BIOACTIVIDAD EN ESPECIES

VEGETALES
Mgs Dayana Borja Espín, BQF.
Contenido
• Introducción
• Screennig farmacológico (ideas generales)
• Citotoxicidad
• Cultivo celular.
• Citotoxicidad (toxicidad)
• Citotoxicidad (evaluación actividad)
• Actividad antiinflamatoria
• Generalidad el proceso inflamatorio
• Ensayos de actividad antiinflamatoria

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Introducción
• El reino vegetal representa un enorme reservorio de moléculas bioactivas
(muchas aun no descubiertas).
• Una porción muy pequeña a sido sometida a “screening farmacológico”

• El proceso de investigación de moléculas activas (aisladas y puras) es

largo y muchas veces tedioso.
• Pero definitivamente es un proceso que requiere un enfoque
multidisciplinario. (Harborne, 1991)

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Introducción
• EL DESCUBRIMIENTO DE EXTRACTOS PROMISORIOS CON ACTIVIDAD
FARMACOLÓGICA Y EL SUBSECUENTE AISLAMIENTO DE SUS
CONSTITUYENTES, EXIGE REQUERIMIENTOS ESPECÍFICOS EN LOS
BIOENSAYOS A SER UTILIZADOS PARA TAL PROPÓSITO.
• DEBEN SER.
• SIMPLES
• RÁPIDOS
• REPRODUCIBLES Y
• NO COSTOSOS

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Introducción
• Desafortunadamente es muy poco frecuente la interacción entre
fitoquímicos, biólogos y farmacólogos.
El trabajo del fitoquímico es “una disciplina aburrida”
(McLaughlin. J.L.)
• “El aislamiento de compuesto y la elucidación de su estructura llevan
mucho tiempo, las publicación se apresuran y luego estos compuestos,
permanecen en estado latente y en descomposición durante años en el
estante fitoquímico.”

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Introducción
• Qué hacer entonces?!

• Los extractos deben someterse a “screening” para actividades biológicas

• Los extractos activos seleccionados, fraccionados directamente con

BIOENSAYOS y
• Solo los compuestos activos deben ser aislados e identificados.

• METODOLOGÍAS BÁSICAS:
• Técnicas de separación (Cromatografía)
• Métodos de elucidación estructural
• Bioensayos “simples”

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Introducción
• A que se refiere entonces “bioensayos simples”

• Técnicas “in house” que permitan establecer una actividad en forma rápida pero
segura y que den luz al Fitoquímico para establecer proyectos colaborativos
“multidisciplinarios”

• Un fitoquímico es capaz no solo de utilizar técnicas de bioensayo, puede también

combinar sus conocimientos adicionales para lograr el aislamiento y elucidación de la
moléculas.

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Introducción
• Y la ética??

• Ciertamente los ensayos en animales tienen ahora muchos detractores, y

de hecho normativas para su correcto uso, bastante específicas.
• Todos los estudios para evaluar componentes deben llevarse a cabo con
protocolos adecuados, de acuerdo a normativas (ICH)
• Pero siempre será necesario tener alternativas tendientes a disminuir las
pruebas en animales (in vivo), sustituyéndolas con pruebas in vitro.

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Introducción
• “alternativa a la experimentación animal”

• Se consideran todos aquellos métodos que

cumplen con algunos de los postulados del
principio de las 3R.
• Reemplazar
• Reducir
• Refinar

• Pruebas in vivo

• Pruebas in vitro

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Introducción
• PRUEBAS in vivo.

• Se evalua riesgo tóxico de los fármacos en especies animales.

• Un fármaco DEBE ser evaluado con pruebas preclínicas, antes de

tener una autorización de evaluación clínica.
• Modelos animales: recrear enfermedades (cáncer)

• Manipulación genética y celular para generar modelos.

• Comites de bioética

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Introducción
• PRUEBAS in vitro.

