MILES DE ESPERMATOZOOS, adheridos a la superficie de un óvu­ vado número de espermatozoos, sólo uno de ellos logrará fecundar el

lo de erizo de mar, aparecen en esta microfotografía, obtenida por Mia óvulo. Si penetrara más de uno (fenómeno conocido como polispermia)
Tegner. La superficie registrada aquí no es la membrana plasmática (la se produciría un exceso de cromosomas paternos, y el desarrollo
membrana externa del óvulo en sí) sino una cápsula denominada capa del embrión quedaría abortado. Los óvulos han desarrollado cier­
vitelina, que contiene los receptores de los espermatozoos. Pese al ele- tos mecanismos que evitan la polispermia. Aumento: 2880 diámetros

62
 El proceso de la fecundación
La unión de un espermatozoo y un óvulo desencadena una serie de

cambios transitorios en la concentración de iones, que impiden la

adición de más espermatozoos e inician el desarrollo embrionario

David Epel

L
a interacción entre un espermato­ dura de 3 a 8 meses, durante la cual una Sin embargo, sólo recientemente se ha
zoo y un óvulo marca una línea di­ hembra puede liberar hasta 400 millones empezado a hallar la respuesta a algunas
visoria entre la vida y la muerte. Si de óvulos, y un macho hasta 100.000 mi­ de las cuestiones fundamentales de los
ambas células interactúan con éxito, y tie­ llones de espermatozoos. Un hecho de mecanismos de la fecundación. Uno de
ne lugar la fecundación, sus respectivos notable interés para el investigador es los problemas que se han planteado du­
núcleos, que contienen cada uno la mitad que tanto los óvulos como los esperma­ rante largo tiempo los biólogos es cómo
de la dotación completa de cromosomas, tozoos se extraen de estos organismos el espermatozoo reconoce específicamen­
se unen, y se inicia el desarrollo de un con suma facilidad, pudiendo efectuarse te al óvulo. Aunque el espermatozoo
nuevo individuo. Si la interacción no es la conjugación in vitro en el laboratorio. parece alcanzar al óvulo en razón de su
satisfactoria, las células mueren al cabo Para ello, simplemente se suspenden los elevado número y por casualidad, ciertos
de unas pocas horas, o, a lo sumo, a los óvulos en agua marina, y se añade una mecanismos deben impedir que se una a
pocos días. Debido a ello, los organismos pequeña cantidad de espermatozoos, agi­ cualquier otro tipo de célula con que
vivos emplean una considerable cantidad tando. A los pocos segundos los óvulos pueda encontrarse durante el recorrido.
de energía, tanto fisiológica como de son fecundados sincrónicamente, lo que Se supone que el reconocimiento espe­
comportamiento, en asegurar que estas permite estudiar los fenómenos que se cífico del óvulo por el espermatozoo tie­
dos células lleguen a encontrarse y se presentan no sólo en un huevo, sino tam­ ne lugar cuando éste toma contacto con
produzca la fecundación. bién en un gran número de ellos. la cápsula gelatinosa que envuelve al
El proceso de la fecundación puede óvulo. Ciertas sustancias de la cápsula
n 1877, el zoólogo suizo Hermano gelatinosa interactúan con la parte de­
dividirse en tres fases principales: el re­
conocimiento del óvulo por el esperma­
E Fol observó a través del microscopio lantera de la membrana plasmática del
tozoo, la regulación de la entrada de cómo un espermatozoo de estrella de mar espermatozoo (que es su membrana más
espermatozoos en el óvulo, de forma que se adhería a un óvulo y lo fecundaba; con externa). Esta región del espermatozoo,
sólo el material genético de un esperma­ ello se daba fin a siglos de especulación. denominada acrosoma (del griego: cuerpo
tozoo se una al del óvulo, y la activación
del metabolismo del óvulo, hasta enton­
ces aletargado, para que dé comienzo la
división celular y el desarrollo embrio­
nario. La intensa investigación bio­
química de estos últimos años ha empe­
zado ya a proporcionar una descripción
de estos acontecimientos a nivel molecu­
lar. Las ideas surgidas a partir de estos
estudios pueden ayudarnos a compren­
der otros tipos de transformaciones celu­
lares, como las que ocurren en el cáncer,
y pueden también procurar nuevos enfo­
ques al control de la fertilidad humana.
Los huevos de invertebrados marinos,
particularmente los de equinodermos
(como el erizo de mar y las estrellas de
mar), constituyen el material clásico para
el estudio de la fecundación. Estos ani­
males liberan un elevado número de
gametos (óvulos o espermatozoos), de
los que sólo unos pocos llegan a inter­
actuar en el agua marina, dando una des­
EN LA SUPERFICIE DE UN HUEVO FECUNDADO de erizo de mar se observan varios es­
cendencia viable. Los erizos de mar, por permatozoos unidos a la capa vitelina. La superficie está recubierta de diminutas proyeccio­
ejemplo, tienen una época de cría que nes de la membrana plasmática, denominadas microvilli. Microfotografía de E. William Byrd.

63
puntiagudo), queda alterada a conse­
cuencia de la interacción, y libera enzi­
mas digestivos que permiten al esperma­
tozoo perforar una abertura en las capas
que envuelven al óvulo, de forma que
llegue a alcanzar la superficie del óvulo
propiamente dicho. En los invertebra­
dos, como el erizo de mar, el acrosoma
sufre simultáneamente un notable cam-
bio estructural: segrega un delgado fila­
mento. Este filamento se llama acro­
sómico; se engancha a la membrana
vitelina del óvulo, situada por debajo de
la cápsula gelatinosa. El lugar de fijación
es aparentemente una proteína receptora
asociada a la capa vitelina que reconoce
y enlaza con una proteína corr..olemen­
taria del filamento acrosómi:o. Kenji
Aketa y sus colegas, de la Universidad
de Nagoya, así como Víctor D. Yacquier
y sus colegas, de la Universidad de Cali­
fornia en Davis, han aislado indepen­
dientemente las proteínas complemen­
tarias. Estos autores han observado que,
preparando anticuerpos contra las pro­
teínas receptoras y añadiéndolos a una
suspensión de óvulos antes de la adición

