Genética molecular

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La genética molecular (no confundir con la biología molecular) es el campo de la genética que estudia la
estructura y la función de los genes a nivel molecular. La genética molecular emplea los métodos de la
genética y la biología molecular.1 Se denomina de esta forma para diferenciarla de otras ramas de la
genética como la genética ecológica y la genética de poblaciones.

Índice

1 Ramas de la genética molecular

2 Forward genetics

3 Reverse genetics

4 Técnicas utilizadas en genética molecular

4.1 Amplificación

4.1.1 Reacción en cadena de la polimerasa

4.1.2 Clonación de ADN en bacterias

5 Aplicaciones

5.1 Terapia génica

6 Véase también

7 Referencias

8 Enlaces externos

Ramas de la genética molecular

Un área importante dentro de la genética molecular es el uso de la información molecular para

determinar los patrones de descendencia y por lo tanto, la correcta clasificación científica de los
organismos, lo que se denomina sistemática molecular, mientras que al establecimiento de relaciones de
parentesco se llama filogenia molecular lo cual se diferencia con el método de genes que aparecen en el
mundo y el universo.
Junto con la determinación de la matriz de descendientes, la genética molecular ayuda a comprender las
mutaciones genéticas que pueden causar ciertos tipos de enfermedades. A través de la utilización de sus
métodos y los de la biología molecular, la genética molecular descubre las razones por las cuales las
características son realizadas y cómo y porqué algunas pueden sufrir mutaciones.

Forward genetics

Una de las primeras herramientas utilizada por los genetistas moleculares fue el rastreo genético. El
objetivo de esta técnica es identificar el gen que es responsable por un determinado fenotipo. Muchas
veces se usa un agente mutagénico para acelerar este proceso. una vez aislados los organismos
mutantes, se hace posible identificar molecularmente al gen responsable por la mutación.

Reverse genetics

Aunque los rastreos de la forward genetics sean eficaces, podemos usar un abordaje más directo:
determinar el fenotipo resultante de la mutación de un determinado gen. A esto se le llama reverse
genetics. En algunos organismos, tales como levaduras, es posible inducir una deleción en un gen
específico, creando un bloqueo de genes. una alternativa posible es inducir deleciones aleatorias en el
ADN y seleccionar posteriormente las deleciones en genes de interés , usar ARN interferente y crear
organismos transgénicos con una sobreexpresión del gen de interés.

Técnicas utilizadas en genética molecular

Existen tres técnicas de biología molecular utilizadas por la genética molecular: amplificación; separación
y detección de secuencias. La reacción en cadena de la polimerasa es específicamente utilizada para la
amplificación, un "instrumento indispensable para una gran variedad de aplicaciones".2 En la técnica de
separación y detección el ADN y el ARNm son aislados a partir de sus células. La expresión del gen en
células u organismos es hecha en un local o tiempo que no es normal para ese gen específico.

Amplificación

Hay otros métodos para la amplificación, además de la reacción en cadena de la polimerasa. La

clonación de ADN en bacterias es también una forma de amplificar ADN en genes.

Reacción en cadena de la polimerasa

Artículo principal: Reacción en cadena de la polimerasa

Los principales materiales utilizados en la reacción en cadena de la polimerasa son nucleótidos del ADN,
o ADN molde (template), partidores (primers) y la Taq polimerasa. Los nucleótidos de ADN son la base
para el nuevo ADN; el ADN molde es la secuencia específica a ser amplificada, los partidores son
nucleótidos complementarios que pueden ir en ambos lados del ADN molde y; la polimerasa Taq es una
enzima térmicamente estable, que salta e inicia la producción de ADN nuevo a las temperaturas elevadas
necesarias para la reaccíon. Con esta técnica no es necesario usar las bacterias vivas ni células; todo lo
que se necesita es la secuencia de bases del ADN y los materiales listados arriba.

Clonación de ADN en bacterias

El término clonación para este tipo de amplificación envuelve hacer múltiples copias idénticas de una
secuencia de ADN. La secuencia de ADN objetivo es entonces inserida en un vector de clonación. Una
vez que este vector origina plásmido, a partir de un virus autorreplicante o una célula superior del
organismo, cuando el ADN de tamaño apropiado es inserido el "alvo y fragmentos de ADN del vector son
ligados" y crean una molécula de ADN recombinante. Las moléculas de ADN recombinantes son después
colocadas en una cepa de bacterias (Escherichia coli generalmente), que producen varias copias
idénticas por transformación. A transformación es el mecanismo de absorción de ADN que poseen las
bactérias. Apenas una molécula de ADN recombinante puede ser clonada dentro de una única célula
bacteriana, de modo que cada clon corresponde apenas a una inserción de ADN.

Aplicaciones

Una de las aplicaciones consiste en el estudio de la mutación y variación de cepas de bacterias.3

Terapia génica

Artículo principal: Terapia génica

Una mutación en un gen puede resultar en una condición médica patológica. Una proteína codificada
por un gen mutado, puede funcionar mal y las células que se basan en esa proteína podría no funcionar
adecuadamente, lo cual puede causar problemas para los tejidos u órganos específicos o para todo el
cuerpo. Esto puede manifestarse en el curso del desarrollo corporal o como una respuesta anormal
(como en las deformidades) a los estímulos (como en el caso de las alergias). Las condiciones
relacionadas con las mutaciones del gen se llaman trastornos genéticos.

Una manera de tratar los problemas fisiológicos resultantes es la terapia génica. Mediante la adición de
una copia corregida del gen, se puede producir una forma funcional de la proteína, para que las células
afectadas, tejidos y órganos funcionen correctamente. A diferencia de los enfoques basados en
medicamentos, la terapia génica repara el defecto genético subyacente.

Una forma de terapia génica es el proceso de tratamiento o alivio de enfermedades mediante la

modificación genética de las células de la persona afectada con un nuevo gen que está funcionando
correctamente. Cuando un gen de la enfermedad humana ha sido reconocido moleculares, las
herramientas genética se puede utilizar para explorar el proceso del gen, tanto normal como mutante. A
partir de ahí, los genetistas diseñan un nuevo gen que funciona correctamente. A continuación, el nuevo
gen se transfiere ya sea in vivo o ex vivo, y el cuerpo comienza a producir proteínas de acuerdo con las
instrucciones de ese gen. La terapia génica tiene que ser repetida varias veces, para obtener resultados
duraderos.

No debe confundirse con recombinación genética.

Diagrama de ADN ligado. Esta secuencia pertenece a un gen de la hemoglobina humana.

El ADN recombinante, o ADN recombinado, es una molécula de ADN artificial formada de manera
deliberada in vitro por la unión de secuencias de ADN provenientes de dos organismos distintos que
normalmente no se encuentran juntos. Al introducirse este ADN recombinante en un organismo, se
produce una modificación genética que permite la adición de una nueva secuencia de ADN al organismo,
conllevando a la modificación de rasgos existentes o la expresión de nuevos rasgos. La producción de
una proteína no presente en un organismo determinado y producidas a partir de ADN recombinante, se
llaman proteínas recombinantes.

El ADN recombinante es resultado del uso de diversas técnicas que los biólogos moleculares utilizan para
manipular las moléculas de ADN y difiere de la recombinación genética que ocurre sin intervención
dentro de la célula. El proceso consiste en tomar una molécula de ADN de un organismo, sea virus,
planta o una bacteria y en el laboratorio manipularla y ponerla de nuevo dentro de otro organismo. Esto
se puede hacer para estudiar la expresión de un gen, para producir proteínas en el tratamiento de una
enfermedad genética, vacunas o con fines económicos y científicos.1

Índice

1 Procedimiento

2 Aplicaciones

3 Producción y terapia con proteínas recombinantes

3.1 Producción en bacterias

 3.2 Producción en levaduras

3.3 Producción en células de insecto

3.4 Producción en células de mamífero

4 Referencias

5 Enlaces externos

Procedimiento

El proceso de producción de un ADN recombinante comienza con la identificación desde un organismo

de una secuencia de ADN de interés con el fin de propagarlo en otro organismo que carece de la
secuencia y, por ende, del producto proteico de esa secuencia de ADN.2 Así se pueden producir
cantidades ilimitadas de la proteína codificada por el susodicho gen. En términos simples, el
procedimiento consiste en:3

Localización de genes y sus funciones.

Clonación del ADN, y su posterior almacenamiento en genes.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Utilización de vectores de expresión.

Aplicaciones

El vector que se utiliza contiene secuencias de ADN que al ser replicadas confieren resistencia a
antibióticos específicos. Esta técnica ha sido ampliamente utilizada en el campo de la medicina y ha
permitido el desarrollo de importantes avances terapéuticos como por ejemplo la producción de insulina
recombinante.2

Permite además la posibilidad de utilizar plantas y alimentos transgénicos, así como microorganismos
modificados genéticamente para producir fármacos u otros productos de utilidad para el hombre, entre
los que se pueden citar: la insulina humana, la hormona del crecimiento, interferones, la obtención de
nuevas vacunas o la clonación de animales.

Con el uso de ADN recombinante se ha logrado obtener plantas transgénicas resistentes a insectos,
hongos, bacterias y herbicidas, con mejores características de calidad durante poscosecha y con alto
contenido nutricional.4 También ha permitido la clonación, expresión y producción mediante esta
técnica de diversos antígenos, por ejemplo, la vacuna contra la hepatitis B5 y la vacuna contra el virus del
papiloma humano.6

Producción y terapia con proteínas recombinantes

Las proteínas recombinantes son aquellas que se producen mediante la técnica del ADN recombinante,
es decir, expresando un gen de un organismo en otro organismo distinto. Para que estas proteínas sean
útiles desde el punto de vista terapéutico tienen que conservar su actividad. Además, se debe evitar que
sean inmunogénicas para el ser humano. Para ello es importante decidir para cada proteína
recombinante cual es el organismo de expresión más adecuado.

Producción en bacterias

Estas proteínas recombinantes han intentado expresarse en bacterias como E. coli, ya que son fáciles de
mantener, crecen rápido y se conoce bien su genoma. Sin embargo, el mayor problema que presenta la
producción en bacterias es que en ellas no existe glicosilación proteica, por lo que algunas proteínas
producidas en bacterias pierden totalmente su función. Aun así se han logrado producir con éxito
algunas proteínas recombinantes en bacterias. La primera proteína recombinante que se produjo en E.
coli fue la somatostatina, una hormona anti-crecimiento de 14 aminoácidos. Sin embargo, aunque desde
el punto de vista científico fue un éxito, desde el punto de vista económico fue un fracaso, ya que su
utilidad estaba reducida a personas con problemas de gigantismo y similares, que son poco comunes.
Posteriormente se logró un gran éxito en este campo mediante la producción de insulina en bacterias. La
insulina presenta la ventaja de no necesitar modificaciones postraduccionales, por lo que se evita este
problema de su producción en bacterias. Además, la diabetes es una enfermedad muy frecuente en la
sociedad, con unos 347 millones de diabéticos.7 En EEUU el 6% de la población (20 millones de
habitantes) son diabéticos y esta enfermedad es la 6ª causa de muerte. Antes de esta producción en
bacterias, se usaba insulina porcina.

Producción en levaduras

Al ser células eucariotas y por lo tanto más similares a las humanas que las bacterias y ser muy fáciles de
emplear industrialmente, las levaduras constituyen otro grupo de organismos susceptibles de producir
proteínas recombinantes para uso humano. Sin embargo, aunque sí presentan glicosilación proteica, al
contrario que las bacterias, esta es totalmente distinta a la humana, por lo que estas proteínas presentan
problemas, en muchos casos incluso inmunogénicos.

Producción en células de insecto

Más cercanas aún a las células humanas que las levaduras son las de insecto, como las de Spodoptera
frugiperda (una polilla parásito del maíz y del algodón), que se cultivan fácilmente in Vitro, aunque el
medio de cultivo es caro. Dicho medio, además, no contiene suero, lo que hace más fácil el procesado de
la proteína. Otra de las propuestas ha sido el uso no de células de insecto, sino de los insectos completos
para la producción de estas proteínas. Para ello se infectan a los insectos con baculovirus modificados
(que además no infectan a los seres humanos) para que expresen la proteína recombinante. Sin
embargo, este sistema presenta exactamente el mismo problema que el de levaduras: que las células de
insecto presentan glicosilación, pero esta es totalmente distinta a la de mamíferos.

Producción en células de mamífero

Al ser células más parecidas a las humanas, el procesamiento que sufren las proteínas recombinantes
producidas en células de mamífero también es más similar, por lo que se conserva su función (aunque
puede haber ligeros cambios en el patrón de glicosilación). Los inconvenientes de este método es que el
crecimiento celular es más lento, tardando de 6 a 24 horas en duplicarse las células, que los cultivos
pueden sufrir contaminación de bacterias u hongos y que se puede contaminar el producto con virus
que infecten a humanos. Para la producción en mamíferos se usan las células CHO, de ovario de ratón
chino, que presentan la ventaja de que crecen bien y existen gran cantidad de mutantes de glicosilación.
Además, se está intentando que los animales secreten estas proteínas en la orina, en la leche, etc.

Los vectores de clonación o vector molecular son moléculas transportadoras que transfieren y replican
fragmentos de ADN que llevan insertados mediante técnicas de ADN recombinante. Para que sirva de
vector, una molécula debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta.
También tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN
a clonar.

Para insertar un fragmento de ADN a un vector, se utiliza una enzima de restricción que se mezcla con
fragmentos de ADN producidos con la misma enzima, posteriormente, se adiciona la enzima Fosfatasa
Alcalina, la cual es la encargada de evitar la recircularización del vector, ya que adiciona un extremo 3'
Fosfato que evita la unión de ambos extremos así como la complementariedad y formación de un enlace
fosfodiéster. Inmediatamente se adiciona el ADN que pretende insertarse en el vector, donde uno de los
extremos se une por complementariedad y se utiliza una ligasa para generar la unión y su
recircularización.
Los vectores que transportan un fragmento insertado se denominan vectores recombinantes.

Todo vector de clonación debe contener los siguientes elementos:

Origen de Replicación: Es la región que codifica para el inicio de la síntesis de DNA, el cual le da la
cualidad de poder replicarse de manera independiente al DNA cromosómico, ya sea en un sistema
bacteriano o en un sistema de expresión en levaduras.

Agente de Selección: Son genes contenidos en la secuencia del vector, los cuales le confieren
características adicionales al sistema de clonación (bacterias, levaduras, etc.), que permiten la
identificación y selección de las clonas recombinantes, es decir, clonas que contienen el fragmento de
DNA de interés. Ejemplos de esto son los genes que codifican para la resistencia a antibióticos, como lo
son los de resistencia a la ampicilina o a la tetraciclina, o por el contrario, pueden ser marcadores
metabólicos como el gen Lac Z, que codifica para la síntesis de la enzima beta galactosidasa o
marcadores auxotróficos, como lo es el gen que codifica para la síntesis de histidina (muy utilizado en los
sistemas de expresión y clonación en levaduras).

Polilinker o Sitio de Multiclonación: Región contenida dentro de las secuencias de los genes que
codifican para los marcadores, que contienen múltiples sitios de restricción, es decir, múltiples sitios de
reconocimiento para las enzimas de restricción, que permiten la inserción de los fragmentos de DNA que
se desea clonar en un sistema.

Índice

1 Tipos de vectores

1.1 Plásmidos

1.1.1 pUC18

1.2 Bacteriófago lambda

1.3 Cósmidos

1.4 YAC
 1.5 BAC

1.6 Fagémidos

2 Bibliografía

3 Véase también

Tipos de vectores

Plásmidos

Los plásmidos fueron los primeros vectores que se desarrollaron, y aún son ampliamente usados. Estos
vectores proceden de moléculas de ADN de doble cadena extracromosómicas que se encuentran de
manera natural y que se replican autónomamente dentro de las células bacterianas.

pUC18

Es un plásmido muy utilizado, ya que presenta unas características que son muy beneficiosas:

-son derivados del pBR322,

- Es pequeño, de modo que puede transportar fragmentos de ADN relativamente grandes (de unos
10.000 pares de bases).

- Tiene un origen de replicación y puede producir hasta 500 copias de los fragmentos de ADN insertado
por célula.

- Se ha modificado para que presente muchas secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción
que se han agrupado en una región denominada polylinker o multiple cloning site.

- Permite la identificación sencilla de los plásmidos recombinantes, ya que contiene un fragmento del
gen bacteriano lacZ que produce colonias de color azul, al desdoblar y precipitar el reactivo X-Gal, por
medio de la enzima Beta-galactosidasa codificada por lacZ. Si se inserta un fragmento de ADN en el
polylinker, se inactiva este gen, la enzima Beta galactosidasa no se produce y por tanto el X-gal no se
precipita y esto da lugar a colonias de color blanco.

Bacteriófago lambda

Artículo principal: Fago λ

El genoma del fago lambda se ha cartografiado y secuenciado completamente. Para ser utilizado de
vector, el tercio central de su cromosoma puede ser reemplazado por ADN exógeno, sin que ello afecte a
la capacidad del fago de infectar células y formar cápsides.

Para clonar ADN utilizando este vector, se purifica el ADN del fago y se corta con una enzima de
restricción, con la misma enzima de restricción cortamos el fragmento de ADN de interés y los unimos
con una ADN ligasa. Los vectores lambda recombinantes se empaquetan in vitro en las cápsides
proteicas del fago, y se introducen en células huésped bacterianas. Dentro de las bacterias, los vectores
se replican y forman muchas copias del fago infectivo, llevando todas ellas el fragmento de ADN de
interés en la clonación. Los vectores fágicos pueden transportar fragmentos de hasta 20 kb ( kilobases).

Cósmidos

Artículo principal: Cósmido

Los cósmidos son vectores híbridos utilizando partes del cromosoma de lambda y de plásmidos. Tienen
la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del ADN del fago dentro de su
cubierta proteica, además contienen secuencias plasmídicas necesarias para la replicación y genes de
resistencia a antibióticos. Los cósmidos pueden transportar casi 50 kb de ADN insertado.

YAC

Artículo principal: Cromosoma artificial de levadura

Los YAC son cromosomas artificiales de levadura. Un YAC tiene telómeros en sus extremos, un origen de
replicación y un centrómero. Estos componentes están unidos a genes marcadores de selección y a un
grupo de enzimas de restricción para insertar ADN exógeno.

Estos cromosomas artificiales de levadura permiten clonar grandes trozos de ADN, de 100 a 1000 kb.
BAC

Artículo principal: Cromosoma artificial bacteriano

Un BAC es un cromosoma artificial bacteriano, basado en el plásmido de fertilidad ( factor F ) de

bacterias. Es el más utilizado.

El factor F es un plásmido que se replica independientemente y que transfiere información genética

durante la conjugación bacteriana.

Los BAC son circulares y muy estables, con lo que no se rompen. Tienen un tamaño de 100 kb y pueden
transportar insertos de entre 100 y 300 kb. Solo permiten una copia del cromosoma por célula.