• Desarrollo de cultivos celulares, se han convertido en un sistema

efectivo para la evaluación de la toxicidad de muchos compuestos.
• Aunque aún es importante el uso de animales de experimentación
para evaluar ciertas actividades y toxicidad crónica.
• Varios trabajos de validación han demostrado suficiente correlación
entre los ensayos de toxicidad in vitro e in vivo (OMS, 2005).
• Los ensayos de citotoxicidad se utilizan también (líneas celulares)
para el estudio de actividad anticancerígena (efectos selectivos).

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2. CITOTOXICIDAD
Toxicidad
• La CITOTOXICIDAD se define como
una alteración de la funciones
celulares básicas que conlleva a un
daño que puede ser detectado.
• Estos daños se deben a efectos Actividad Equivalencia
tóxicos de drogas y compuestos
químicos.
• Las células a través de un estímulo
pierden su homeostasis que provoca Seguridad
su adaptación o le obliga a sufrir un
proceso regresivo hasta su muerte.

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2. CITOTOXICIDAD
• Evaluación de riesgo para el usuario en drogas nuevas.

• toxicidad en artemia salina

• Es el método más generalizado para evaluar seguridad en nuevas drogas,
especialmente de origen vegetal.
• Método en Artemia salina permite determinar CITOTOXICIDAD en la larva de este
crustáceo que es altamente sensible a una gran variedad de sustancias químicas.
• La toxicidad se expresa como CL50. (DL50)
• El ensayo dura próximamente 4 días y se evalúa la cantidad de nauplios
sobrevivientes a diferentes concentraciones de la droga a ensayar (1000, 100, 10 ppm
preparadas en solución acuosa o en DMSO.

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2. CITOTOXICIDAD
• Evaluación de riesgo para el usuario en drogas nuevas.

• toxicidad AGUDA: Determinación de dosis letal 50

• Cuantifica los efectos adversos que ocurren dentro de un breve lapso de tiempo con
posterioridad a la administración de una dosis única o múltiple.
• Consiste en el tratamiento de un grupo de animales con una serie matemáticamente
relacionada de dosis de una sustancias con el fin de determinar las dosis que mataría
al 50% de los animales de prueba.
CLASIFICACIÓN DE TÓXICOS DL50 mg/Kg VO
Extremadamente tóxica ≤ 1
Altamente tóxica ≤ 50
Moderadamente tóxica ≤ 500
Ligeramente tóxica ≤ 5000
Prácticamente no tóxica ≤ 15000
Relativamente inocua > 15000
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2. Citotoxicidad

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http://eur-lex.europa.eu/homepage.html
2. CITOTOXICIDAD
• En la actualidad la TOXICOLOGÍA alcanza enorme trascendencia social
debido al importante número de sustancias comercializadas y su posible
impacto sobre la salud pública y ambiental.
• Nacimiento de la “Toxicología reguladora” legalización y armonización de
los protocolos e informes de sustancias tóxicas a partir de normativa
legales.
• Como justificación a la Toxicología reguladora se suele dar alto costo a los
ensayos in vitro, sobretodo por los movimientos de defensa de animales
de experimentación. (Arencibia, 2003).

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2. CITOTOXICIDAD

• En la realidad los ensayos in vitro en comparación con los in vivo, no

requieren demasiada infraestructura, y minimizan el manejo de animales
vivos (condiciones).
• Se basan en el cultivo de células aisladas, métodos que se han abaratado
debido al gran desarrollo de los mismos.
• Las técnicas de cultivo y manejo de estas líneas celulares dependerá del
tipo de ensayo a realizar, aunque su fundamento general es similar.

