PRÁCTICANo.

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PROPIEDADES CATALITICAS DE LAS ENZIMAS

1. OBJETIVO

Demostrar que las enzimas tienen condiciones óptimas para realizar su función como
catalizadores biológicos

2. INTRODUCCIÓN

El proceso digestivo se realiza sobre los alimentos para su degradación en moléculas más
sencillas que puedan ser absorbidas y transportadas para su utilización celular. Dicho
proceso tiene lugar en diferentes partes del tubo digestivo, y se lleva a cabo por diferentes
clases de enzimas que actúan sobre los componentes de la dieta. El primero en actuar es
la -amilasa salival, que degrada almidones en una mezcla de dextrinas y carbohidratos
más sencillos, pudiendo llegar según el nivel de actividad a maltosa o glucosa. El
contenido de -amilasa en saliva varía entre 0 y 3 mg/ml, existiendo individuos que no
poseen tal actividad.
Las enzimas por sus características proteicas funcionan con base en el principio del
reconocimiento molecular, así, poseen sitios activos específicos que se unen íntimamente
al sustrato.

El estudio de la velocidad de las reacciones y el mecanismo de las reacciones es estudiado

por la Cinética enzimática. Existen factores que modifican la velocidad de la reacción
enzimática, estos son: La concentración de la enzima, concentración del sustrato,
concentración de coenzimas, pH, temperatura e inhibición enzimática. Para el estudio in
Vitrode cada factor por separado es necesario que los demás factores se encuentren
constantes, porque de otra manera no habría parámetros de comparación, sobre todo
cuando se estudia el efecto de la concentración del sustrato, para lo cual se utiliza exceso
de sustrato. El método se le llama “método de las velocidades iniciales” y las medidas
deben realizarse el inicio de la reacción cuando no se haya alcanzado más del 10% de
reacción.

El almidón es un polisacárido compuesto por unidades de glucosa con dos componentes:

uno mayoritario, llamado amilosa, de estructura lineal (las unidades están unidas,
exclusivamente, por enlaces a-1,4-glucosídicos), y otro, minoritario, amilopectina, de
estructura ramificada (cada cierto número de eslabones lineales hay una ramificación, que
encabeza una glucosa unida mediante enlace a-1,6-glucosídico a una de las glucosas de la
estructura lineal). La práctica se aprovecha, para seguir la degradación del almidón por a-
amilasa salival, amilosa forma un complejo azul con iodo, cataliza la hidrólisis de un
enlace que está situado interiormente en una macromolécula sin afectar los enlaces que se
encuentran en los extremos del sustrato, cosa que no pueden hacer los productos de su
degradación. Esta enzima más específicamente se cataloga como una -
 endoglicosidasaporque cataliza la hidrólisis de los enlaces glicosidicos. Por esta razón, el
almidón es el sustrato natural de la enzima.

3. PRELABORATORIO

a. En la práctica de laboratorio, para que se utiliza el ácido tricloroacetico (ATC)?

b. Cual espera que sea el pH óptimo de trabajo de la enzima a-amilasa salival? Justifique
su respuesta.
c. Cuáles son los factores que afectan la velocidad de una reacción enzimática?
d. Por qué sustancias está formado el lugol?
4. MATERIALES Y REACTIVOS
Gradilla, 15 tubos de ensayo, embudo, papel de filtro, cinta de enmascarar, estufa
Almidon 0.1 M, cloruro de potasio 0.1 M, buffer fosfato pH 4,9, buffer fosfato pH 6.3,
buffer fosfato pH=6.9, buffer fosfato pH 7.5, buffer fosfato pH 8.9, ATC (ácido
tricloroacetico), lugol, soluciones problema A, B y C (KCl, KBr, KF. Todas 0.1 M),
hielo.

5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

5.1. Obtención de la enzima a-amilasa salival.

Nota: de manera previa una persona o personas que aportaran la enzima deben
enjuagarse bien la boca.
En un tubo de ensayo limpio coloque un embudo con un papel de filtro. Este filtro se
humedece con suero fisiológico (agua con NaCl al 0,9%) o agua destilada hasta
adaptación al embudo y aparición de filtrado. Se deposita, entonces, una pequeña
cantidad de saliva (2 mL) sobre el embudo y se añaden 12 mL de suero o agua destilada
para diluir la secreción y permitir la filtración de la a-amilasa. Se deja unos minutos el
tubo con el embudo en la gradilla hasta recoger el filtrado, que será nuestra fuente de
enzima (rotule el tubo). Antes de utilizarlo, se debe agitar el tubo para obtener una
solución homogénea.

5.2. Preparación del sustrato para la experiencia 5.3

Tome un tubo de ensayo y adicione: Almidón: 1,0 mL; Agua destilada: 4,9 mL; cloruro de
potasio 0.1 M: 1 mL. y solución Buffer fosfato de pH=6,9: 0,1 mL. Rotúlelo como tubo
de sustrato

5.3. Demostración de la presencia de la enzima a-amilasa salivaly su actividad

respecto del tiempo de reacción.
Prepare 5 tubos de ensayo y adicioneles 0,5 mL de ácido tricloroacetico (ATC) a cada uno,
rotúlelos del 0 al 4.
Agite bien el tubo de sustrato y agregue 1 mL de solución de enzima, e inmediatamente,
agite y extraiga 1 mL de este tubo, adiciónelo rápidamente al tubo rotulado como 0
(cero). Simultáneamente comience a medir el tiempo. Cada minuto siguiente repita el
paso anterior, ósea extraiga una alícuota de 1 mL del tubo de reacción y adiciónela a los
tubos que contienen ATC hasta terminar con el tubo marcado como 4. Recuerde agitar
los tubos rotulados una vez agregue las alícuotas.

