emodii de
Podophyllum, del brevifolia del Taxus, del elliptica de Ocrosia, y del acuminata de Campototheca se
han utilizado en el tratamiento de las etapas avanzadas de varios malignancies en el ajuste clínico
[1.2]. Además, muchos phytochemicals con diversas características farmacológicas han demostrado
las respuestas para la prevención o el tratamiento de diversos tumores, e.g., flavones, flavanols,
isoflavonas, catechins, y taxanes [3-7]. Las drogas numerosas se utilizan en quimioterapia del cáncer
pero la mayoría exhiben toxicidad de la célula y pueden inducir efectos genotóxicos, carcinógenos y
teratogenic en las células del no-tumor [8.9]. Estos efectos secundarios limitan el uso de agentes
quimioterapéuticos a pesar de su alta eficacia en tratar las células malas de la blanco. Por lo tanto, la
búsqueda para las drogas alternativas que son eficaces y no tóxicas en el tratamiento de cánceres es
una línea importante de la investigación [10]. De hecho, se están haciendo los esfuerzos crecientes de
aislar productos bioactive de las plantas medicinales para su utilidad posible en el tratamiento del
cáncer [11].

Las flores de los officinalis de Calendula de la planta, conocidas comúnmente como “maravilla”, se
utilizan en el oeste y en Asia para sus características antiinflamatorias [12.13].

Los estudios de Phytopharmacological de diversos extractos del calendula han demostrado actividad
antivirus, las características contra-VIH del interés terapéutico [14], y las características contra-
genotóxicas [15]. En estudios clínicos, Calendula era altamente eficaz en la prevención de la
dermatitis aguda en los pacientes del cáncer que experimentaban la irradiación postoperatoria [16].
Su efecto citotóxico sobre variedades de células del tumor in vitro y su eficacia anticancerígena in vivo
fue esbosado brevemente hace 20 años [17]. Los componentes químicos de C. Officinalis incluyen
algunos triterpenes, oligoglycosides del triterpene, y glucósidos del flavonol [18.19]. El objetivo del
actual estudio era evaluar las actividades anti-tumor e inmunomoduladoras citotóxicas ines vitro de un
novedoso extracto de la planta Calendula Officinalis (LACE: Extracto de Calendula activado con laser).
Los mecanismos de esta inhibición fueron identificados como la detención del ciclo de la célula e
inducción del apoptosis. Además, el extracto del LACE presentó actividad anti-tumoral in vivo en
ratones.

Métodos

Preparación del extracto de Calendula (LACE)

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El extracto acuoso de los officinalis de Calendula (LACE) fue obtenido sujetando la flor de esta planta
al proceso patentado siguiente (EP 1 del n° de la patente 339 420 B1). Primero, las flores fueron
lavadas con agua y pulverizadas por métodos convencionales. Las flores fueron tratadas con la
radiación de laser en una longitud de onda de 650 nanómetros durante 15 minutos, seguidos por la
suspensión de 100 a 250 g de la planta laser-tratada en 1 L de agua. La suspensión fue puesta en una
plataforma oscilante en 4°C por 7-15 días y tratada periódicamente con el laser durante este período.
Entonces, la fase líquida fue separada del sólido, un extracto acuoso ocre-coloreado fue obtenido y
almacenado en un congelador en -70°C. Un segundo extracto acuoso de Calendula Officinalis fue
obtenido después de un proceso idéntico pero sin el tratamiento del laser (extracto, CE del calendula).

Para los análisis, el extracto fue concentrado al estado seco en un liofilizador, la preparación secada
fue homogenizada en medio de cultivo en la concentración de 10 mg/ml (solución común), y filtrada a
través de 0.45 Millipore del μM.

Variedades de células y cultura de célula

Las variedades de células siguientes del tumor fueron utilizadas: B16 melanoma murine, B9
fibrosarcoma MCA-inducido murine, ANDO-2 melanoma humano, cáncer de pecho humano de MDA
MB231, cáncer gástrico humano de AGS, cáncer humano de la próstata DU-145, cáncer de pulmón
humano A-549, carcinoma pancreático humano del cáncer, de los dos puntos DLD1, adenocarcinoma
cervical humano HeLa, U937 monocytic y leucemias del linfoma de Jurkat T, y NKL de IMIN PC-1, que
fue establecido de PBLs de un paciente con la leucemia de LGL [20]. Todas las variedades de células
fueron obtenidas de la colección de tipo americano de la cultura (Manassas, los E.E.U.U.) a excepción
de la variedad de células B9, que fue generada en nuestro laboratorio, y el Ando 2, IMIM las
variedades de células de PC-1, y de NKL, proporcionó amablemente por P. Coulie (unir a de Genetique
Cellulaire, universidad de Louvain, Bruselas, Bélgica), F.X. Verdadero (Instituto Municipal de
Investigaciones Medicas, Barcelona, España), y el Dr. M. Lopet-Botet (Universidad Pompeu-Fabra,
Barcelona, España), respectivamente. Las variedades de células derivaron de tumores sólidos fueron
crecidas en 37°C en una atmósfera humedecida del CO2 del 5% en el medio de cultivo de DMEM
(Gibco, Paisley Reino Unido) suplido con el suero vacuno fetal calor-hecho inactivo el 10% (vida
Technologics, Milano Italia), los antibióticos, y el glutamine. Las células de la leucemia de U937 y de
JURKAT fueron cultivadas en RPMI. La variedad de células de NKL fue cultivada en RPMI 1640 con el
suero humano calor-hecho inactivo el 10% del AB (producto químico de la sigma, St. Louis, MES; Los
E.E.U.U.) e IL-2 recombinant humano (1000 U/ml; el purity>97%, actividad específica, 2 × 106
U/mg) (Roche, Nutley, NJ; Los E.E.U.U.).