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2. CITOTOXICIDAD
• Tipos de cultivos.
• Cultivos primarios y líneas celulares
• Mantenimiento de líneas celulares
• Subcultivos

• Componentes de un cultivos
• Naturaleza del sustrato
• Fase gaseosa
• Condiciones de incubación
• Composición del medio de cultivo

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2. CITOTOXICIDAD
• Técnicas básicas en cultivos en líneas celulares
• Descongelación de células y siembra
• Tripsinización
• Recuento celular (cámara de Neubauer)
• Congelación

• VIDEO (4 minutos) CULTIVO DE CELULAS EN EL LABORATORIO.mp4

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2. CITOTOXICIDAD

• Ensayos específicos para citotoxicidad

• Ensayo de captación del rojo neutro

• Ensayo de enlazamiento de azul de kenacid
• Ensayo del MTT
• Ensayo de clonación

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2. CITOTOXICIDAD
• Ensayo de captación del rojo neutro.
• Es una medida de la toxicidad de un compuesto a corto o largo plazo
• Se determina por la liberación del colorante (rojo neutro) debido a la pérdida de
viabilidad de la célula.
• Se considera que el compuesto a evaluar es tóxico independientemente de su
mecanismo de acción, pues interfiere en la división y multiplicación celular
• Las células deben ser conservadas en atmósfera inerte (N2 líq/-190º)
• Durante el procedimiento se realizan lecturas de la absorbancia de cada pozo a 540
nm (0,2-1.)
• Se deben evaluar hasta 6 concentraciones del compuesto (hasta 1000 ug/ml dep de
la solubilidad). (Arencibia, 2003).
% de inhibición = 100 – (DO(t)/DO(c)x100)
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2. CITOTOXICIDAD
• Ensayo de enlazamiento al azul de kenacid.
• Se mide el cambio en el contendio de proteínas totales (proliferación celular)
• Si se establece citotoxicidad, se debe además evaluar otros indicadores: síntesis de
ADN, funcionamiento de organelos (mitocondrias, lisosomas).
• Se exponen las células del cultivo por lo menos 72 horas al compuesto a analizar se
retira el producto y se adiciona el colorante el cual se enlaza a las proteínas
celulares.
• Se determina la cantidad de azul de kenacid retenido y se cuantifica el porcentaje
de inhibición del crecimeintos celular.
• (conservación y concentraciones).
% de inhibición = 100 – (DO(t)/DO(c)x100)
• Para determinar la CI50 se debe confeccionar un gráfico de % de inhibición en
función a la concentración (Arencibia, 2003).

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2. CITOTOXICIDAD
• Ensayo del MTT
• Revela daños celulares a nivel mitocondrial.
• Es un método sencillo que se desarrolla durante 4 días
• Se realiza en la línea célular transformada de mamífero V-79:fibroblastos
de pulmón de Hamster Chino.
• Se utiliza como reactivo el 3-(4,5 dimetil thiazol-2-yl)-2,5-difenil
tetrazoliumbromuro (MTT)
• Este producto penetra en las mitocondrias de la células VIABLES donde
es reducido por las deshidrogenasas dando lugar a un formazán
insoluble en el medio acuoso celular precipitando como cristales de
color azul.
• Se disuelven los critales con DMSO y se lee la absorbancia a 540 nm.

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2. CITOTOXICIDAD
• Ensayo de Clonación
• Es un ensayo de citotoxicidad que revela el daño celular producido a nivel de DNA.
• Mide la integridad reproductividad de la célula, es decir la capacidad que tienen la
célula después de sometida a un tratamiento de dividirse 6 veces
• Una serie de cultivos celulares en suspensión se someten a un tratamiento de corta
duración (2 horas) con los productos a ensayar. (CITED, 1995)
• Se retiran por centifugación los productos y se prepara una suspensión celular muy
diluída para sembrar en placas con una densidad celular entre 100 – 1000.
• Se incuban las placas 1 semana. Teñir con cristal violeta y determinar la eficiencia
clonogénica (integridad reproductiva)

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2. CITOTOXICIDAD
• Aplicaciones en oncología
(antitumorales)
• Caracterizar el comportamiento de la células
tumorales in vitro e in vivo.
• Revertir la agresividad tumoral mediante
drogas y herramientas genéticas tanto in
vitro como in vivo.
• Estudios funcionales: evaluar la dosis justa
de drogas y rectivos que generen el efecto
deseado sin dañar la monocapa. (Rivelli, A.
2011)