Agregue a cada tubo rotulado del 0 al cuatro una gota de lugol

a. Indique el color en los tubos de ensayo.

0 1 2 3 4

b. Para qué se le adiciona al tubo de sustrato agua destilada, cloruro de potasio y solución
Buffer fosfato?
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c. Qué puede concluir de los resultados obtenidos?

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d. Nombre dos productos que pueden estar presentes cuando el yodo (lugol) no
produzca la coloración típica con el almidón.
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5.4. Efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción
Prepare 4 tubos de ensayo de la siguiente forma:

Tubos 1 2 3 4
Reactivos mL. mL. mL. mL.
Buffer pH 6,9 0,1 0,1 0,1 0,1
KCl 0,2 0,2 0,2 0,2
Almidón 0,5 0,5 0,5 0,5
Agua destilada 1,2 1,1 1,0 0,9
Enzima 0,1 0,2 0,3 0,4

Es fundamental controlar con mucho cuidado el tiempo de reacción de forma tal que la
enzima actúe en igual cantidad de tiempo en cada tubo, por lo cual no adicione la
enzima hasta no tener preparado y agitado todos los tubos de ensayo.

Añada al tubo N°.1 la solución de enzima y agite, mida el tiempo. Transcurridos 30

segundos añada enzima al tubo N°. 2 y así sucesivamente hasta completar el tubo N°. 4
Después de transcurrir 4 minutos de reacción en cada tubo agregue a cada uno 0,2 mL de
ATC. Recuerde que cada tubo debe reaccionar durante 4 minutos.
Agregue a cada tubo una gota de lugol
a.Indique el color en los tubos de ensayo.

1 2 3 4

b. Explique los resultados obtenidos.

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5.5. Determinación del pH optimo de la a-amilasa salival.
Prepare 5 tubos de ensayo de acuerdo al siguiente cuadro:

Tubos 1 2 3 4 5
Reactivos mL. mL. mL. mL. mL.
Buffer pH 4,9 0.1
Buffer pH 6,3 0,1
Buffer pH 6,9 0,1
Buffer pH 7,5 0,1
Buffer pH 8,9 0,1
KCl 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Almidon 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Agua destilada 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Enzima 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

La enzima debe ser agregada como en el experimento anterior, cada 30 segundos a cada
tubo y debe reaccionar durante 4 minutos exactamente y detenerse la reacción con 0,2
ml de ATC
Agregue a cada tubo 1 gota de lugol

a. Indique el color en los tubos de ensayo.

1 2 3 4 5

b. Escriba el pH óptimo de trabajo de la enzima. ¿Por qué llego a esta conclusión?

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5.6. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reacción enzimática
Prepare tres tubos de acuerdo con el siguiente cuadro:

Tubos 1 2 3
Reactivos mL. mL. mL.
Agua destilada 1,0 1,0 1,0
Buffer pH 6,9 0,1 0,1 0,1
KCl 0,2 0,2 0,2
Almidón 1,0 1,0 1,0
Enzima 0,5 0,5 0,5

Una vez preparados los tubos de ensayo, pero antes de agregar la enzima, coloque el
tubo No. 1 durante 5 minutos en baño de hielo y el tubo No. 3 en el baño de agua en
ebullición. El tubo No. 2 manténgalo tomado con su mano cerrada. Luego de los 5
minutos sin sacarlos de los baños o su mano, adiciónele el volumen de enzima y
controle el tiempo de reacción que debe ser 5 minutos. Luego pare la reacción con 0,2
ml de ATC.
Agréguele a cada tubo 1 gota de lugol
a. Indique el color en los tubos de ensayo.

1 2 3

b.Cómo puede explicar los resultados obtenidos?

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5.7. Identificación del cofactor y de un inhibidor de la enzima a-amilasa salival.
La reacción enzimática se verifica con presencia de los iones cloruros. Los iones
fluoruros son inhibidores y los iones bromuros no inciden de ninguna manera en la
reacción. Con base en lo anterior prepare 3 tubos de ensayo de acuerdo con el siguiente
cuadro:

Tubos 1 2 3
Reactivos mL. mL. mL.
Solución A 0,2 - -
Solución B - 0,2 -
Solución C - - 0,2
Buffer pH 6,9 0,1 0,1 0,1
Almidón 0,5 0,5 0,5
Agua destilada 1,0 1,0 1,0
Enzima 0,5 0,5 0,5

Recuerde que la enzima se agrega al final, de manera secuencial para controlar el tiempo a
los 4 minutos exactos para cada tubo.
Añada a cada tubo 1 gota de lugol y observe los resultados.
a. Indique el color en los tubos de ensayo. SUPONGA EL SIGUIENTE RESULTADO

1 2 3

b. En cual solución se encuentra el inhibidor? ¿Por qué?

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c. En cuál solución se encuentran los iones cloruro? ¿Por qué?

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6. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

Grupo de trabajo N°. _______________________________________________________

Integrantes ______________________________________________________________
Fecha de práctica__________________________________________________________
Fecha de entrega de informe_________________________________________________

Links

https://www.youtube.com/watch?v=mKdnyUU66Ag

https://www.youtube.com/watch?v=AQyS_TwWW2A

https://www.youtube.com/watch?v=GvY1hFhrUkI

https://www.youtube.com/watch?v=5_H9rtxUs3Q

https://www.youtube.com/watch?v=p58z3OM6b2c

https://www.youtube.com/watch?v=aaPF4vGrYZ4

https://www.youtube.com/watch?v=cZyq4koUCNM

https://www.youtube.com/watch?v=1Fa2sSIt4_I

https://www.youtube.com/watch?v=8Yqbu56ImXk

https://www.youtube.com/watch?v=WDFfEX3LV5M