ESPERMATOZOO

CAPA VITELINA

MEMBRANA PLASMATICA
CAPSULA GELATINOSA

MITOCONDRIA

GRANULO CORTICAL

ESQUEMA DE UN OVULO DE ERIZO DE MAR en el instante
de la fecundación. El óvulo tiene 75 micras de diámetro y está total­
mente recubierto por una gruesa cápsula gelatinosa, a través de la cual
penetra el espermatozoo, probablemente perforándola por medio de
enzimas digestivos. El espermatozoo se une luego a receptores de la
capa vitelina. Inmediatamente por debajo de la membrana plasmática,
hay miles de gránulos corticales, de una micra, que se fusionan con la
membrana plasmática segundos después de la fecundación y liberan su
contenido en el espacio que queda entre la membrana y la capa vitelina.
El protoplasma del óvulo contiene numerosos gránulos de vitelo y mito­
condrias (que proporcionan respectivamente alimento y energía química)
y un único núcleo, que posee la mitad de la dotación normal de cro­
mosomas. Esto último es el resultado de la división reductora, llamada
meiosis, que tiene lugar durante una fase avanzada de la maduración
del óvulo. La unión de un espermatozoo con el óvulo proporciona la otra
mitad de la dotación cromosómica normal, y activa la embriogénesis.

64
de espermatozoos, no se produce la fe­
cundación.
Una vez que la punta del filamento
acrosómico ha interactuado con el recep­
tor, perfora la membrana vitelina y se
fusiona con la membrana plasmática del
óvulo, situada inmediatamente por de­
bajo. Las membranas plasmáticas de am­
bas células se unen formando un puente
que progresivamente va aumentando de
tamaño, hasta que el espermatozoo que­
da completamente rodeado por la mem­
brana plasmática del óvulo, quedando
incorporado en el interior del óvulo.
Aunque es un único espermatozoo el
que normalmente se fusiona con la mem­
brana plasmática del óvulo y penetra en
él, muchos otros espermatozoos se ad­
hieren también a la superficie del óvulo
durante la inseminación. Por medio de
fotografías efectuadas con microscopio
electrónico de barrido por Mia Tegner en
mi laboratorio de la Scripps Institution
of Oceanography, se ha observado que,
en condiciones de saturación, pueden
unirse a un único óvulo hasta 1500 esper­ IMPORTANTES CAMBIOS ESTRUCTURALES, después de la interacción inicial entre el
matozoos. Aunque esta superabundan­ espermatozoo y el óvulo, que ocurren en los espermatozoos de los erizos de mar y de otros in­
cia es necesaria para asegurar que al me­ vertebrados. La parte delantera de la cabeza del espermatozoo segrega un delgado filamento
denominado filamento acrosómico que penetra en la capa vitelina del óvulo y se fusiona con la
nos un espermatozoo llegue a fecundar el membrana plasmática. Las dos fotografías, obtenidas con un microscopio electrónico de trans­
óvulo, puede resultar, en potencia, causa misión por Frank Collins, muestran un espermatozoo del erizo de. mar Lytechinus pictus an­
de problemas: si más de un espermato­ tes y después de la formación del filamento acrosómico. El aumento es de 45.500 diámetros.

zoo penetra en el óvulo, fenómeno que se

conoce como polispermia, el número de
cromosomas será mayor que el de una
dotación normal, y el desarrollo se de­
tendrá en los primeros estadios de la
embriogénesis. Por ello, las especies
animales han dehido desarrollar meca­
nismos que impiden que más de un es­
permatozoo penetre en el óvulo.

os trabajos realizados en los años 50

L por Lord Rothschild y Michael M.
Swann en 1 nglaterra, con óvulos de erizo
de mar, sugieren la existencia de dos
barreras distintas que evitan la polis­
permia: un bloqueo rápido e incompleto,
que tiene lugar durante los primeros se­
gundos del contacto espermatozoo-óvu­
lo, seguido de otro bloqueo más lento,
pero también más completo. La natura­
leza del primero de ellos ha sido descu­
bierta recientemente por Laurinda Jaffe
durante los experimentos realizados para
preparar su tesis doctoral en la Uni­
versidad de California en Los Angeles.
Introdujo microelectrodos en un óvulo
de erizo de mar y midió los cambios de
tensión entre el interior y el exterior de la
célula, inducidos por la· fecundación.
Observó que, aproximadamente un se­
gundo después del anclaje del esperma­
tozoo, existía un flujo de iones sodio ha­
MOMENTO DE LA FUSION de la punta del filamento acrosómico (izquierda) con un microvilli
cia el interior de la célula, provocando
del óvulo. M�diante esta fusión se crea un puente cito plasmático por el que el espermatozoo penetra
una breve variación en el potencial, pa· en el óvulo. La fotografía de microscopio electrónico de transmisión fue obtenida por Collins.

65
a b ESPERMATOZOO---='''"
SUPERNUMERARIO

CAPA VITELINA

FILAMENTO ACROSOMICO
RECEPTOR
---'' "'
DEL ESPERMATOZOO

e f

DESCARGA DEL GRANULO CORTICAL

LA REACCION CORTICAL se induce por la fusión del espermatozoo prolongan y entrelazan por encima de la cabeza del espermatozoo,
fecundante con el óvulo. En esta secuencia, el filamento acrosómico del arrastrándolo al interior del óvulo 1 c-e). La entrada del espermatozoo
espermatozoo penetra en la capa vitelina y se une a la membrana va acompañada de la fusión de 15.000 gránulos corticales con la mem­
plasmática del óvulo 1 a, b ). Los microvilli próximos al espermatozoo se brana plasmática del óvulo y la liberación de su contenido al espacio

recida a la del impulso nervioso. Al pa­
recer, este cambio de tensión es lo que
impide la entrada en el huevo de esper­
matozoos supernumerarios. Como con­
firmación de su teoría, Jaffe obtuvo que,
al incrementar artificialmente la tensión
a través de la membrana de óvulos hasta
un nivel observado normalmente después
de la fecundación (para lo que utilizaba
un "fijador de tensión") y añadiendo en­
tonces espermatozoos, no se producía
fecundación alguna.
Las investigaciones sobre el segundo
bloqueo de la polispermia se han dirigido
hacia la reacción cortical: un masivo
cambio estructural que se produce en el
huevo poco después de la fecundación.
Como hemos visto, la membrana plas­
mática del óvulo no fecundado está
rodeada por la delgada membrana vite­
lina. 1 nmediatamente por debajo de la
membrana plasmática se halla la capa
cortical, que contiene alrededor de unas
15.000 pequeñas vesículas llamadas grá­
nulos corticales. Cada uno de éstos tiene
un diámetro de aproximadamente una
micra ( 10-3 milímetros). Unos 25 a 35 se­
gundos después de que el filamento del
acrosoma del espermatozoo penetre en
la membrana vitelina, los gránulos corti­
cales se fusionan con la membrana plas­
mática y descargan su contenido en el
espacio que queda entre la membrana
plasmática y la vitelina, situada por enci­
ma de aquélla. Este proceso se inicia en
el lugar en que se unen el óvulo y el es­
permatozoo, propagándose rápidamente
por toda la superficie del huevo, y com­
pletándose veinte segundos más tarde.
1 análisis del contenido de los gránu-
E los corticales ha revelado que en ellos
hay una mezcla de enzimas, proteínas
estructurales y materiales coloidales
denominados mucopolisacáridos sulfa­
tados. Dos de estos enzimas fueron des­
critos por Edward J. Carroll, cuando
trabajaba en mi laboratorio (en la actua­
lidad se encuentra en la Universidad de
California en Riverside). Uno de los en­
zimas altera específicamente las proteí­
nas receptoras de la membrana vitelina,
de forma que los espermatozoos super­
numerarios unidos a ella quedan desen­
ganchados, y ningún otro puede tampoco
adherirse posteriormente. El segundo
enzima degrada las proteínas conectivas
que unen la membrana vitelina con la
plasmática, quedando ambas separadas
entre sí. La materia coloidal liberada de
los gránulos provoca por ósmosis la en­
trada de agua en el espacio que queda en­
tre las membranas vitelina y plasmática,
causando el hinchamiento de la mem­
brana vitelina y su distanciamiento de la
superficie del huevo.
Al cabo de un minuto de contacto en­
tre óvulo y espermatozoo, unas proteínas
procedentes de los gránulos corticales se
asocian con la membrana vitelina, ya
desunida, transformándola en una cu­
bierta protectora que se conoce como la
membrana de fecundación. Mientras
tanto, otro material coloidal procedente
de los gránulos va cubriendo la super­
ficie del huevo, y forma.una membrana
transparente llamada capa hialina,
que más adelante habrá de representar
un importante papel en la sujeción de las
células formadas por la segmentación del
huevo.
Toda esta secuencia de acontecimien­
tos que siguen a la reacción cortical su­
pone un bloqueo formidable de la polis­
permia. La destrucción de los lugares de
anclaje de los espermatozoos y la forma­
ción de la membrana de fecundación im-

66
 h DE FECUNDACION

situado por debajo de la capa vitelina lf). Esta reacción se propaga por la superficie del óvulo, desprendiendo los espermatozoos supernumera­
toda la superficie del óvulo en 20 segundos. Un enzima liberado de los rios 1 g). Las proteínas estructurales liberadas de los gránulos transfor­
gránulos destruye los receptores de espermatozoos situados en la capa man entonces la capa separada en una cubierta protectora denominada
vitelina; un segundo enzima provoca la separación de la capa vitelina de la membrana de fecundación 1 h). Esquema basado en otro de S. P. Schatten.

piden eficazmente el acercamiento de
espermatozoos supernumerarios a la
membrana plasmática y su fusión con
ésta.
Si todo sucede correctamente durante
la reacción cortical y después de ella, un
único espermatozoo penetra en el óvulo
y lo fecunda. El mecanismo por medio
del cual ocurre esto último aún no se
conoce, pero no depende de la motilidad
del espermatozoo: el flagelo del esperma­
tozoo deja de batir poco después de la
fusión con el óvulo. Las fotografías obte­
nidas con microscopio electrónico de
barrido por Gerald P. Schatten y Daniel
Mazia, de la Universidad de California
en Berkeley, sugieren que ciertas dimi­
nutas protuberancias llamadas microvi/li,
que cubren la superficie del óvulo, po­
drían estar implicadas en la absorción
del espermatozoo anclado, quizá de ma­
nera análoga a como una ameba absorbe
sus presas. Una vez que el espermatozoo
ha penetrado en el óvulo, su núcleo gira
180 grados y migra hacia el núcleo de
aquél. Finalmente, alrededor de 20 mi­
nutos después de la inseminación, los nú­
cleos paterno y materno se unen. Con la
condensación de los cromosonas y la p¡;-i-
mera segmentación del huevo se comple­
ta la fecundación, comenzando entonces
el desarrollo embrionario.
Antes de ser fecundado, el óvulo se en­
cuentra en un estado en el que su meta­
bolismo está suspendido. No está muy
claro el alcance exacto de tal represión,
pero tanto la respiración como el trans­
porte de substancias al exterior o al inte­
rior de la célula y la síntesis de proteínas
y de ARN están considerablemente reduci­
dos, no habiendo en absoluto síntesis de
ADN. Con la fecundación se produce una
activación general del aletargado meta­
bolismo de la célula y da comienzo el
desarrollo embrionario. Esta activación
e iniciación no se deben a que el esper­
matozoo aporte algún factor del que
carezca el óvulo, ya que el desarrollo de
éste puede inducirse experimentalmente
con sólo punzarlo mediante una aguja
o bien exponiéndolo a soluciones ácidas
o salinas. Aunque los embriones resul­
tantes habitualmente no sobrevivan,
ya que poseen sólo la mitad de la dota­
ción cromosómica característica de la
especie, y esto permite la expresión de
los genes letales sucesivos, el hecho de
que el óvulo pueda ser activado de esta
manera indica que los espermatozoos
se limitan a poner en funcionamiento un
programa genético previamente estable­
cido en aquél.
Cuando empecé a estudiar por primera
vez los fenómenos bioquímicos que tie­
nen lugar durante la activación del hue­
vo, hace ya 13 años, quedé fascinado y a
la vez confundido por el gran número de
cambios que se producen en el óvulo de
erizo de mar a consecuencia de la fusión
con el espermatozoo. Mi investigación
inicial mostró que el proceso de activa­
ción puede subdividirse en dos fases dis­
tintas: una multitud de cambios "tem­
pranos" que ocurren durante los primeros
60 segundos a partir del contacto óvulo­
espermatozoo y una serie de cambios
"tardíos" que comienzan cinco minutos
después del contacto.
a visión actual de los cambios que
L produce el proceso de la fecundación
indica que los cambios tempranos empie­
zan con una entrada de iones sodio al­
rededor de tres segundos después de la
adición de esperma, lo que, como hemos
visto, constituye un primer bloqueo de
la polispermia. Un segundo cambio, que

