Universidad Surcolombiana

Facultad de Educación
Programa Licenciatura en Ciencias Naturales: Física, Química y Biología
Biología de los microorganismos
Docente: Rosa Alcira Carreño Ruiz

LABORATORIO 1.

INFECCIONES POR GÉRMENES GRAM

POSITIVOS Y GRAM NEGATIVOS
OBJETIVOS

 Reconocer la morfología macroscópica y microscópica, al igual que las características de tinción de los
géneros Staphylococcus, Streptococcus y Enterobacteriaceae.
 Describir las principales patologías producidas por gérmenes Gram positivos y Gram negativos.
 Conocer los métodos utilizados para la identificación de bacterias patógenas Gram positivas y Gram
negativas
 Conocer la forma adecuada de recolección de las muestras para el diagnóstico microbiológico.

CONCEPTOS A DESARROLLAR

Las infecciones bacterianas por Gram positivos más frecuentes son las producidas por gérmenes de
morfología cocácea, entre los cuales están los géneros Staphylococcus y Streptococcus.

Los Staphylococcus causan infecciones en la comunidad que tienden a la cronicidad y recurrencia, además
de un creciente desarrollo de resistencia a los antibióticos. En la comunidad los Staphylococcus producen
infecciones de piel, mientras que las desarrolladas en el medio hospitalario son especialmente bacteriemias,
o de órgano específico. También algunos Staphylococcus producen enfermedades por toxinas

Los Streptococcus por su parte, causan infecciones específicas de especie que van desde infecciones leves
hasta infecciones severas que pueden comprometer la vida del paciente. Los Streptococcus suelen
clasificarse de acuerdo a su reacción serológica de Lancefield basada en el carbohidrato C especifico de
grupo.

Las bacterias gram negativas más reconocidas en la práctica clínica son los bacilos aerobios conocidos como
Enterobacterias, porque tienen como hábitat natural el tracto gastrointestinal del hombre y los animales,
además de una amplia distribución en el ambiente, en el suelo, el agua y las plantas. Estos microorganismos
son productores de infección intestinal y extraintestinal, adquiridas en la comunidad o en el hospital. Las
bacterias en la comunidad ocurren por contigüidad con el tracto gastrointestinal como en el caso de las
infecciones urinarias o a través de la transmisión fecal-oral por agua o alimentos contaminados con heces.
En el hospital la causa de estas infecciones es la flora endógena del paciente o la flora que lo coloniza a
través de catéteres, cirugías u otros procedimientos invasivos, lo cual deriva en infecciones sistémicas.

Las Enterobacterias, son un grupo de géneros bacterianos de morfología bacilar y tinción Gram Negativa,
aerobios y anaerobios facultativos que se hallan ampliamente distribuidos en la tierra y en las plantas; y son
colonizadores normales del tracto gastrointestinal del hombre y los animales. Estos microorganismos, son
productores de infección intestinal y extraintestinal. Constituyen un elevado porcentaje de las cepas
bacterianas Gram negativas aisladas en el laboratorio clínico de las más diversas muestras biológicas,
obtenidas tanto de paciente hospitalizado como de paciente ambulatorio. Dentro de las infecciones
extraintestinales, uno de los cuadros clínicos más frecuentes, es el compromiso del tracto urinario,
constituyendo la primera causa de infección urinaria por vía ascendente.

Por esta razón en esta práctica nos referiremos a los dos exámenes de laboratorio clínico utilizados en el
diagnóstico de la infección urinaria: el Urocultivo, y el Parcial de Orina. Debido a que la morfología
microscópica es común a todos los géneros de la familia ENTEROBACTERIACEAE, para su identificación en el
laboratorio debe recurrirse a sus características bioquímicas y metabólicas, que comprenden desde
fermentación de azúcares y alcoholes, como descomposición de algunos sustratos y producción de gran
cantidad de fermentos.

PREINFORME

1. Recordar los diferentes tipos de siembra, medios de cultivo de aislamiento primario, enriquecido y
diferencial.
2. Relacionando los temas vistos en teoría que tipo de gérmenes Gram positivos y Gram negativos
podemos encontrar en las diferentes secreciones y muestras que regularmente llegan al laboratorio de
Microbiología?
3. Investigar las condiciones del paciente para la toma de las siguientes muestras:
o Urocultivo con recuento de Colonias
o Coprocultivo
o Secreción de Herida Quirúrgica
o Líquido Peritoneal
o Líquido Céfalo Raquídeo
o Líquido Pleural
o Hemocultivo
o Lavado broncoalveolar
o Esputo.

PROCEDIMIENTO

1. Realice el análisis macroscópico y microscópico de las colonias presentes en las cajas de petri
entregadas por el monitor
2. Elabore un frotis y realice la coloración de gram
3. Observe al microscopio y correlacione con lo observado macroscópicamente.

PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO

Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto
de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy
difícil obtener una imagen clara y nítida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos
para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las
bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijación de una extensión bacteriana
hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y
bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber.

REALIZACIÓN DEL FROTIS

1. Colocar una pequeña gota de solución salina 0.90% en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria
muy poca cantidad de esta, por lo que se puede usar el asa redonda de siembra, ya que en el extremo
curvo de su filamento queda retenida una mínima gota.
2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad del cultivo
bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de solución salina. Remover la mezcla con el asa de
siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar su
secado.
Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya
que basta con colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de
siembra, directamente sobre el portaobjetos.
3. Esperar hasta que el líquido se seque sin acelerar su evaporación acercando el porta a la llama del
mechero, pues las células pueden deformarse o romperse.

FIJACIÓN DE LAS BACTERIAS AL PORTAOBJETOS

4. Por calor: Pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar enfriar el porta
objetos entre los pases.
Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser observadas al microscopio,
aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar con el proceso de tinción.

TINCIÓN DEL FROTIS BACTERIANO

5. Cubrir el frotis con abundante colorante y dejarlos actuar durante el tiempo que indique el protocolo de
cada tinción concreta. Suele oscilar entre 1 y 5 minutos.
6. Lavar la preparación con agua para eliminar el colorante. Esta operación se realiza inclinando el
portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de manera que resbale sobre el frotis,
pero sin que vaya dirigido directamente sobre él, pues podría arrastrar parte del frotis consigo. Eliminar
la máxima cantidad de agua de los portaobjetos golpeándolos por su canto con cuidado contra la
superficie de la mesa de trabajo.
7. Secar el portaobjetos: en ningún caso se debe frotar el mismo.
8. Observar la preparación al microscopio.

9. MONTAJE DEFINITIVO DE LA PREPARACIÓN (Opcional)

La técnica siguiente es de aplicación para cualquier preparación microscópica que se desee montar de forma
definitiva. Se anotará en un extremo del portaobjetos el contenido de la preparación, la fecha y, en su caso,
el nombre del alumno.

10. Montar la preparación. Emplear bálsamo de Canadá, euparal o algún medio de montaje sintético.
Utilizar preferiblemente cubreobjetos de 22x22 mm.

CUESTIONARIO

1. Explique el fundamento de la coloración de Gram y la de Zielh Neelsen. Establezca diferencias.

2. Para qué tipo de microorganismos se utiliza?
3. Indique el procedimiento de la coloración de Gram y los colorantes utilizados en su orden.