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Actividad antiinflamatoria
Extractos naturales
Inflamación
3. ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
• La inflamación fue descrita por Celsus en el año 10 AC como un
enrojecimiento e hinchazón con calor y dolor.
• El proceso inflamatorio involucra una serie de eventos inespecíficos que
pueden ser provocados por numerosos estímulos o agresiones del medio.
• Cada estímulo provoca una respuesta característica (variable menor)
• A nivel macroscópico la respuesta se da por conocidos signos clínicos :
• Edema, rubor, calor, dolor espontáneo, y desorden de la función tisular.

• La respuesta inflamatoria ocurre en tres fases distintas (mecanismos):

• Fase transitoria aguda
• Fase subaguda tardía.
• Fase proliferativa crónica (Gomez H. 2011)
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3. ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
• La inflamación es un mecanismo fisiopatológico básico y la magnitud de
la respuesta imflamatoria es crucial.
• Es por tanto un patología importante y de mucho interés en la
actualidad.
• El proceso involucra numerosas enzimas y mediadores, por lo que las
metodologías de investigación miden su expresión y evalúan las señales
BQ y fisiológicas.
• El proceso inflamatorio además activa otros mecanismos
antiinflamatorios.
• Video: Antiinflamatory\Proceso Inflamatorio.mp4
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3. ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
• En función de estos procesos se han diseñado los siguiente grandes
métodos para evaluar la actividad antiinflamatoria.
1. Prueba de la cyclooxigenasa (prostaglandina sintetasa)
2. Prueba de la 5-lipooxigenasa
3. Prueba del complemento
4. Prueba del granulosito quimioluminiscente
5. Prueba de liberación de histamina (leucocitos)
6. Prueba de transformación de T-linfocito
7. Quimiotaxis.

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3. ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
• Modelo de inflamación AGUDA
• Edema plantar por carragenina
• Edema auricular
• TPA (12-0-tetradecanoil forbol-13 acetato)
• Aceite de croton

• Modelos de inflamación SUBCRÓNICA O CRÓNICA

• Granulomas inducidos por disco de algodón
• Artritis por adyuvante y carragenina

• Técnicas específicas:
• Bolsa de aire en rata
• Peritonitis por carragenina
• Actividad ciclooxigenasa
• Permeabilidad capilar incrementada por histamina.

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3. ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
• Método de Edema plantar por carragenina:
• Consiste en la administración subcutánea de una pseudosolución de carragenina
(Chondrus crispus) en la aponeurosis plantar de rata o ratón, provocando una
reacción inflamatoria mediada por la liberación de varios autacoides (histamina,
serotonina, bradiquinina, etc.).
• Una hora después los mediadores histamina y serotonina son los principales.
• Una hora y media a dos horas después; intervienen la kininas (leucositos polim.)
• La última fase está mediada por las prostaglandinas.
• A las 4 horas ocurre la respuesta vascular máxima. (Cyted, 1995).

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3. ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
• Método de Edema plantar por carragenina:
• Se aplica el extracto (100-200 mg/Kg)o PA puro (máx 100 mg/Kg)
• 1 hora después se administra 0,05 ml de solución de carragenina
al 3% (aponeurosis plantar derecha del ratón).
• Grupo control (vehículo)
• Grupo referencia (indometacina)
• Medir el volumen de la pata antes y después de la inyección
(pletismómetro)
• Cálculo del procentaje de inhibición:
𝑋𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 −𝑋𝑝𝑟𝑜𝑏𝑙𝑒𝑚𝑎
%inhibición FA= 𝑥100
𝑋𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙

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3. ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
• Método de Edema auricular; por TPA
• Se basa en la aplicación de 12-0-tetradecanoil forbol-13 acetato (TPA) un
componente responsable de la inflamación del aceite de croton.
• La respuesta inflamatoria consiste en eritema, edema e inflitración por leucositos
polimorfonucleares, se liberan mediadores de tipo eicosanoide y se inicia la
desgranulación de mastocitos.
• Las sustancias inhibidoras de la biosíntesis de prostaglandinas se evalúan por este
método. (Cyted, 1995).