67
empieza aproximadamente a los 20 se­
gundos, es el aumento repentino de la
concentración de iones calcio en el inte­
rior de la célula. Pocos segundos después
penetra el espermatozoo y da comienzo
la reacción cortical. Casi simultánea­
mente empieza a producirse una entrada
masiva en el huevo de iones sodio pro­
cedentes del agua marina y una descarga
de ácido (hidrogeniones o protones)
desde el huevo al agua de mar. La libera­
ción del ácido comporta un considerable
descenso de la acidez del citoplasma del
huevo, como veremos más adelante.
Tres segundos después del comienzo sumo de oxígeno. Casi al mismo tiempo
de la reacción cortical se activa un enzi­ se libera glucosa-6-fosfato deshidroge­
ma que transforma casi la mitad de la nasa desde los depósitos celulares al
provisión celular de coenzima NAO citoplasma. Es éste uno de los enzimas
a su forma fosforilada, NADP. Am­ que se requieren en el metabolismo de
bas substancias son formas distintas de los azúcares.
la vitamina 8 niacina: la conversión Los cambios tardíos, que empiezan
de una en la otra desplaza el metabo­ cinco minutos después de la insemina­
lismo celular a un estado más reductor, ción, abarcan fenómenos de biosíntesis
y, por ello, de mayor síntesis. Seguida­ de una gran importancia para el desa­
mente, unos 1 O a 20 segundos después del rrollo embrionario. Aumenta la tasa de
comienzo de la reacción cortical, o unos síntesis de proteínas, y hay un incre­
35 a 45 después de la adición de esperma, mento en el intercambio de iones potasio
se produce un gran aumento en el con- a través de la membrana celular. Tam-

PENETRACION DEL ESPERMATOZOO FECUNDANTE en el
óvulo. Primero, el espermatozoo se fija a la capa vitelina por medio
del filamento acrosómico ( 1 }; seguidamente, se fusiona con la mem­
brana plasmática. El óvulo responde con una prolongación localizada
últimas imágenes se obtuvieron retirando del óvulo la membrana de
fecundación. Tres minutos después de la fecundación, el espermatozoo
se ha medio incorporado al óvulo y está recubierto por su membrana
plasmática ( 3 ) un minuto más tarde, sólo se aprecia la cola del esperma­
,

de los microvilli, que empiezan a rodear al espermatozoo ( 2 ) Luego

. tozoo (4 ). Las microfotografias 1, 3 y 4 han sido obtenidas por Tegner;
tiene lugar la reacción cortical, que provoca la separación de la capa la 2 por Schatten y Daniel Mazia, de la Universidad de California en
vitelina y su transformación en la membrana de fecundación. Las dos Berkeley. Las fotografías muestran un aumento de 15.000 diámetros.
bién a los cinco minutos se activan los
sistemas de transporte que introducen
aminoácidos, fosfato y nucleósidos en la
célula: se forman así los distintos bloques
que componen la estructura de las pro­
teínas y del ADN. A los 20 o 25 minutos
empieza el primer ciclo de síntesis de
ADN.
¿Cómo puede ser suficiente la fusión
de un espermatozoo con sólo el 0,0002
por ciento de la superficie del óvulo para
desencadenar todos estos cambios? Una
explicación puede ser que la diminuta
perturbación causada por el espermato­
zoo queda amplificada en la superficie
del óvulo, o cerca de ella, y que la señal
amplificada se transmite entonces a la
maquinaria bioquímica del citoplasma.
En otros sistemas, los mensajeros intra­
celulares como el AMP cíclico y los
pequeños iones como el calcio funcio­
nan de la misma manera. Los fenómenos
de activación, sin embargo, no han sido
correlacionados con un aumento de los
niveles de AMP cíclico.
En 1937, mi antiguo profesor Mazia,
que por aquel entonces trabajaba en el
laboratorio de L.Y. Heilbrunn de la Uni­
versidad de Pennsylvania, observó por
primera vez que la concentración de
iones calcio del interior de la célula au­
menta después de la fecundación. Hoy
en día los hallazgos de Mazia se conside­
rarían sospechosos, ya que el incremento
de los niveles de calcio se había detecta­
do en homogeneizados de huevos prepa­
rados en distintos tiempos después de la
fecundación. Quizá, podría argumentar­
se, el incremento observado es simple­
mente un artefacto causado por la des­
trucción de las células.
La validez de las observaciones de
Mazia ha sido verificada, de todas for­
mas, en un experimento llevado a cabo
recientemente por Ellis B. Ridgway, del
Medica! College of Virginia, en colabo­
ración con John C. Gilkey y Lionel
Jaffe, de la Universidad de Purdue. Em­
plearon la proteína luminiscente acuari­
na, que se extrae de una medusa. La
acuarina brilla sólo en presencia de iones
calcio, de forma que es de gran utilidad
para detectar los cambios en la cantidad
de calcio libre del interior de las células.
Ridgway y sus colaboradores observac
ron un bajo nivel de luminiscencia al
inyectar acuarina en los óvulos de gran
tamaño del pez Oryzias latipes. Un minu­
to después de la fecundación, la lumino­
sidad aumentaba diez mil veces, lo que
indicaba una liberación de grandes canti­
dades de calcio en el interior de la célu­
la. La luminiscencia permanecía elevada
durante el período de la reacción cor­
tical, descendiendo después al nivel ori-
ginal. Si los investigadores permanecían UNION DEL ESPERMATOZOO
previamente en una habitación a obscuras AL RECEPTOR
para adaptar sus ojos, y provocaban en­
tonces la fecundación de un único óvulo,
podían apreciar su brillo incluso a simple
vista. ENTRADA IONES SODIO
Mazia sugirió en principio que el CAMBIO POTENCIAL MEMBRANA
aumento de calcio libre inducido por la
fecundación estaba relacionado con la
activación del huevo, pero sin saber
exactamente si este incremento era una
causa primaria de la activación o sólo
una consecuencia de ella. Hace unos
años Richard A. Steinhardt, de la Uni­
IBERACION DE IONES CALCIO DE
versidad de California en Berkeley, y el
LOS DEPOSITOS INTRACELULARES
autor, e independientemente Edward
L. Chambers, Berton C. Pressman y
Birgit L. Rose, de la University of Mia­
mi School of Medicine, se dieron cuenta
de que podían distinguir entre estas dos EACCION CORTICAL. COMIENZO DE
LA LIBERACION DE ACIDO Y DE LA
alternativas con la ayuda del antibiótico
GRAN ENTRADA DE IONES SODIO
ionóforo A23187, recientemente descu­
CONVERSION DE NAO EN NADP
bierto. Los ionóforos en general son fár­
AUMENTO CONSUMO DE OXIGENO
macos que dan a la membrana celular
una permeabilidad selectiva a ciertos
SE COMPLETA LA FORMACION DE
iones. El A23l87 en particular hace per­ LA MEMBRANA DE.EECUNDACIOI':l.
meable la membrana a iones con do­
ble carga positiva, como el calcio o el
magnesio. Si el incremento de calcio
por sí solo causaba la activación del hue­
vo, razonamos entonces que la presen­ AUMENTO DELpH INTRACELULAR
(DESCENSO DE LA ACIDEZ)
cia de este ionóforo debería desencade­
nar el desarrollo partenogenéticamente
(en ausencia de espermatozoos).
mbos obtuvimos que el ionóforo era
A un agente partenogenético excepcio­ 400
� AUMENTO SINTESIS
ACTIVACION DE LOS SISTEMAS
PROTEINAS
nal. Activaba los óvulos de erizo de mar DE TRANSPORTE
con mayor velocidad que los espermato­
zoos y con una secuencia de hechos idénti­
700
ca a la que acompaña a la fecundación nor­ 800
900
mal. En colaboración con Carroll, en mi
1,000
laboratorio, y con Ryuzo Yanagimachi, FUSION DEL NUCLEO DEL OVULO
de la Universidad de Hawaii School of CON El DEL ESPERMATOZOO
Medicine, Steinhardt y yo hallamos que COMIENZO DE LA SINTESIS DE ADN
el ionóforo activaba los óvulos de una 2,000
gran variedad de tipos filéticos de ani­
males, entre los cuales había tunicados,
3,000
moluscos, anfibios y mamíferos. Para
sorpresa nuestra, la activación se daba en 4,000
ausencia de calcio o magnesio en el agua
5,000
marina; ello sugería que el mecanismo
6,000 L..:.....JP
!:.!R I.!.!:M
:!. D
.! � El!R�A...!: :!!
Y..! Ie2S� IO
!.!. IV � !:.!L�U!.!:LA� R--J
:!...CE
N
de acción del fármaco era liberar iones
de los reservorios unidos a la membrana
CRONOLOGIA de los fenómenos que siguen
por el interior de la célula. Los iones libe­ a la fecundación del óvulo del erizo de mar
rados eran presumiblemente de calcio, Strongylocentrotus purpuratus, representada en
ya que la mayoría de iones magnesio del escala semilogarítmica. Pueden dividirse en una
fase temprana, que tíene lugar en los primeros
óvulo del erizo de mar se encuentran en
60 segundos después de la fecundación (color
estado libre, mientras que los iones cal­ claro), y en una fase tardía, que empieza alre­
cio se encuentran en forma combinada dedor de 300 segundos después de la fecunda­
ción (color obscuro). En los cambios tempranos
de la que pueden ser liberados.
están principalmente implicadas moléculas pe­
¿Qué es exactamente lo que hace el queñas, como iones y coenzimas; los cambios
calcio? Un elegante experimento, llevado tardíos comprenden la síntesis de macromolé­
culas, como proteínas y ácido desoxirrobu­
a cabo por Yacquier, indica que el calcio
nucleico, así como la activación de los siste­
induce directamente la fusión de los grá- mas de transporte de aminoácidos y nucleósidos.
 nulos corticales con la membrana plas­
mática del óvulo. Vacquier fijó óvulos
de erizo de mar a un portaobjetos de
microscopio que había sido recubierto
con una proteína "pegajosa" cargada
positivamente, como la protamina. So­
metió entonces las células fijadas a un
chorro de agua sin calcio, provocando su
rotura, y quedando retenida su membra­
na plasmática junto con los gránulos cor­
ticales asociados a ella. Vacquier observó
que los gránulos corticales de estas cé­
lulas "vueltas del revés" liberaban su
contenido cuando se les añadía calcio.
¿Provoca la reacción cortical, indu­
cida por calcio, el desencadenamiento
de los cambios tardíos, como la síntesis
de proteínas y de ADN? Diversas ob­
servaciones importantes indican que no
es así. Por ejemplo, muchos fármacos
que bloquean la reacción cortical no
impiden la activación del desarrollo em­
brionario. Es más, en 1972, Steinhardt y
Mazia descubrieron que incubando óvu­
los en bajas concentraciones de amonía­
co podían activar varios de los cambios
tardíos, como la síntesis de proteínas,
de ADN e incluso la condensación de los
cromosomas, sin haber activado los cam­
bios tempranos, como la reacción corti­
cal. Experimentos posteriores efectuados
por Carroll, en mi laboratorio, y por Yac­
quier mostraron que la incubación de
óvulos en una variedad de compuestos
que tenían un grupo amino (NH,), por
ejemplo la procaína anestésica, tam­
bién activaban los cambios tardíos sin
haberse presentado los tempranos.
Todos estos hallazgos sugieren que los
cambios tempranos no son una condi­
ción previa necesaria para los tardíos.

E de activación de los cambios tardíos

1 primer indicio sobre el mecanismo

los obtuvimos en nuestra investigación de

la descarga de ácido por parte del óvulo,
que comienza al principio de la reacción
cortical y persiste durante los cuatro mi­
nutos siguientes de desarrollo. Un ácido
se define como la molécula que cede
fácilmente un protón a otra molécula:
puede ser también un protón libre (un
átomo de hidrógeno sin su único elec­
trón). Es decir, el óvulo va soltando mo­
léculas ácidas, o bien protones, al agua
marina que le rodea. En principio pensa­
mos que se liberaban moléculas ácidas,
LOS GRANULOS CORTICALES AISLADOS descargan su contenido mediante la adición de ya que se sabía que los mucopolisacári­
iones calcio. Victor D. Vacquier, de la Universidad de California en Davis, aisló los gránulos
dos sulfatados, descargados de los grá­
corticales fijando óvulos de erizo de mar en un portaobjetos y rompiéndolos con un chorro de agua
sin calcio. El chorro se llevaba el citoplasma, quedando la membrana plasmática "vuelta del nulos corticales, eran ácidos. No obstan­
revés" con unos cuantos gránulos corticales adheridos a ella, como se muestra en la fotografía te, surgió un inconveniente con esta
electrónica de barrido en la parte superior. Al añadir iones calcio a esta preparación, los gránulos
hipótesis cuando Miles R. Paul, que
se unían unos a otros en una reacción explosiva (abajo). Este experimento sugiere que el proceso
normal de fusión de los gránulos corticales con la membrana plasmática resulta de un aumento de entonces trabajaba en mi laboratorio
los iones calcio que se encuentran libres en el interior del óvulo. El aumento es de 10.000 diámetros. como estudiante graduado, descubrió

70
 .028 7.4 !

o o
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1- 1-
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10-7 .020 6.6

o 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1,000
TIEMPO (SEGUNDOS)

VARIACIONES EN LA CONCENTRACION de iones sodio, calcio e
hidrogeniones (protones) que muestran hallarse implicados en muchos
de los cambios inducidos por la fecundación. Pocos segundos después de
la fecundación hay una pequeña entrada de iones sodio en el huevo, aso­
ciada con una despolarización eléctrica transitoria de la membrana celu­
lar. A los 20 segundos se liberan iones calcio de depósitos intracelulares,
<JUe aparentemente desencadenan la reacción cortical y otros cambios
tempranos. Alrededor de los 60 segundos, el contenido en sodio del huevo
empieza a incrementarse, junto con una salida de protones y un aumento
del pH, que de alguna forma induce la actividad y la división celular. A los
180 segundos la concentración de calcio ha descendido al nivel original, y, entre
los 10 y los 20 minutos, el sodio y el pH retornan a sus niveles primitivos.

que los óvulos del gusano equiuroideo
Urechis caupo, que no sufren reacción
cortical, también liberaban ácido al ser
fecundados. Surgió un segundo proble­
ma con el ácido que se originaba en los
gránulos corticales, al calcular la canti­
dad de ácido desprendido por los óvulos
del erizo de mar: si el ácido estaba con­
tenido sólo en los gránulos, habría de
estar a una concentración de O, 1 moles
de ácido por litro, que parece ser dema­
siado elevada para un funcionamiento
normal de la célula.
La prueba definitiva de que la libe­
ración de ácido no estaba relacionada
con la reacción cortical provino de nues­
tro análisis de la activación de los cam­
bios tardíos por medio de amoníaco y
otras aminas. James D. Johnson y el
autor, en la Scripps 1 nstitution, y Paul,
que trabajaba en la Universidad de Vic­
toria, en el Canadá, hallaron que se
liberaba ácido cuando, al poner
óvulos en una solución de amoníaco o
procaína, se desencadenaban los cam­
bios tardíos, incluso sin haber tenido
lugar la reacción cortical. Cuando aña­
dimos después espermatozoos para in­
ducir la reacción cortical, observamos
con sorpresa que no había liberación
adicional de ácido. Por tanto, la libera­
ción de ácido está relacionada con la
activación de la síntesis y no con la se­
creción de los gránulos corticales.
La siguiente pista sobre la naturaleza
de la activación fue el descubrimiento
de Chambers de que se requieren iones
sodio para proseguir el desarrollo, des­
pués de la reacción cortical. Al fecundar
óvulos en agua de mar normal y trans­
ferirlos luego a agua de mar sin sodio, los
núcleos del espermatozoo y del óvulo
no lograron unirse, y el desarrollo se
detuvo. Daba la impresión de que los
óvulos habían detenido su actividad.
Cuando Chambers añadía iones sodio a
la solución, el desarrollo proseguía allí
donde se había detenido. El requerimien­
to de sodio se mantenía sólo durante
unos pocos minutos después de la reac­
ción cortical. Si los óvulos eran fecunda­
dos en agua de mar normal y transferidos
a agua de mar sin sodio diez minutos
después, el desarrollo no se detenía.
ste descubrimiento sugirió que el so-
E dio estaba implicado en la activación
biosintética. ¿Estaba relacionado con la
liberación de ácido? Para hallar la res­
los puesta detuvimos primero el desarrollo
de los óvulos, poniéndolos en agua de
mar sin sodio, 60 segundos después de la
fecundación, y medimos entonces la aci­
dez de la suspensión. Como ya espera­
bamos, no se había liberado nada de
ácido. No obstante, al añadir iones so­
dio a la suspensión aparecía ácido en el
agua marina y los huevos empezaban a de­
sarrollarse. Hicimos el experimento con
diversos iones que normalmente se ha­
llan en ·el agua de mar, pero sólo el sodio
iniciaba la liberación de ácido y estimu­
laba el desarrollo.
Esta observación sugirió que los iones
sodio estaban implicados en un intercam­
bio sodio-protón, en el cual un ion de so­
dio entra en la célula por cada protón que
sale de ella. Esta hipótesis se apoyaba
en nuestro hallazgo de que, al medir la
absorción de sodio con el isótopo radi­
activo sodio 22, ésta se correspondía
temporal y cuantitativamente con la li­
beración de ácido. También encontra­
mos que al bloquearse la entrada de so­
dio por medio del fármaco diurético
amiloride, no había activación del de­
sarrollo. Por tanto, la absorción de
sodio y la liberación de ácido parecía ser
esencial para el comienzo de la embrio­
génesis.
A continuación nos planteamos cuál
de estos dos procesos era el esencial para
el desencadenamiento del desarrollo. Un
experimento sugerido por los trabajos
de Chambers nos dio la respuesta. El
había encontrado que si se detenía el
desarrollo 60 segundos después de la
fecundación poniendo el huevo en agua
marina sin sodio, podía luego ponerse
en marcha de nuevo simplemente aña­
diendo amoníaco al agua salina. Descu­
brimos nosotros que en estas condiciones
había liberación de ácido, lo que indica
que es la salida de protones y no la en­
trada de iones el hecho crucial que pone
en marcha el desarrollo.
¿Cuál es el efecto de la salida de ácido
en el huevo? La hipótesis más razonable
es que la pérdida de ácido aumenta la
alcalinidad del citoplasma del huevo.
Comprobamos esta hipótesis con el mé-

71
todo poco ortodoxo, pero efectivo, de
homogeneizar los huevos a tiempos dis­
tintos tras la fecundación, y medir di­
rectamente la acidez mediante un elec­
trodo de pH. Suponiendo
mediciones pueden extrapolarse directa­
mente a la célula viva, revelan que el p H
aumenta (se hace menos ácido) en 0,4
unidades de pH durante los primeros
cinco minutos después de la fecunda­
ción. Este desplazamiento
sido confirmado recientemente por Shel­
don Shen en el laboratorio de Steinhardt,
que ha trabajado con microelectrodos
insertados directamente en
Todas las pruebas disponibles indican
que es la variación de pH lo que pone en
marcha la maquinaria de síntesis del
huevo después de la fecundación.
Este descubrimiento ha dado pie a
dos cuestiones fundamentales.
¿cuál es el cambio temprano dependien­
te del calcio que activa el sistema de
intercambio sodio-protón?
ción de esta pregunta requiere el co­
nocimiento de cómo modifican
cambios tempranos la estructura de la
superficie del huevo. Una posibilidad es
que la reacción cortical inducida por
el calcio altere la superficie del huevo
de tal forma que el sistema de ínter-
cambio sodio-protón quede expuesto o mostrado que la variación de pH indu­
activado. Una segunda posibilidad es cida por la fecundación es transitoria,
que el aumento de la concentración de y rápidamente desciende al nivel regis­
calcio en el interior de la célula altere trado en el óvulo. Nishioka ha hecho
que estas directamente la permeabilidad de la el importante descubrimiento de que,
membrana plasmática del huevo. Esta para iniciar el desarrollo, el pH sólo
hipótesis se desprende de los experi­ necesita aumentar durante un período
mentos de Michael Berridge y Robert de diez minutos. Este hallazgo significa
Meech, de la Universidad de Cam­ que el cambio de pH no actúa directa­
bridge, que hallaron que una elevada con­ mente incrementando la tasa de procesos
del pH ha centración de iones calcio en el interior sintéticos, ya que la mayoría de éstos
de la célula aumenta la permeabilidad de tienen lugar después del aumento tempo­
las células de las glándulas salivares de ral de pH. Antes, esta variación tran­
insectos y de las células nerviosas de sitoria de pH debe iniciar un cambio
el huevo. caracoles. Una tercera posibilidad es en la célula que, a su vez, tiene como
que la liberación de calcio afecte a consecuencia la activación del huevo.
proteínas contráctiles, como la miosina, ¿Cuál puede ser este cambio sensible
de tal forma que el sistema de inter­ al pH? Dado que son muchas las trans­
cambio sodio-protón se disponga en la formaciones que comienzan durante la
configuración adecuada para ser activo. activación, puede haber numerosos pro­
Una, Los futuros experimentos deberán per­ cesos sensibles al pH, o bien, alternativa­
mitirnos determinar cuál de estas tres mente, un efecto generalizado y persuasi­
posibilidades es la correcta. vo del pH aumentado en la célula. Una
La resolu­ hipótesis atractiva, que apoyaría este
a otra cuestión es: ¿Cómo logra el efecto general del pH en la célula, es que
los
L aumento de pH poner en marcha pro­ una molécula inhibidora se una a pro­
cesos metabólicos tales como la síntesis teínas muy determinadas, como enzimas
de proteínas y la replicación del ADN? o proteínas ribosómicas, y que la varia­
Los recientes trabajos de David Nishio­ ción temporal de pH disociara al inhi­
ka, un investigador postdoctorado de mi bidor de estas proteínas, permitiendo su
laboratorio, y de Shen y Steinhardt han funcionamiento en reacciones sintéticas.

UNION CAMBIO
ENTRADA BLOQUEO TEMPRANO
DEL ESPERMATOZOO DEL POTENCIAL
DE IONES SODIO DE LA POLISPERMIA
AL RECEPTOR DE MEMBRANA

FUSION
FORMACION
DE LAS MEMBRANAS
DE LA MEMBRANA
DEL OVULO

V� �
DE FECUNDA.CION
y EL ESPERMATOZOO

U
BER
�
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ION TEMPORA L � � ��
REACCION
CORTICAL

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_
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M0 DIFICAC10 N
� � v �-
BLOQUEO TARDIO
DE LA POLISPERMIA

- �
- -
DE IONES CALCIO DE LOS RECEPTORES

�
DE ESPERMATOZOOS

1 ? CAMBIOS REQUERIDOS
\lf PARA LA BIOSINTESIS

ACTIVACION
DEL SISTEMA
DE INTERCAMBIO
SODIO-PHOTON 1
SEPARACION ACTIVACION DIVISION CELULAR
DECRECE LA ACIDEZ ? ?
DE LAS PROTEINAS DE LA BIOSINTESIS y
DELpH CELULAR
INHIBIDORAS Y DEL TRANSPORTE EMBRIOGENESIS
---�����

MAPA DEL FLUJO que pone de manifiesto las hipotéticas relaciones
entre los cambios tempranos dependientes del calcio (como la reacción
cortical) y los cambios tardíos dependientes del pH (como la síntesis del
ADN). El mecanismo por el cual el calcio pone en marcha el sistema de
intercambio sodio-protón que provoca una disminución de la acidez del
citoplasma· del huevo (un aumento del pH) no se conoce todavía. Tampo­
co se sabe cómo esta variación del pH "pone en marcha" la síntesis de
proteínas y de ADN, pero podría estar implicada en ello la supresión
de proteínas inhibidoras de algunas proteínas funcionales, como las de
los ribosomas, o de proteínas estructurales, como las subunidades de ac­
tina o tubulina. En este último �aso, la supresión de una proteína inhibí­
dora permitiría polimerizarse a las subunidades, formando filamentos, lo
que tendría como consecuencia importantes cambios en la estructura ce­
lular; ello podría dar comienzo a una gran variedad de procesos bioquímicos.
Una vez que los inhibidores hubieran
sido destruidos, el huevo estaría irrever­
siblemente determinado a desarrollarse.
Un ejemplo interesante de este tipo de
regulación, y que bien pudiera aplicarse
a la activación del huevo, ha sido des­
crito por Lewis G. Tilney, de la Uni­
versidad de Pennsylvania. Tilney ha
estudiado la formación del filamento
acrosómico durante la fase inicial de
la fecundación, y ha descubierto que el
filamento se crea por la polimerización
explosiva de actina, una proteína con­
tráctil que puede hallarse en dos estados
distintos: como subunidades individua­
les o como cadena filamentosa. Hasta
que en el espermatozoo se desencadene
la formación del filamento acrosómico,
la actina de la cabeza permanece des­
polimerizada, aparentemente por medio
de la asociación de las subunidades de
actina con una proteína inhibidora.
Cuando el espermatozoo se activa con el
contacto con la cápsula gelatinosa del
óvulo, la proteína inhibidora se disocia
y las subunidades de actina se polime­
rizan espontáneamente. ¡ Tilney y sus
colegas han demostrado recientemente
que la disociación de la proteína inhi­
bidora se debe a un incremento del pH
intracelular' Aplicándolo a la activa­
ción del huevo, puede suponerse que
ciertas proteínas inhibidoras están uni­
das de forma análoga a las principales
proteínas estructurales del huevo, como
la actina o quizá la tubulina. La varia­
ción de pH provocaría, por tanto, la diso­
ciación de las proteínas inhibidoras uni­
das a las subunidades de actina o mecanismos
tubulina, permitiendo su polimerización.
Este hecho traería como consecuencia
una amplia reorganización de la estruc­
tura celular y daría comienzo a una
variedad de cambios, aparentemente no
relacionados.
Una cuestión fundamental que se deri-
va de estos descubrimientos es si los
mecanismos iónicos que regulan la ac­
tividad celular en los comienzos de la
vida siguen haciéndolo en los estadios
posteriores de la existencia del organis­
mo. El tejido nervioso y el muscular son
ejemplos conocidos en los que la fun­
ción del tejido está estrechamente rela­
cionada con pequeños iones, como los
de sodio, potasio y calcio, y existen in­
dicios recientes de que los iones podrían
participar también en la regulación de
procesos de mayor complejidad, como la
división y la diferenciación celular. Un
gran número de investigadores han com­
probado que incrementando los niveles
intracelulares de iones calcio o magne-
sio, bien por medio de ionóforos, bien
simplemente añadiendo los iones al me­
dio, logran transformar las células de
cultivos de tejidos, en principio en re­
poso, en células con una gran actividad
divisoria.
Más sorprendente aún es la reciente
demostración de Clarence D. y Char­
lotte Cone, del Yeterans Administration
Hospital de Hampton, Virginia, de que
puede inducirse la división de células
nerviosas (que normalmente no se di­
viden nunca) incrementando la concen­
tración de iones sodio en su interior.
Los cambios que se producen durante
el desarrollo también parecen estar re­
lacionados con variaciones iónicas. Por
ejemplo, Lester G. y Lucena J. Barth,
trabajando en Woods Hole, Massachu­
setts, han hallado que pequeñas varia­
ciones en la concentración de iones sodio
pueden desviar la diferenciación de las
células epiteliales de embriones de anfi­
bios de forma que lleguen a dar células
nerviosas. Un segundo ejemplo es la in­
ducción de procesos de desarrollo en ve­
getales por medio de la luz. El efector es
el pigmento vegetal fitocromo, y los tra­
bajos de Jan A. Newman y Winslow R.
Briggs, de la Carnegie 1 nstitution of
Washington's Department of Plant Bio­
logy, ha mostrado que el primer cambio
inducido por la luz afecta a la permea­
bilidad iónica de la membrana celular.
No está muy claro cómo los iones de
pequeño tamaño pueden producir efec­
tos tan diversos, y, desde luego, la difi­
cultad que supone imaginar posibles
ha conducido a muchos
investigadores a pasar por alto o a des­
preciar las hipótesis de que la modula­
ción del contenido iónico pudiera ser
un factor importante en la regulación de
las funciones celulares, o un iniciador
de cambios durante la diferenciación ce­
lular. El descubrimiento de que cambios
esporádicos en el calcio intracelular y en
el pH intracelular desencadenan el de­
sarrollo de los huevos del erizo de mar
ofrece un ejemplo que pone de manifies­
to cómo los iones pueden poner en
marcha actividades celulares completa­
mente nuevas. No sabemos aún si el pH
intracelular es un regulador importante
del desarrollo en huevos de otras espe­
cies, o si está implicado en otras funcio­
nes celulares. No obstante, parece pro­
bable que la regulación por medio de
modulaciones esporádicas o permanentes
del contenido iónico esté extendida por
todo el mundo animado y que los me­
canismos que regulan la actividad ce­
lular en la fecundación se emplean a lo
largo de toda la vida del organismo.