Análisis de la proliferación del linfocito

Los linfocitos humanos fueron aislados de sangre venosa con método de la separación de Ficoll-
Hystopaque. La proliferación de PBLs era analizada in vitro usando el etiquetado del deoxyuridine de 5
bromo-2'- (BrdU) de células de DNA-sintetización con el kit colorimétrico de la proliferación de la
célula de ELISA de Brdu, (diagnóstico de Roche). PBLs fue sembrado en 96 placas del well-
microculture en una densidad de la célula 5 del × 104 por pozo. Una curva de la dosis/de respuesta
fue realizada usando diversas concentraciones del LACE o del CE (2 mg/ml a 15 μg/ml). El
Concanavalin A (5 μg/ml, la sigma) e IL-2 fueron utilizados como control positivo. Después de 48 h de
cultura en presencia o la ausencia del LACE, el reactivo de etiquetado de BrdU (μM final de la
concentración 10) fue agregado y las células fue cultivado durante 24 h, entonces las células eran fijas
por 30 minutos e incubado con el anti-BrdU para 1 h en el μl 37°C. 100 del tetramethyl-benzidine
(TMB) fue utilizado como substrato. Las densidades ópticas fueron determinadas en 370 nanómetro
usando a un lector del microplate de ELISA (Biotek, Energía-Agita XS). Los controles eran: el medio,
las células cultivadas solamente en medio y las células de cultivo incubaron con el anti-BrdU en la

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ausencia de BrdU. Todos los experimentos fueron plateados en pozos triplicados y realizados por lo
menos tres veces.

Análisis ines vitro de la citotoxicidad

El efecto del LACE o del CE en la proliferación de la célula tumoral fue determinado midiendo la
incorporación de BrdU con el kit descrito arriba. Las células fueron plateadas en 96 placas bien del
microculture (5 células del × 103/bien). Después de 24 h de la cultura en 37°C, una dosis/la curva de
respuesta fue realizada como se describe anteriormente. Cada 48 h, el medio de cultivo fueron
substituidos y el LACE o el CE fue agregado. Después de 48-96 h BrdU el reactivo de etiquetado fue
agregado y cultivado para 1-3 análisis más del H. también fueron realizados contando las células
viables usando la exclusión del azul Trypan. Brevemente, las variedades de células del cáncer fueron
sembradas en el tejido-frasco de la cultura (1.5-2 tejido-frasco del × 105/culture) o 6 placas bien
(células de NKL) e incubadas para 24 h en 37°C en una atmósfera humedecida del CO2 del 5%. Las
células entonces fueron tratadas con 250 μg/ml del LACE en el medio de cultivo, que fue substituido
cada 48 H. Después de 4-6 días, las células fueron recogidas por la centrifugación y una muestra
pequeña de la suspensión de la célula fue diluida en 0.4% azul Trypan y las células fueron contadas en
un compartimiento del hemocitómetro. Cada muestra de la célula fue contada de esta manera por lo
menos tres veces y cada análisis fue repetido por lo menos tres veces.

Análisis de la distribución del ciclo de la célula

Brevemente, las células fueron plateadas en seis placas bien (5 × 105 por pozo) o en el tejido-frasco
de la cultura (15 × 105) y expuestas continuamente para 4 días a 250 μg/ml del LACE. El índice de la
síntesis de la DNA fue examinado por un método de la incorporación de BrdU usando el kit del flujo de
FITC BrdU (BD Pharmingen) según las instrucciones del fabricante. BrdU después fue detectado
usando un método con el tratamiento de la célula de DNasa y FITC-conjugó el anticuerpo del anti-
BrdU. Las células fueron lavadas con 1 ml de 1 almacenador intermediario de la ondulación
permanente/de la colada del × BD y el μl 20 7 del amino-actinomycin D fue agregado. El análisis fue
realizado con 50000 células usando cytometer del flujo del software y de FACScan de la búsqueda de
la célula (Becton-Dickinson).

Análisis de la expresión de los cyclins y de los kinases cyclin-dependientes

(CDKs)

Las variedades de células AGS y JURKAT fueron expuestas al LACE de 250 μg/ml durante 96-144
horas. Las células fueron lavadas con PBS y permeabilized con Citofix/Citoperm 30 minutos a 4°C,
incubaron con el anti-cyclin D1 y los anticuerpos de E (BD Pharmigen) y finalmente yoduro del
propidium fueron agregados. Las células eran analizadas por inmunofluorescence según lo mencionado
arriba.