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3. ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
• Método de Edema auricular por aceite de croton:
• Consiste en la administración tópica de crotón, una mezcla de ésteres y otros componentes que poseen propiedades
irritantes.

• Provoca la inflamación localizada en la orejas de los animales de laboratorio, puede aplicarse conjuntamente con azul
de Evans con el fin de determinar la capacidad de la sustancia para inhibir la permebilidad vascular. (Gomez H. 2011)

• Para la valoración de resultados, se calcula el peso de las dos orejas de cada ratón, tratada y sin tratar:(Cyted, 1995).

𝑇𝑥100
% inflamación = 𝑋100
𝑆𝑇

𝐶−𝑇
% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 = 𝑋100
𝐶

𝐴𝐸𝑇 𝑥100
% 𝑖𝑛𝑐𝑟𝑒𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑝𝑒𝑟𝑚𝑒𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 = − 100
𝐴𝐸𝑆𝑇

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3. ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
• MODELOS DE INFLAMACIÓN SUBCRÓNICA O CRÓNICA

• A. GRANULOMAS INDUCIDOS POR DISCO DE ALGODÓN:

• Discos de algodón implantados bajo la región escapular del animal de ensayo. El producto
de ensayo se analiza por 7 días consecutivos.
• Se extraen los granulomas y se determina la diferencia de peso con respecto al disco
implantado el comienzo del ensayo (Cyted, 1995).

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3. ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
• MODELOS DE INFLAMACIÓN SUBCRÓNICA O CRÓNICA
• B. ARTRITIS POR ADYUVANTE Y CARRAGENINA:
• Se inyecta 0,1 ml de adyuvante conteniendo 0,2 mg de Mycobacterium butyricum
intradérmicamente en la zona basal de la cola. 6 días después se inyecta 0,1 ml de
carragenina al 1,5% en SF en la región subplantar de la pata trasera izq. (Cyted, 1995)

𝑉𝑡𝑥100
% 𝑖𝑛𝑓𝑙𝑎𝑚𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = − 100
𝑉0

𝑋𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − 𝑋𝑝𝑟𝑜𝑏𝑙𝑒𝑚𝑎
%𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑑𝑎 = 𝑥100
𝑋𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙

𝑋𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − 𝑋𝑝𝑟𝑜𝑏𝑙𝑒𝑚𝑎
%𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑙𝑜𝑛𝑔𝑎𝑑𝑎 = 𝑥100
𝑋𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − 𝑋𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 sin 𝑎𝑑𝑦
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3. ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
• TÉCNICAS ESPECÍFICAS:

• 1. Bolsa de aire en rata

• La cavidad sinovial puede utilizarse como una cámara de cultivo celular en la cual
se pueden añadir diversos agentes y estudiar sus efectos.
• Las respeustas de las células que recubren la cavidad varía en función de la
maduración de la misma.
• Se forma una bolsa de aire en el dorso del animal y luego de 6 días la inyección del
agente irritante.
• Se recoge poteriormente el exudado para relaizar con el las pruebas que nos
interesen.(Cyted, 1995).

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3. ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
• TÉCNICAS ESPECÍFICAS:

• 2. Peritonitis por carragenina

• Permite determinar in vivo la inhibición de las actividades ciclooxigenasa o
lipooxigenasa así como la migración leucocitaria.
• Se adminsitar por VO los productos a ensayar;
• Luego de 1 hora se inyecta IP 0,25 ml de carragenina al 0,75% en SF;
• 5 horas más tarde se sacrifican a los animales;
• se recogen los fluidos peritoneales y se determina el número de leucositos
presentes.
• Es una técnica costosa, que es más recomendada para compuestos puros.(Cyted,
1995).

