Departamento

 de  Citología  e  Histología  Normal  y  Patológica  

Universidad  de  Sevilla  
     
 
   
 
CULTIVO  CELULAR  
 
Cambio  de  Medio.  Mantenimiento  
 
 
Introducción:   Cuando   las   líneas   celulares   crecen   adecuadamente   y   ocupan   gran   parte   de   la  
superficie   del   frasco,   ocasiona   un   empobrecimiento   del   medio   al   consumirse   los   nutrientes   y  
acumularse   productos   de   deshecho.   Con   el   fin   de   reponer   nutrientes   y   eliminar   productos   de  
degradación   se   cambia   el   medio   cada   2   a   3   días.   Se   observa   que   el   medio   se   torna   naranja-­‐
amarillento  que  es  la  manifestación  del  cambio  de  pH  del  medio  (acidificación).  
 
Materiales:  
DMEM  al  5-­‐10%  de  SFB   En  baño  a  37°C  por  30  minutos  previos  al  cambio  de  medio  
Pipetas   2  ml  sin  filtro;  5  ml  o  10  ml  (según  corresponda)  
Frasco  de  cultivo   Frasco  con  línea  celular  previamente  obtenida  de  incubadora  
celular   de  CO2.  
 
Pasos:  
1.-­‐   Aspirar   el   medio   dejando   un   poco   del   medio   antiguo.   El   motivo   es   mantener   sustancias  
positivas   para   el   crecimiento,   si   el   medio   está   completamente   nuevo,   induciría   una   parada   o  
retraso  en  su  crecimiento.    
2.-­‐  Para  Frasco-­‐25  recoger  5  ml  de  DMEM.  
           Para  Frasco-­‐75  recoger  12  ml  de  DMEM.  
3.-­‐  Incorporar  DMEM  a  frasco.  
4.-­‐  Dejar  Frasco  en  incubadora  de  CO2  
 
 
   

Profesor:  Dr.  Manuel  de  Miguel  Rodríguez  

Alumna:  Tamara  Ortiz  Cerda  
 
 Departamento  de  Citología  e  Histología  Normal  y  Patológica  
Universidad  de  Sevilla  
     
 
  Tripsinización  
Introducción:  Para  levantar  las  líneas  celulares  se  realiza  una  suspensión  celular  mediante  el  uso  
de  tripsina  (proteasa),  que  digiere  aquellas  proteínas  celulares  implicadas  en  la  adhesión  celular.  
Materiales:  
DMEM  al  10%  de  SFB  
PBS   En  baño  a  37°C  por  30  minutos  previos.  
Tripsina    
Pipetas   2  ml  sin  filtro;  5  ml  o  10  ml  con  filtro  
Frasco  de  cultivo   Nuevo  Frasco  para  pase  de  células  (25  o  75  cc)  
celular  
Frasco  de  cultivo   Frasco  con  línea  celular  mantenido  en  incubadora  de  CO2  
 
Pasos:  
1.-­‐Aspirar  el  medio  de  cultivo  del  frasco  previamente  obtenida  de  incubadora  de  CO2  
2.-­‐Lavar   por   1   vez   con   5ml   de   PBS   para   contribuir   a   debilitar   la   adherencia   de   las   células   al   Frasco  
de  cultivo  celular  (así  se  elimina  el  suero  del  medio  que  contiene  inhibidor  de  tripsina).  
3.-­‐Incorporar   al   frasco   de   cultivo   1   o   2   ml   de   Tripsina   según   tamaño   del   frasco.   Mover  
horizontalmente  por  1  minuto  para  cubrir  toda  la  superficie.  
4.-­‐Aspirar  Tripsina  dejando  un  pequeño  volumen.  
5.-­‐Incubar  frasco  con  línea  celular  MÁS  Tripsina  por  5  minutos  a  37°  C.    
6.-­‐Luego   de   5   minutos,   bajo   el   microscopio,   las   células   deben   verse   redondas   y   en   movimiento  
(señal  de  que  han  perdido  adherencia).  
7.-­‐  Diluir  en  el  Frasco  de  cultivo  tripsinizado  5ml  de  DMEM.    
8.-­‐  Pipetear  por  2  veces  la  suspensión  para  acabar  de  levantar  la  células  (pipetear  arriba  y  abajo,  
esparciendo   la   suspensión   por   toda   la   superficie   del   frasco).   Por   tercera   vez,   pipetear   hacia   arriba  
todo  el  contenido  y  soltar  desde  una  esquina  del  frasco  con  el  fin  de  evitar  aglomeración.  
9.-­‐  Si  partimos  de  un  frasco  de  25  cc,  agregar  7  ml  de  DMEM  al  nuevo  frasco  (75  cc).    
10.-­‐  Transferir  volumen  de  frasco  de  cultivo  tripsinizado  (5  ml)  al  nuevo  Frasco  de  cultivo  (7  ml),  
logrando  un  volumen  final  de  12  ml.    
12.-­‐  Incubar  células.  
 
Nota:   Cuando   se   realiza   la   tripsinización   a   líneas   celulares   en   un   Frasco   de   cultivo   de   75,   el   DMEM  
utilizado   para   levantar   las   células   tripsinizadas   será   de   10   ml.   Así   el   frasco   inicial   queda   con   5   ml   y  
el  nuevo  con  otros  5  ml.  Completar  cada  uno  de  los  Frascos  hasta  obtener  un  volumen  de  12ml.  
 
 
Profesor:  Dr.  Manuel  de  Miguel  Rodríguez  
Alumna:  Tamara  Ortiz  Cerda  
 
 Departamento  de  Citología  e  Histología  Normal  y  Patológica  
Universidad  de  Sevilla  
     
 
 
Congelación  de  células  
Materiales:  

DMEM  al  10%  de  SFB  

PBS   En  baño  a  37°C  por  30  minutos  previos.  
Tripsina    
DMSO   Frasco  
Vial  (criotubo)   Según  necesidad  (2-­‐3  viales  por  frasco  de  cultivo  de  75cc).  
Micropipetas     200  µl  
Puntas   100  µl  o  200  µl  
Pipetas   2  ml  sin  filtro;  5  ml  o  10  ml  con  filtro  (según  corresponda)  
Falcon-­‐15  ml   Según  necesidad  
Frasco  de  cultivo     Frasco   con   línea   celular   previamente   obtenida   de   incubador  
de  CO2  
Pote  c/hielo   Pote  pequeño  con  hielo  para  conservar  vial  
 
Pasos:  
1.-­‐Realizar  tripsinización  del  cultivo  celular  (con  2  ml  de  tripsina  para  frasco  75  cc).  
2.-­‐Agregar  4,5  ml  de  DMEM  al  Frasco  de  cultivo  tripsinizado  (1,5  ml  por  cada  vial,  total  3  viales).  
3.-­‐Pipetear  por  2  veces  la  suspensión  para  acabar  de  levantar  la  células  (pipetear  arriba  y  abajo,  
esparciendo   la   suspensión   por   toda   la   superficie   del   frasco).   Por   tercera   vez,   pipetear   hacia   arriba  
todo  el  contenido  y  soltar  desde  una  esquina  del  frasco  con  el  fin  de  evitar  aglomeración.  
4.-­‐En  Falcon-­‐15  agregar  la  suspensión  (4,5  ml)  MÁS  6  ml  de  DMEM  (11  ml  volumen  final).  
5.-­‐Centrifugar  a  1500  rpm  por  5  minutos.  
6.-­‐Aspirar  el  sobrenadante  (medio)  dejando  solo  el  pellet.  
7.-­‐Al  pellet  agregar  4,5  ml  de  DMEM.  Re-­‐suspender  3  veces.  
8.-­‐A  cada  vial  (3  unidades)  agregar  1,5  ml  de  suspensión  celular.  
9.-­‐Agregar  a  cada  vial  75  µl  de  DMSO  (di-­‐metil-­‐sulfóxido)  como  agente  crioprotector.  El  DMSO  es  
bastante   tóxico.   Para   minimizar   el   tiempo   que   las   células   pasan   a   temperatura   ambiente   en  
presencia  de  DMSO  se  debe  enfriar  las  células  lo  antes  posible  (4°C).  
10.-­‐Etiquetar  viales  con  línea  celular  y  fecha.  
11.-­‐Enfriar  viales  en  hielo  a  4°C  por  5  minutos.  
12.-­‐Luego  congelar  viales  a  -­‐20°C  por  2  horas.  
13.-­‐El  siguiente  paso  es  congelar  a  -­‐80°C  o/n  (también  se  puede  dejar  varios  días  si  fuera  
necesario).  
14.-­‐  Al  día  siguiente  guardar  en  Nitrógeno  Líquido  y  apuntar  en  el  cuaderno.  Arrancar  uno  de  los  
viales  congenlados  en  un  par  de  semanas  para  comprobar  viabilidad.    
 
   

Profesor:  Dr.  Manuel  de  Miguel  Rodríguez  

Alumna:  Tamara  Ortiz  Cerda  
 
 Departamento  de  Citología  e  Histología  Normal  y  Patológica  
Universidad  de  Sevilla  
     
 
   
Descongelación de lineas celulares

- Sacar el criotubo con las células del tanque de Nitrógeno líquido.

- Descongelar en la mano (hasta que queden algunos trocitos de hielo).

- Con ayuda de la pipeta, echar las células en un tubo de 15 ml (Falcon) cónico y añadir 5 ml de
medio a 37ºC.
- Centrifugar 5 minutos, 1300 rpm, 37 ºC.

- Retirar sobrenadante con ayuda de la pipeta.

- Añadir al pellet 3 ml de medio y resuspenderlo con la pipeta recogiendo todo el contenido y
soltar a cierta distancia del fondo para ayudar a que se retire el botón del fondo, varias veces.
- Verter todo el contenido en el frasco de cultivo

- Añadir medio: 4 - 5 ml para los frascos de 25 cm3 y 10 ml para los de 75 cm3.

- Rotular indicando: Tipo de línea celular, fecha y nº de pase.

- Estufa a 37ºC, 5% CO2

NOTA PARA TODOS LOS PROCEDIMIENTOS: Procurar que el líquido no llegue a la boca del
frasco ni que impregne el tapón.

Profesor:  Dr.  Manuel  de  Miguel  Rodríguez  

Alumna:  Tamara  Ortiz  Cerda