El análisis occidental de la mancha blanca /negra fue realizado para el análisis de CDK (CDK1/Cdc2,
CDK2, CDK4, CDK6) y los cyclins (A, B y D3). La extracción de TransFactor del kit (biociencias de BD)
fue utilizada para extraer las proteínas enteras. Las muestras de la proteína fueron separadas por
SDS/PAGE (el 10%) y después electroblotted sobre una membrana del difluoride del polyvinylidene (el
kit, mini Transporte-Borra la célula Electrophoretic de la transferencia; Bio-Rad). Las membranas
fueron saturadas con leche seca sin materias grasas del 5% en TBST (25 milímetros Tris HCl, 140
milímetros de NaCl y 0.1% Tween 20) y después incubadas con anti-CDK1/Cdc2, los anticuerpos de
CDK2, de CDK4, de CDK6, del cyclin A, del cyclin B y del cyclin D3. El contra-Ratón IgG-HRP
(biociencias Pharmingen de la cabra de BD) fue utilizado como el segundo anticuerpo. Las membranas

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fueron lavadas a fondo con TBST e incubadas por 5 a 30 minutos con la solución colorimétrica, Opti-
4CN (Bio-Rad, Madrid, España).

Análisis obligatorio de Annexin V para detectar las células apoptotic

Después del tratamiento de las células de cáncer con el LACE por cuatro días, las células fueron
separadas del tejido-frasco de la cultura con PBS que contenía el EDTA de 3 milímetros. Estas células
después fueron recogidas junto con las células flotantes, lavadas dos veces con PBS frío, y
suspendidas de nuevo en almacenador intermediario obligatorio en una concentración de 1 × 106cells
por el ml. el μl 100 de la solución fue incubado por 30 minutos en 4°C con el μl 5 del anticuerpo de
Annexin V-PE (biociencias de BD), y el μl 5 de 7 D amino-actynomycin entonces fue agregado. Las
células fueron incubadas por 15 minutos en oscuridad, y el μl 400 de manchar el almacenador
intermediario fue agregado antes de análisis cytometry del flujo.

Análisis para la expresión activa caspase-3

El anticuerpo monoclonal conjugado FITC anti-active-caspase-3 (biociencias de BD) fue utilizado para
determinarse si el protease Caspase-3 estuvo implicado en el apoptosis inducido por LACE. Después
del tratamiento con el LACE por 4 días, las células de cáncer fueron lavadas dos veces con PBS frío y
fijadas y permeabilized en almacenador intermediario de Cytofix/Cytoperm. Entonces, las células
fueron incubadas con el conejo monoclonal FITC-conjugado que el anticuerpo contra-activo human-
caspase-3 para 30 células mínimas fue lavado dos veces y el μl 500 de 1 almacenador intermediario
de la colada de la ondulación permanente del × fue agregado antes de análisis por el flujo cytometry.

Análisis ines vivo de la toxicidad

Para los estudios ines vivo, 6 immunocompetent - a 8 semana-viejos Balb/c, los ratones de C57/BL6 y
de CBA y 3 mes-viejas ratas de Wistar fueron obtenidos del centro animal de nuestra institución. El
peso malo de ratones y de ratas era 20 g y 150 g, respectivamente. Los animales fueron contenidos
en las cajas plásticas alambre-rematadas guardadas en 12 un ciclo oscuro de la hora de la hora
light/12 bajo condiciones patógeno-libres. Todos los estudios de los animales fueron realizados según
las pautas aprobadas por nuestra institución. Los animales fueron divididos aleatoriamente en los
grupos de 10 ratones o ratas. El extracto del LACE (0.2 ml) fue administrado oral por la cánula
diariamente para 5 semanas y el grupo de control fue tratado semejantemente con 0.2 ml de agua.
Las concentraciones del LACE usadas eran: 11 mg/kg/día, 55 mg/kg/día, 550 mg/kg/día, y 2750
mg/kg/día. Después de 4 semanas del tratamiento, los animales fueron mantenidos para 4 semanas
bajo condiciones estándares y el diario determinado para (alopecia, reacción de la piel y motility de la
pierna) la toxicidad systemic (apatía, pérdida del peso) o local.

Efecto del LACE en crecimiento sólido del tumor en ratones desnudos

Los ratones desnudos de Athymic 6 semanas fueron obtenidos del río de Charles (CRL, Barcelona) y
todos los estudios de los animales fueron realizados según las pautas aprobadas por nuestra
institución. La variedad de células humana ANDO-2 (5 células del melanoma del × 106) fue inyectada
subcutáneo en el cojín trasero del pie de ratones. Cuando los tumores se convirtieron en cerca de una
semana visible después de la inyección, los animales fueron seleccionados al azar en seis grupos:
LACE-oral tratado (50 mg/kg de peso), LACE-intraperitoneal tratado (25 mg/kg de peso), taxol-
intraperitoneal tratado (5 mg/kg de peso), control, controles trató con la solución salina por la ruta
oral o intraperitoneal. El LACE fue administrado oral tres por una semana durante 12 semanas, ruta
intraperitoneal del LACE dos veces una semana durante 9 semanas y el taxol fue administrado
intraperitoneal dos veces una semana durante tres semanas. Todos los productos en primer lugar

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fueron administrados en el día 8 después de la inyección de las células. El crecimiento del tumor (o el
diámetro largo del tumor) fue supervisado con los calibradores tres veces a la semana que medía el
diámetro largo del tumor. Se expresan los resultados como tamaño malo de tumores de cada ± SD del
grupo. Compusieron a cada grupo de 10 ratones y los análisis fueron realizados por lo menos tres
veces. Una comparación del porcentaje de la supervivencia entre el grupo tratado y de control fue
realizada.

Resultados

El extracto del LACE ejerce actividad mitogenic en PBLs

Un estudio completo de la dosis-respuesta fue realizado para determinar la acción del LACE o del CE en PBLs humano,
plateando 5 células del × 104 en una placa del tejido fino de 96 pozos para 48-72 h con una de 8 concentraciones del
extracto como sigue: n° de la concentración 8 = 2 mg/ml, n° 7 de la concentración = mitad del n° 8 de la concentración,
y así sucesivamente sucesivamente a un n° 1 de la concentración de 15.62 μg/ml, con las células de representación del n°
0 de la concentración cultivadas en solo medio. El figura 1a representa las absorbencias cuando PBLs fue incubado con el
extracto del LACE, demostrando un aumento significativo en la proliferación de PBLs en las concentraciones del extracto
de 125-500 μg/ml. La proliferación inducida por LACE era 3 cinco veces a mayor que en el control, alcanzando el 30% del
nivel de la proliferación inducido por Concanavalin A y el 50% de la proliferación inducida por IL-2 (figura 1a). Si los
resultados de la proliferación de PBLs se expresan como índice del estímulo (SI: la absorbencia de linfocitos tratados se
dividió por control de la absorbencia o linfocitos sin estimular): SILACE = 2.5, SIIL2 = 4.4, SIconA = 6.5.

Interesante, el LACE indujo la proliferación sin el estímulo anterior de PBLs. Cuando estos análisis eran el usar realizado el
extracto no laser-tratado del calendula, CE, los resultados de la absorbencia era prácticamente idéntico, indicando que
ambos extractos producen un aumento similar en la proliferación de PBL (datos no demostrados). Los componentes
químicos principales de los extractos acuosos de Calendula Officinalis son: polisacáridos, proteínas, ácidos grasos,
carotenoids, flavonoids, triterpenoids y saponins (datos no demostrados).

El extracto del LACE inhibe la proliferación in vitro de la célula tumoral

Las variedades de células exponencial cada vez mayor (2.5-5 células del × 103) fueron expuestas a concentraciones de
aumento del LACE o del CE para 48-72 h en 96 placas bien del tejido fino como se describe anteriormente, y a una curva
de la dosis/de respuesta fueron realizadas. La figura 1b representa resultados de la absorbencia cuando las células
murine del fibrosarcoma B9 fueron cultivadas con el extracto del LACE. Estos resultados demostraron una disminución
significativa de la absorbencia, principalmente en la gama de la concentración de 125 - 500 μg/ml, con una concentración
IC50 de 60 μg/ml. Los resultados similares fueron encontrados para HELA y Ando 2 variedades de células (datos no
demostrados). Cuando estos análisis fueron realizados con el extracto no laser-tratado del CE, la disminución de la
absorbencia era notablemente más pequeña (figura, 1b). Estos resultados indican que el extracto del CE produjo
perceptiblemente menos inhibición de la proliferación de la célula tumoral en comparación con el extracto del LACE.

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A. PBLs eran cultivado en medio solo o con

varias concentraciones de extracto de LACE
de 2 mg/ml (conc. 8) a 15.62 g/ml (conc.
1) para 72 h.

B. Para células de tumor B9 eran cultivado

con la cultura concentraciones medias solas
o varias de LACE O CE para 72 h. Cada
columna representa el tacaño de cinco
experimentos independientes ± SD.

Figura 1
El efecto de respuesta de dosis de LACE extrae en PBLS y B9 fibrosarcoma murine la línea de célula.

Después de estos análisis de la investigación, el extracto del LACE fue utilizado en otros experimentos
en una concentración de 250 μg/ml. Los resultados fueron obtenidos semejantemente cuando otras
variedades de células estudiadas del tumor fueron cultivadas con 250 μg/ml del LACE (una disminución
de la absorbencia fue observada con respecto a las células untreated) (figura 2). Paclitaxel (Taxol) fue
utilizado como control en estos experimentos, rindiendo resultados similares a ésos obtenidos con el
LACE (figura 2). La variedad de células de la leucemia de NKL era la excepción, puesto que el
tratamiento con el extracto del LACE indujo un aumento en la proliferación. Debe considerado que las
células de NKL son dependientes en IL-2 para su crecimiento y el LACE e IL 2 inducen niveles similares
de la proliferación.

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Figura 2
Efecto de LACE en proliferación de
líneas de célula de cáncer
diferentes. El MDA MB231, B16,
ANDO-2, JURKAT, B9 y líneas de
célula de tumor NKL fue tratado o no
con 250 g/ml de LACE para 72-96 h.
MDA MB231 y ANDO-2 también fueron
tratados con Taxol. Cada columna
representa el tacaño de cinco
experimentos independientes ± SD..

La correlación entre las densidades ópticas y el número de células viables era analizada, cultivando 1-
2 células del tumor del × 105 en tejido-frasco en solo medio (control) o con 250 μg/ml del LACE por 4-
6 días. Según las indicaciones de la tabla 1, había una disminución significativa del número final de
células viables, con una inhibición del crecimiento de 70-100% contra las células del control, a
excepción de la variedad de células tratada U937 de la leucemia, que demostró una inhibición del
crecimiento de el 21%. Debajo de un microscopio invertido del contraste de la fase, las células LACE-
tratadas del tumor demostraron cambios morfológicos: morfología redondeada y granulada, algunas
vacuolas que vienen del citoplasma, contracción de la célula y separado de las placas de la cultura de
un alto número de células. Estos cambios morfológicos no fueron observados en los linfocitos tratados
con el LACE.

Análisis de la distribución de la fase del ciclo de la célula de células tratadas

Las células fueron encontradas acumuladas en la fase de G2/M (88.55%) cuando PBLs fue cultivado en
solo medio. Sin embargo, cuando PBLs fue cultivado con la adición del LACE de 250 μg/ml, las células
volvieron a entrar el ciclo de la célula, apareciendo en la fase de S (figura 3). En cambio, cuando una
variedad de células del tumor, e.g., AGS, fue cultivada en solo medio, células estaba en el ciclo de la
célula (34.68% G0/G1, 28.66% S, y 17.67% G2/M), y cuando el extracto del LACE de 250 μg/ml fue
agregado, las células demostraron una acumulación significativa en la fase G0/G1 (52.93% de células)
a expensas de la población de la fase de S (figura 3). Los resultados similares fueron encontrados en
las células de Jurkat, donde estaba 71.45% el porcentaje de células LACE-tratadas en la fase G0/G1
(figura 3). Sin embargo, en otras variedades de células del tumor, e.g., células HELA, el retardarse
más bien que una detención del ciclo de la célula fueron observados, con una acumulación parcial de
las células en la fase de G0 /G1 (figura 3). Las fracciones de células en las variedades de células
estudiadas del tumor se enumeran en la tabla 2.

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Figura 3
Análisis de ciclo de Célula de células
trató con el LACE. PBLs fueron
tratados con el LACE para 96 h, y las
células fueron analizadas por el flujo
cytometry. Asimismo las líneas de célula
de tumor fueron tratadas con el LACE
para 96 h. Los datos indican el
porcentaje de células en cada fase de
ciclo de célula. Los resultados son
representativos de tres experimentos
independientes.

El LACE inhibe niveles de la expresión de CDKs- y cyclins-asociado a la fase G1

Hemos encontrado la detención del ciclo de la célula G1 en las células tratadas con el LACE. Los cyclins
D1 y E son regulador importante de la progresión a través de la fase G1 y entrada en fase de S. Las
células de AGS y de JURKAT fueron tratadas con el LACE durante 96-144 horas. Después de este
período, una disminución de la expresión de estas proteínas fue detectada por la inmunofluorescencia
(figura 4a). Las células de JURKAT cultivadas en medio solo presentan una expresión del cyclin D1 y E
de 36.41% y 87.44%, respectivamente; cuando estas células fueron cultivadas con el LACE la
disminución de la expresión del cyclin D1 a 0.88% y la expresión del cyclin E a 22.09% (figura 4a).
Los resultados similares fueron encontrados en variedad de células del tumor de AGS, así que las
disminuciones de la expresión del cyclin D1 de 34.56% a 4.11% y las disminuciones de la expresión
del cyclin E de 72.01% a 2.01% (figura 4a).

Los análisis occidentales de la mancha blanca /negra de los lysates totales de la célula demostraron
una disminución de los niveles de la proteína de CDK1/Cdc2, de CDK2, de CDK4, de CDK6, del cyclin A
y del cyclin D3, en las células LACE-tratadas (figura 4b). La expresión del cyclin B era ningún alterado
en respuesta al LACE (figura 4b).

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Figura 4
Efecto de CORDÓN sobre cyclins y CDKS. Las
líneas de célula AGS y JURKAT eran cultivadas en
el medio solo o trataron con el CORDÓN. a) el
Flujo cytometric el análisis fue realizado para la
expresión de cyclins D1 y la E. El extracto de
CORDÓN produjo una inhibición fuerte de
expresión de ambos cyclins. b) los análisis de
mancha occidentales mostró que el CORDÓN
producido la abajo-regulación de cyclins D3 y un
y CDK1/CDC2, CDK2, CDK4, CDK6. La expresión
de B cyclin no fue modificada

El LACE induce apoptosis en células del tumor

El tratamiento de las células de cáncer con el LACE condujo a la generación de una población sub-G1
sugestiva de apoptosis. Para examinar cuantitativo la capacidad del LACE de inducir apoptosis, las
células de cáncer fueron tratadas con 250 y 1000 μg/ml por 4 días. Las células de cáncer que eran
untreated o tratadas por 4 días fueron incubadas con el anticuerpo de Annexin V-PE en un
almacenador intermediario que contenía 7 el amino-actinomycin D y analizadas por el flujo cytometry.
Apoptosis de las células B9 aumentó a partir del 4.32% en las células cultivadas en medio solamente a
34.47% en ésos cultivados con 250 μg/ml del LACE, y a 60.39% en ésos cultivados con 1 mg/ml de
LACE (figura 5). Los resultados similares fueron encontrados en las otras variedades de células del
tumor (tabla 3). En cambio, el LACE no produjo apoptosis en PBLs (figura 5).

Figura 5
Apoptosis inducido por LACE. B9 la línea
de célula fue intratado o tratado con 250
g/ml o 1 mg/ml de LACE para 96 h. Las
células eran dobles manchadas con la V
annexin y 7AAD y analizaron por el flujo
cytometry. PBLs también fueron analizados y
el extracto de LACE no produjo apoptosis.
Todos los experimentos fueron realizados al
menos tres veces y dieron resultados
similares.

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Expresión del ser humano activo caspase-3

Puesto que los caspases son las enzimas principales implicadas en el camino apoptotic, fue investigado
si caspase-3 activo estuvo implicado en apoptosis LACE-inducido. Así, las variedades de células del
cáncer fueron tratadas con el LACE por 4 días, y las células eran después permeabilized, fijaron, y se
mancharon para el ser humano activo caspase-3 y analizado por el flujo cytometry. En el caso de
variedad de células de AGS, los resultados ilustraron claramente que las células untreated eran sobre
todo negativas para la presencia de active-caspase-3, mientras que el alrededor 40% de células LACE-
tratadas demostraron caspase-3 activo perceptible (figura 6). La expresión de caspase-3 activo
también fue detectada en otras variedades de células del tumor, mientras que algunas líneas, e.g.,
HELA, no demostraron ninguna expresión caspase-3 después del tratamiento del LACE (figura 6).
Estos resultados indican que el apoptosis en células HELA no fue inducido por caspase-3. En PBLs,
según lo esperado, el tratamiento del LACE no indujo la expresión caspase-3 (figura 6).

Figura 6
Flujo cytometric análisis de poblaciones
apoptotic que usan caspase antiactivo 3
anticuerpo. AGS y líneas de célula de tumor
HELA fueron tratados con 250 g/ml o 1
mg/ml de LACE. Los datos indican el
porcentaje de células positivas para la
presencia de active-caspase-3. Los resultados
son representativos de tres experimentos

Subpoblaciones de PBL activadas por LACE

También analizábamos a subpoblaciones de PBL que proliferaron después del tratamiento del LACE. El
cuadro 6 representa resultados representativos de las subpoblaciones de PBL tratadas con el LACE de
250 μg/ml para 72-96 H. En el control PBLs, las subpoblaciones eran 46.27% CD4+, 10.91% CD19+ y
4.94% CD56+/CD3+. Después del tratamiento del LACE, estas poblaciones aumentaron
perceptiblemente a 59.15% CD4+, a 37.71% CD19+ y a 92.24% CD56+/CD3+ (figura 7). Por lo
tanto, las células en la proliferación eran principalmente linfocitos de B, linfocitos de CD4+ T, y
linfocitos de NKT. Los marcadores activados del CD de linfocitos (e.g., HLA-DR y CD69) fueron
expresados por las subpoblaciones del linfocito que proliferaron con el tratamiento del LACE (figura 7),
indicando que estos linfocitos fueron activados.

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Figura 7
El análisis subdemográfico en PBLS trató
con el LACE. PBLs trató o no con el LACE fueron
analizados y los resultados indican un aumento
de CD4, CD19, y células CD3-CD16-CD56
positivas. Este experimento fue repetido al
menos tres veces y dio resultados similares.

Toxicidad del extracto del LACE en ratones y ratas

Después de que las actividades ines vitro antedichas del LACE fueran establecidas, la investigación de
su toxicidad in vivo era el paso siguiente. En un estudio preliminar, los ratones de Balb/c, de C57/BL6,
y de CBA fueron administrados oral con 11 o 55 mg/kg del peso corporal de LACE diario para 30 días
consecutivos y ningunas muertes fueron observados durante este período. No se observó ningunas
diferencias en toxicidad systemic o local entre los grupos y los controles LACE-tratados, aunque un
aumento de la dosis a 550 mg/kg del peso corporal dio lugar a una reducción del 50% en la
supervivencia de 15 días de estos ratones (LD50) (datos no demostrados). En la autopsia, los
animales exhibieron toxicidad hepática. El LACE también fue administrado oral a las ratas en una dosis
de 11, 55 y 550 mg/kg del peso corporal diario por 30 días consecutivos, y no se observó ningunas
muertes o aumentos en toxicidad systemic o local. Sin embargo, cuando la dosis diaria era 2750
mg/kg del peso corporal, el 50% de ratas murieron por el día 15 (LD50) (datos no demostrados).
Después de 30 días del tratamiento, los ratones y las ratas el sobrevivir fueron mantenidos bajo
condiciones estándares y su mortalidad fue registrada en el tratamiento del poste de 90 días. Durante
este período, no se observó ningunos efectos secundarios tóxicos, e.g., debilidad, pérdida de peso
corporal o muerte.

Efecto anti-tumor in vivo del LACE

Hemos establecido en nuestro laboratorio un modelo sólido del tumor con los ratones desnudos que
llevaban variedad de células humana del melanoma ANDO-2. Investigamos después el efecto del LACE
en este modelo del tumor. Los ratones administrados con la ruta del LACE, oral (50 mg/kg de peso) o
intraperitoneal (25 mg/kg de peso), demostrada la inhibición similar del crecimiento del tumor
alcanzaron al cerca de 60% (figura 8a). Los resultados similares fueron encontrados con Taxol (figura
8a). No había diferencias entre los diversos grupos de control. Los ratones untreated demostraron que
ocurrió un aumento progresivo rápido en volumen del tumor en el día 49 mientras que en grupos trató
con el LACE o Taxol después el día 90 (figura 8a).

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A. no había las diferencias entre los grupos de

control diferentes, mientras el LACE inducido la
inhibición de crecimiento de tumor alcanzada a
aproximadamente el 60 %. El Eje de
ordenadas representa el diámetro de tumor
largo y el Eje de abscisas representa el tiempo
(el día) después ANDO-2 la inyección de célula.
Cada punto de datos representa ± tacaño SD
de tres experimentos independientes.

B. Efecto de LACE en tiempo de

supervivencia. La supervivencia de
porcentaje fue calculada como: La
supervivencia de % = el número de ratones de
supervivencia en la prueba agrupa/numera de
ratones en el grupo. Los datos son
representativos de tres experimentos
independientes.

Figura 8
Efecto del LACE en el crecimiento de ANDO-2 en ratones desnudos

Por otra parte, la supervivencia de ratones en grupos LACE-tratados fue supervisada y comparada a
los grupos de control. En el final de análisis, la supervivencia estaba: el 0% en grupos de control, el
75% en grupo LACE-oral, el 60% en grupo LACE-intraperitoneal y el 40% en el grupo del taxol (figura
8b).

Tabla 1

Efecto del LACE sobre inhibición de crecimiento en líneas de célula de tumor

Celula No . (×104)
Inicial Control LACE Inhibición

B16 25 440 120 76%

B9 12 120 29 72%
MDA MB231 20 50 20 100%
ANDO 2 20 32 20 100%
AGS 15 36 15 100%
DU 145 15 40 22 72%
HELA 15 25 16 90%
IMIN PC1 15 35 15 100%
A549 16 56 16 100%
DLD1 15 104 30 83%
U937 10 94 78 21%
JURKAT 20 34 20 100%

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Estos resultados representan tres experimentos independientes.

Discusión

El encontrar principal del actual estudio es la eficacia anticáncer in vitro de un extracto de la novela
obtenido de Calendula Officinalis contra las varias variedades de células del cáncer derivadas de los
tumores sólidos humanos o murine de diversas etiologías. En algunos casos, este extracto, LACE,
alcanzó la inhibición 100% del crecimiento (figura 2, tabla 1). Importantemente, este efecto de la
inhibición se ejerce en las células del tumor de diversos tumores sólidos y no es específico a un solo
tejido fino de la célula tumoral. La inhibición in vitro del crecimiento del extracto del LACE era similar a
ésa divulgada para Taxol en las variedades de células del tumor [21], según las indicaciones del
cuadro 2.

Los componentes químicos principales de los extractos acuosos de Calendula Officinalis son:
polisacáridos, proteínas, ácidos grasos, carotenoids, flavonoids, triterpenoids y saponins. Los
componentes de los carotenoids se pueden excitar por la radiación visible. El tratamiento del laser del
extracto del calendula es necesario detectar esta actividad biológica. Un extracto similar sin el
tratamiento del laser, CE del calendula, produjo solamente una inhibición leve del crecimiento de la
célula tumoral (figura 1b). El aumento en esta actividad biológica es debido al tratamiento con la
radiación de laser, que puede inducir cambios, la excitación o la degradación del conformational de
diversas moléculas del extracto del CE.

Los estudios se realizaron para determinar los mecanismos implicados en los efectos ines vitro
antedichos demostraron que el LACE indujo la detención del ciclo de la célula en G0/G1 (figura 3 y
tabla 2). Además, la investigación mecánica demostró que la detención LACE-inducida G1 medió
principalmente vía una abajo-regulación de los cyclins D1, D3, E y A, y CDK1-Cdc2, CDK2, CDK4 y
CDK6 (figura 4). Estos datos de la novela pueden tener importancia clínica, puesto que la mayoría de
los malignancies humanos exhiben aberraciones en la regulación del ciclo de la célula [22]. De hecho,
la mayoría de los agentes anticáncer derivados de las plantas ejercen su efecto vía la inducción del
apoptosis en las células de cáncer [23-25]. Los actuales datos demostraron que el LACE induce muerte
apoptotic y que el índice del apoptosis aumente con concentraciones más altas del LACE (figura 5,
tabla 3). La inducción del apoptosis implicó mecanismos de caspase-3-dependent en alguno pero no
todas las variedades de células del tumor (figura 6), sugiriendo determinantes moleculares
diferenciados de la inducción del apoptosis en diversas variedades de células del tumor.

En variedades de células de la leucemia, el tratamiento del LACE inhibió 100% del crecimiento en las
células de Jurkat y el solamente 20% de crecimiento en las células U937, que se pueden explicar por
el diverso origen del linfoma de las células (y monocytic, respectivamente) y/o el índice de crecimiento
mucho más alto de las células U937, que doblan en gran número en menos de 24 H. interesante, LACE
indujeron la proliferación de las células de la leucemia de NKL (figura 2). La variedad de células de
NKL es dependiente en IL-2 para su crecimiento in vitro [20], indicando que es en la fase de la
detención del ciclo de la célula. El tratamiento con IL-2 o el LACE produce reingreso del ciclo de la
célula y valores similares de la proliferación en las células de NKL (figura 2). Asimismo, un compuesto
aislado del coriolus fungoso - el versicolor, polisacárido Protein-bound K (PSK), también induce la
proliferación de las células de NKL en la ausencia de IL-2 [26]. PSK ha demostrado actividad
anticáncer in vitro en modelos experimentales y en los ensayos clínicos humanos [27.28]. Estas
actividades anti-tumor se pueden atribuir en gran parte a la activación de las células de NK [29.30].