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3. ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
• TÉCNICAS ESPECÍFICAS:

• 3. Actividad ciclo-oxigenasa
• Las ciclooxigenasas originan numerosos mediadores;
• El método experimental se basa en la estimulación de leucocitos peritoneales de
rata por el ionóforo A23187 que determina:
• la entrada de calcio en la célula,
• la activación de fosfolipasa A2 y
• La producción y liberación al medio de metabolitos del ácido araquidónico (2 vías)

• Recuento leucocitos.

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3. ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA (modelos)
• TÉCNICAS ESPECÍFICAS:

• 4. Permebilidad capilar incrementada por histamina.

• La histamina inyectada ID, provoca un incremento de la permeabilidad capilar a las
proteínas plasmáticas
• Colorantes como el azul de Evans (IV)se unen a las proteínas plasmáticas
(albúmina) y colorea el área de la piel en la que tiene lugar la extravasación de
proteínas debido a la histamina.
• Luego del proceso se mide la absorbancia del extracto de la piel cortada de cada
pápula del animal ensayado y se calcula el valor medio de los controles. (Cyted,
1995).
𝐷𝑂𝑐 − 𝐷𝑂𝑡
% 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑐𝑖ó𝑛 = 𝑥100
𝐷𝑂𝑐

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Bibliografía
1. Harborne, J. Dey, P. (1991).Method in plant biochemistry. Volumen 6. Assay
for bioactivity London. Academic Press,
2. Rivelli, A. (2011). Cultivos celulares y sus aplicaciones. Instituto de
Oncología “Angel Roffo” Departamento de Biología celular.
3. Arencibia, D. (2003). Principales ensayos para determinar citotoxicidad de
una sustancia, algunas consideraciones y su utilidad. Centro de Química
Farmacéutica. La Habana.
4. CYTED, (1995). Manual de Técnicas de Investigación. Proyecto X-1.
Búsqueda de principios bioactivos en plantas de la región.
5. Gómez, H. (2011). Actividad antiinflamatoria de Productos Naturales.
Grupo de investigación en Química de medicamentos. Boletín
Latinoamericano de Plantas Medicinales y Aromáticas. Santiago de Chile.
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Análisis de artículos
• Ejemplos

• Búsqueda de artículo
• Sitio de búsqueda
• Año del artículo

• Definir el tipo de artículo:

• Revisión
• Investigación

• Análisis de artículos
• Identificar los aspectos relevantes al tema.

• Exposición
• Se evalúa material de exposición y tiempo (10 min)
• Solvencia en solventar preguntas

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 UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
EVALUACIÓN DE EXPOSICIÓN DE ARTÍCULOS
PRODUCTOS NATURALES I

Docente: BQF Dayana Borja Espín M Sc

Título del artículo:

Integrantes del grupo:

Fecha:

MATRIZ DE VALORACION DE EXPOSICIONES

CRITERIOS INDICADORES DE CALIFICACION DEL DESEMPEÑO

Cumple con todas las
Muy bien de 0,7 a 1,0
expectativas
Bien Cumple a medias las expectativas de 0,3 a 0,6

Deficiente No cumple con las expectativas. de 0,1 a 0,2

INTEGRANTES

1
Tema (Se tiene una idea clara del
tema expuesto) • EVALUACIÓN artículos.xls
Análisis de artículos (Se analiza con
criterio el contenido del artículo)

Resumen (Se exponen en forma

2 adecuada los puntos importantes
del tema)

Preparación individual del tema (La

3
exposición refleja dominio del tema)

Exposición individual (la

5 presentación del estudiante es
segura y eficiente)
Tiempo de exposición (se
6 aprovecha el tiempo en forma
adecuada)
Preguntas y respuestas (se evalúa
7 la solvencia en respuestas
referentes a la tema)

8 Subtotal de calificaciones/07 0 0 0

8 NOTA DEL TRABAJO/2 0 0 0

OBSERVACIONES ESPECÍFICAS:

Firma:
30/08/2021 44

Docente: