TEMA-2.

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Mpm98

Epigenética

4º Grado en Biomedicina Básica y Experimental

Facultad de Medicina
Universidad de Sevilla

Reservados todos los derechos.

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 TEMA 2: Metilación del DNA (I)

1. Introducción.
En los años 50, poco después del descubrimiento del DNA y de su estructura, se vio que había
algunos nucleótidos metilados. Primeramente fue una observación bioquímica y se tardó
varias décadas en entender su importancia.

Hay tres tipos de bases metiladas:

La primera se encuentra en eucariotas, la segunda en bacterias y la tercera en bacterias y

eucariotas inferiores.

Estas bases metiladas se producen tras la incorporación del nucleótido al DNA, es post-
replicativa. Ocurre por una reacción universal, donde S-adenosil-metionina es el donador de
grupos metilo. Se realiza mediante la DNA metiltransferasa o DNA metilasa, la cual tiene
dianas específicas. Por ejemplo, las enzimas de nuestro genoma metilan las citosinas que
están en pares CG.

Como la metilación es post-replicativa, hay un estado después de la replicación en el que solo

la cadena vieja está metilada, lo que se conoce como hemimetilación o semimetilación. Suele
ser un estado transitorio. Este proceso se conoce como metilación de mantenimiento,
mantiene un patrón de metilación anteriormente establecido. Es lo que ocurre en las células
habitualmente.
Hay situaciones en todos los genomas, en las cuales el genoma no está metilado y hay que
establecer el patrón de metilación, lo que se conoce como metilación de novo. Este patrón
luego se puede propagar a las células hijas mediante la metilación de mantenimiento, como
hemos dicho anteriormente.

¿Qué consecuencias tiene la metilación de bases?

Para empezar, no es mutacional, es decir, no es fastidiosa (patológica). Como sabemos, hay

mutágenos que pueden introducir grupos alquilo y metilo en el DNA que pueden dar
patologías, pero en cambio las metilaciones epigenéticas no son patológicas. Además,
permiten el emparejamiento de bases, no alteran las propiedades de la cadena. Es decir, a
diferencia de otras metilaciones (p.e. las producidas por agentes alquilantes), m5C, m4C y
m6A no alteran las propiedades de la C y la A, que siguen emparejándose correctamente.
Algunos autores las consideran “adiciones al lenguaje genético”. Ahora bien, que no alteren el
DNA no quiere decir que no afecten a su estructura.

Alexander Rich fue el descubridor del DNA Z. Aun no está clara su existencia en las células,
pero se puede fabricar en un tubo de ensayo. Su hélice es levógira y el paso de rosca es
diferente. La forma más fácil de crearlo es metilar el DNA. Si fabricamos in vitro poli CG y lo
metilamos, la molécula en un tubo de ensayo pasa rápidamente de DNA B al DNA Z.

Cuando se descubrió esto se vio que la metilación del DNA puede causar cambios notables en
su estructura. Lo que pasa que poli CG o poli AT no existen puros en el genoma. Eso sí, la
metilación de DNA no homopolimérico, produce cambios de curvatura, dobladuras,
disminución de la estabilidad termodinámica de la doble hélice (la hélice se abre más
fácilmente), etc. Por tanto, la propia metilación puede afectar a la interacción DNA-proteína,
p.e., las enzimas de restricción no cortan su diana si esta está metilada. Por lo que podemos
decir, que una secuencia esté metilada o no nos va a determinar si una proteína puede unirse
al DNA o no.

El estado de metilación nos va a afectar a su interacción con las proteínas, como hemos dicho.
Y esto es así porque el grupo metilo de m4C, m6A y m5C sobresale por el surco mayor de la
doble hélice, que es la región más habitual de interacción de las proteínas con el DNA.

Vamos a hablar de 6-metil-adenina, sobre todo en bacterias, porque es donde se descubrió y

se conocen mejor sus funciones, aunque se cree que puede tener funciones en eucariotas
inferiores e incluso en nuestras células.