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El segundo encontrar de la novela de este estudio es que el tratamiento del LACE induce la
proliferación y la activación de PBLs humano (figura 1 e figura 7). El extracto del CE, sin el tratamiento
del laser, también produce un aumento similar en la proliferación de PBL. PBLs, que no proliferan in
vitro y se encuentran en la detención de G2/M, volvió a entrar el ciclo de la célula con el tratamiento
del LACE (figura 3).

Las subpoblaciones de PBL en proliferación LACE-inducido eran CD4 +, CD19 + y principalmente

CD3+/CD16/56 + (Fig. 7). El último corresponde a células de NKT que se han mostrado para reclutar
y promover una contestación por effectors río abajo de una manera IFN-.-dependiente mientras
activando NK y CTL anti-tumor actividad [31,32]. Estos datos, considerados junto a la actividad del
cytotoxic de extracto del LACE en tumor las líneas celulares, indican que podría tener las propiedades
del anticancer en vivo. De hecho, los resultados preliminares de nuestro laboratorio indican que ese
LACE puede inhibir el crecimiento de células de tumor de ratón en vivo (resultados inéditos).
Resultados obtenidos con Pals y células de NKL indican que las células en arresto de ciclo de célula
reentran en ciclo de la célula con tratamiento del LACE. El tratamiento del LACE produce la fase el G1
célula ciclo arresto en células del tumor en ciclo de la célula en contraste, (Fig. 3). La investigación
extensa se exige para determinar si un solo principio activo es responsable para este dual en actividad
del nitro. La purificación de extracto del LACE es en marcha identificar sus principios activos. Un
hallazgo extenso de este estudio era el bajo en toxicidad del vivo de este extracto.

El LD50 para el LACE oralmente administrado era 550 peso del cuerpo de MG / Kg. en ratones y 2750
peso del cuerpo de MG / Kg. en ratas. Notablemente, la actividad del antiproliferative de LACE no fue
acompañada por toxicidad sistémica en ratones o ratas a una dosis de 50 peso del cuerpo de mg / kg.
El extracto del LACE mostró en actividad de anti-tumor de vivo en ratones desnudos, el crecimiento de
tumor de Ando-2 estaba reducido en un 60% (Figura 8). La eficacia del anti-tumor de LACE era
similar a obtuvo con otra droga de la quimioterapia normalmente usada, paclitaxel. Además, LACE
produjo prolongación más alta de vida en ratones tumor-productivos (Fig. 8).

Los resultados del estudio presente están animando porque LACE ha mostrado inhibición significante
de crecimiento del tumor en vitro y por consiguiente en vivo, LACE o algunos componentes podrían ser
un candidato de la quimioterapia prometedor tratando los cánceres en clínica. Los experimentos
extensos se centrarán en purificación estudia y el en la eficacia del vivo de LACE en otros modelos de
cáncer de ratón experimentales.

Conclusión

LACE extract have demonstrated in vitro growth inhibition of various tumor cell lines. This is due to
induction of cell cycle arrest and apoptosis. In contrast, it induced proliferation and activation of PBL
cells. In addition, LACE present anti-tumor activity in vivo in nude mice.

El extracto de LACE se ha manifestado en la inhibición de crecimiento vitro de varias líneas de célula

de tumor. Esto es debido a la inducción de detención de ciclo de célula y apoptosis. Al contrario esto
indujo la proliferación y la activación de células PBL. Además, el LACE presenta la actividad de
antitumor en vivo en ratones desnudos.

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Tabla 2

Las fracciones de células en las fases específicas del ciclo de célula después de cultura de líneas de
célula de cáncer en presencia o ausencia de LACE.
DEAD G2 S G1
AGS control 5.77% 17.67% 28.66% 34.68%
AGS LACE 12.24% 16.69% 0% 52.93%
A549 control 9.35% 13.43% 32.13% 29.55%
A549 LACE 8.94% 12.03% 3.40% 44.46%
Jurkat control 22.45% 6.60% 30.59% 26.70%
Jurkat LACE 11.61% 1.42% 0% 71.45%
HELA control 6.59% 14.24% 19.05% 48.58%
HELA LACE 14.77% 9.34% 15.31% 52.19%
B16 control 18.42% 6.13% 27.57% 33.84%
B16 LACE 10.98% 6.21% 4.57% 57.46%
Los resultados son para un experimento típico fuera de tres realizados.

Tabla 3

Apoptosis inducción en líneas de célula de cáncer después de tratamiento con LACE durante 4 días.

Control LACE 250 μg/ml LACE 1000 μg/ml

B9 4.32% 34% 60.39%

HELA 11.26% 20.32% 56.74%
A549 13.41% 28.84% 36.40%
AGS 20.46% 43% 60%
JURKAT 6% 10.71%

Este ensayo fue repetido al menos tres veces, produciendo resultados similares

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