Sus funciones son sobretodo conocidas en ƴ-proteobacterias: E.coli, Salmonella… La enzima

que la sintetiza es la metilasa Dam. Esta enzima reconoce sitios GATC y metila la adenina en la
posición 6. En el genoma bacteriano, sitios GATC hay muchos, por ejemplo, en E. coli hay más
de 20.000. Como hemos dicho, esta metilación es post-replicativa y se sabe que va unas 10 kb
por detrás de la horquilla de replicación. Por tanto, la replicación del DNA producirá dos
cadenas molde hemimetiladas y la metilasa Dam volverá a metilar.

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 2. Funciones de la metilación.
En la mayor parte del genoma hay un ciclo: el genoma está metilado en los ciclos GATC  la
replicación del DNA produce sitios GATC hemimetilados  la metilasa Dam que va 10 kb por
detrás metila las cadenas hijas.

Este ciclo de metilación-hemimetilación sirve para:

- La reparación de emparejamientos erróneos en el DNA. Es un proceso de reparación

errores cometidos durante la replicación.
- La regulación transcripcional acoplada a la replicación.

La replicación del DNA tiene una fidelidad extraordinaria porque además las DNApol tienen un
sistema de corrección de errores, ya que si introducen un nucleótido erróneo pueden volver
atrás, quitarlo y poner el correcto, lo que hace que la tasa de errores sea muy baja, pero no es
0. Por lo tanto, pueden producirse emparejamientos erróneos entre nucleótidos normales,
que es solucionado en las ƴ-protobacterias mediante el siguiente sistema.

Cuando el DNA se replica está hemimetilado. Supongamos que ha habido un error en la

incorporación de un nucleótido en la cadena hija, de la forma mencionada anteriormente. Hay
una proteína, MutS, que lo detecta y se une a este emparejamiento erróneo y atrae a dos
proteínas, MutL y MutH. Estas proteínas forman un complejo y entonces buscan el sitio GATC
más próximo, que está hemimetilado, y cuando lo encuentran cortan la cadena hija (el corte lo
realiza MutH que es una endonucleasa). Luego llega una exonucleasa que degrada un trozo de
DNA y después llega la DNApolimerasa III y lo resintetiza. Así se corrige el emparejamiento
erróneo en la dirección apropiada, ya que se identifica la cadena molde porque es la que tiene
el GATC metilado.

Tras esto, llega la metilasa Dam y metila la cadena hija.

Además de servir para la reparación de emparejamientos erróneos, la metilación sirve para

acoplar la transcripción a la replicación usando la hemimetilación como señal. P.e.: en un
promotor hay un sitio GATC. Cuando está metilado en las dos cadenas, la RNApol no se puede
unir. Cuando está hemimetilado, si se puede unir, y cuando vuelve a metilarse de nuevo deja
de unirse.

Esto permite la transcripción muy transitoria de un determinado gen, mientras se replica o

inmediatamente después de replicarse. Es como una especie de reloj. Esto ocurre p.e. en el
elemento de inserción IS10, que es un transposón. Esto es un mecanismo para evitar el daño
en la célula.

También en E.coli se conoce el ejemplo contrario. El gen dnaA, solamente se transcribe si está
metilado, aunque este gen se mantiene artificialmente hemimetilado durante la mayor parte
del tiempo.

Anteriormente hemos definido la epigenética como el estudio de cambios heredables por

adición de información al genoma. Pero esto que hemos visto no es heredable. De ahí que la
palabra epigenética se utilice en muchos sentidos diferentes. Es verdad que esto no es

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heredable, pero podemos decir que si es heredable en el sentido de que la molécula tiene la
información necesaria para que en la siguiente generación se realice el mismo proceso de
reparación o de transcripción. Aun así, esto no encaja al pie de la letra en la definición. Por
ello, en el año 2015 se publicó un artículo dando diversos significados a esta palabra, aunque
nosotros utilizaremos el significado dicho anteriormente.

Los fenómenos que hemos visto asociados a la hemimetilación, no son los únicos en los que la
metilación de adenina tiene una función. Este ciclo de metilación-hemimetilación-metilación,
puede ser roto, alterado, bloqueando la metilación. Si cuando el DNA está hemimetilado, viene
una proteína y se une, puede bloquear la actividad de la metilasa Dam, quedándose el sitio
hemimetilado. Si esto ocurre durante dos rondas sucesivas de replicación, se puede producir
un sitio GATC no metilado. Esto es lo que se conoce como desmetilación pasiva. Son
excepciones a la normal general de que todos los sitios GATC están metilados.

Esto se debe a que hay secuencias flanqueantes que disminuyen la procesividad de la metilasa
Dam. La metilasa Dam es una enzima procesiva, estas son las que pueden realizar muchas
veces su actividad enzimática sin soltarse de su sustrato. Por tanto, la metilasa Dam está unida
al DNA sin soltarse buscando un sitio GATC tras otro. Si llega a un sitio por el que tiene menos
afinidad porque la secuencia flanqueante no es muy buena y además tiene una proteína unida,
se lo salta, y se puede producir un sitio GATC no metilado.

Estos sitios, suelen estar asociados a los que llamamos “interruptores”, mecanismos de
regulación que generan biestabilidad. La biestabilidad es un fenómeno por el que un
determinado gen puede expresarse en algunas células de la población y en otras no. Es la
coexistencia de estados transcripcionales que llamamos ON y OFF.

Un mecanismo para formar sistemas biestables es la metilación GATC y la formación de

patrones que tienen sitios metilados y no metilados.

Ejemplo: supongamos que en una región hay dos sitios GATC,

y estos están dentro de un sitio de unión de una proteína. La
proteína se puede unirse al primer GATC o al segundo. Esto
puede dar lugar a dos estados, y cuando se une puede dar
lugar al bloqueo de la metilación, lo que va a producir que su
afinidad por el sitio aumente, produciéndose un lazo auto-
catalítico positivo. Al sitio que no se une se metila como lo
haría normalmente. Cuando se replique el DNA, habrá una
hemimetilación, lo que es un estado ambiguo y entonces la
proteína puede cambiar de sitio, y una célula en estado A
puede pasar al B, y esto es lo que se conoce como
bioestabilidad reversible o cambio de fase.

El operón pap es un sistema bioestable reversible de gran complejidad. Es de E.coli

uropatogénicas que producen infecciones urinarias. Este operón codifica fimbrias de adhesión
(adhesinas) al epitelio urinario. Cuando se produce una infección de estas bacterias, suele
afectar a la uretra y vejiga dando una cistitis, pero puede haber una complicación, ya que si la
estirpe tiene estas fimbrias se adhieren al epitelio y pueden trepar por el uréter y llegar al
riñón. Esto puede dar lugar a una pielonefritis. La bioestabilidad está sesgada hacia el estado
OFF (la no producción).

En modelos de rata (y posteriormente en reclusos en EEUU), se descubrió que para que

produzcan pielonefritis tienen que infectar con una mezcla de bacterias que producen
fimbrias y otras que no las producen. Si uno las separa, e infecta solo con las fimbriadas, no
hay infección, porque las fimbrias son muy inmunogénicas y el SI lo detecta; si infectamos con
células no fimbriadas, tampoco la hay ya que estas no se pueden adherir. Por tanto, sin ambas
subpoblaciones no hay infección.

La región de control del operón pap tiene 6 sitios de unión para un regulador trascripcional
llamado Lrp, y solo 2 de estos sitios tienen dentro un GATC (el proximal y el distal, que están
en el sitio 2 y 5 respectivamente). En la población ON, se metila el proximal y no el distal, y en
la OFF al contrario.

En las células en estado OFF el Lrp está unido al sitio más cercano al promotor bloqueándolo,
y el sitio GATC proximal se desmetila, con lo que el Lrp aumenta su afinidad por este sitio
creándose un lazo autocatalítico que tiende a perpetuar el estado OFF.

Para poder cambiar, necesita la ayuda de un regulador independiente que se transcribe en un

gen cercano llamado PapI, que se produce en muy poca cantidad y solo en algunas células
consiguen alcanzar la concentración necesaria para mover el Lrp al sitio distal. Esto solo ocurre
en estado hemimetilado. Así pasa al estado distal, por lo que este se desmetila. Al
desmetilarse, de nuevo aumenta la afinidad del Lrp por el sitio distal, tendiendo a perpetuar el
estado ON.

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 Esto permite que se transcriba el operon y se forme PapB, que va a favorecer la transcripción
de PapI, dando una autorregulación positiva. Lo que pasa es que, unas 8-12 generaciones más
tarde, por algún motivo, esto se deshace y se vuelva al estado inicial (no se sabe aun por qué).

Las fimbrias Std permiten la adhesión de la Salmonella en la capa de moco que cubre el ciego
en el intestino grueso (podemos observarlo por microscopía de fluorescencia con Ac anti-
StdA). La expresión del operón Std también es bioestable y se regula por patrones de
metilación. En este caso hay un regulador transcripcional que en este caso puede estar unido
o no (a diferencia de pap que tiene dos estados). Si se une, desmetila dos sitios GATC que
están dentro del sitio de unión del regulador. Cuando se une, los sitios se desmetilan y
aumenta su afinidad generándose un lazo autocatalítico positivo, pasando al estado StdON.

Una cosa llamativa de este operón es que este tiene 6 genes. Los primeros codifican las
subunidades de las fimbrias, y los últimos dos genes codifican 2 reguladores transcripcionales
(StdE y StdF), que van a regular la transcripción de más de 200 genes. Con lo cual este linaje
no va a diferir solo en las fimbrias, si no en muchísimos otros genes.

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Las células que no expresan las fimbrias pueden producir infección aguda pero no pegarse al
moco del ciego; mientras que las que si las expresan pueden pegarse al ciego y quedarse allí,
produciendo infección crónica.

En resumen:

- El genoma de las gamma-proteobacterias contiene sitios GATC no metilados,

generados por la unión de proteínas que impiden la metilación.
- Los sitios GATC no metilados suelen estar asociados a la formación de patrones de
metilación (combinaciones de sitios metilados y no metilados).
- Los patrones de metilación en sitios GATC regulan la transcripción.
- Muchos sistemas bacterianos con expresión biestable están regulados por patrones
de metilación del DNA, que son diferentes en el linaje ON y en el linaje OFF.
- La formación de linajes, controlada por la metilación del DNA o por otros
mecanismos, tiene valor adaptativo en las poblaciones bacterianas e influye en la
patogénesis.

Para estudiar la virulencia bacteriana (por ejemplo de Salmonella) se utilizan modelos

animales. Por ejemplo, en las fimbrias pap se usa modelo de rata, mientras que para la
Salmonella se utiliza modelo de ratón.

Es muy fácil comparar dos cepas para saber cuál es más virulenta simplemente viendo
cuántas células hacen falta de cada cepa para producir síntomas en el animal o matarlo. La
atenuación es una medida de pérdida de virulencia.

Los mutantes Dam- de Salmonella muestran atenuación en el modelo de ratón: 10.000 veces
por la ruta oral, es decir, si le damos Salmonella en una cánula por la boca a este tipo de
ratones, deberíamos añadir 10.000 veces más bacterias para causarle síntomas; 1.000 veces
por la ruta intraperitoneal.

Esto indica que la falta de metilación atenúa la virulencia. Esto se descubre en Salmonella y
luego se ha extendido a un gran número de patógenos, como podemos ver en el siguiente
cuadro:
Conclusión: la falta de metilación de adenina en muchas bacterias patógenas atenúa la
virulencia. Esto tiene varios intereses:

- Académico. La metilación del DNA controla la transcripción de genes relacionados con

la infección de animales.

- Aplicado:

 Uso de mutantes carentes de metilación como vacunas vivas (incluida la expresión

de Ag heterólogos). Estas suelen ser mucho más eficaces que las hechas con
bacterias muertas, ya que la estimulación de la inmunidad es mucho mayor. Esto
ya se ha realizado (en vacunas para animales).

 Uso de inhibidores de la metilación del DNA como compuestos antibacterianos.

Están en auge para su uso en las bacterias multirresistentes. Hay que tener en
cuenta:
a) Ventajas: supuestamente son inocuos para el hospedador (porque en
principio no tenemos metilación de adenina en nuestro genoma) y para la
microbiota. Además, inhiben la virulencia sin matar, por lo que no hay
selección letal.
b) Inconvenientes: causan hipermutabilidad por interferencia con reparación de
emparejamientos erróneos.

El problema es que aún no se sabe realmente si hay metilación de adenina en nuestro

genoma. Hace unos años se publicó un artículo (2015) en el cual habían encontrado metilación
de adenina en varias especies. Hay otro artículo que indica que la hay en el genoma humano
(2018). Por lo tanto, está por ver si sirve de señal epigenética, pero no podemos decir
directamente ya que no la hay.
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