TEMA 9

En ingeniería genética vamos a tener una serie de herramientas que nos van a permitir
moldear una serie de materiales, que en este caso van a ser ácidos nucleicos, de tal manera
que al final vamos a obtener una construcción y esta construcción génica cuando la
introducimos dentro de una célula va a ser capaz de reprogramar la célula para que haga lo
que nosotros queremos que haga. En este sentido podemos obtener, por ejemplo, que una
célula sea capaz de sintetizar muchas cadenas de ADN, lo que se llama clonaje, o bien que
exprese una proteína u otras muchas cosas.

ENZIMAS COMÚNMENTE UTILIZADOS EN BIOTECNOLOGÍA

En biología molecular se pueden reagrupar en 4 grupos fundamentales:

- Nucleasas. Serían las tijeras. Son las enzimas capaces de cortar el ADN, mellarlo o
degradarlo.
- Ligasas. Serían el pegamento. Son las enzimas capaces de unir dos fragmentos de ADN.
- Enzimas modificadoras. Son las enzimas que van a modificar las características del ADN
a partir de las características que nosotros queremos que tenga. Añaden o eliminan
grupos y vamos a tener entre ellas, las quinasas, fosfatasas o transferasas.
- Polimerasas. Estas enzimas son capaces de sintetizan los materiales que vamos a
utilizar, nuestro ADN o ARN, nuestros ácidos nucleicos. De tal manera tenemos ADN
polimerasas o ARN polimerasa.

NUCLEASAS

Son aquellas enzimas que son capaces de hidrolizar los enlaces fosfodiéster entre dos
nucleótidos dentro de una cadena de ADN. Pueden actuar en cadena simple o en cadena
doble, de ADN o de ARN.

Dentro de las nucleasas vamos a tener dos tipos que son las exonucleasas y las endonucleasas.

Las exonucleasas lo que hacen es cortar el enlace fosfodiéster de los dos nucleótidos del
extremo de la cadena, en el extremo 3’, 5’ o ambos. El resultado va a ser un mononucleótido y
un oligonucleótido que es el resto de la cadena. Vamos a tener tantos nucleótidos como cortes
se den y la cadena se irá reduciendo en un nucleótido por cada corte.

ENDONUCLEASAS

El tipo más importante de endonucleasas son las enzimas de restricción (ER). Las ER son
enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces fosfodiéster internos y este corte se produce de
manera específica. Un corte interno en una doble cadena de ADN y de manera específica, es
decir, específica de secuencias que reconoce una secuencia y corta bien en esa propia
secuencia o en secuencias adyacentes. Las ER en la naturaleza forman parte de lo que se
conoce como sistema de Restricción-Modificación. Este sistema de Restricción-Modificación es
el sistema inmunológico que presentan algunas bacterias en defensa frente a fagos,
bacteriófagos. El sistema R-M tiene dos componentes: una ER, que es la endonucleasa que va a
cortar el ADN cuando reconozca una secuencia, y además tiene asociada esa enzima de
restricción una Metilasa que va a metilar en la misma secuencia de reconocimiento. Las
posibilidades que se pueden dar:
 - El ADN endógeno de la célula, el ADN de la propia bacteria, va a estar metilado en
estas secuencias de reconocimiento de tal manera que ni la Metilasa ni la ER van a
actuar cuando se encuentre esa secuencia de reconocimiento metilada.
- Cuando la célula empiece a replicar su ADN, una de las cadenas, la que se utiliza como
molde, estará metilada, pero la nueva cadena no estará metilada. Cuando este sistema
de R-M encuentre esta secuencia, la Metilasa metilará específicamente la cadena, esa
secuencia de reconocimiento será metilada en la cadena que no está metilada por lo
que la endonucleasa de restricción no corta.
- Si entra un fago, el ADN de ese fago será reconocido por el sistema de R-M y como
ninguna de las cadenas está metilada, será reconocido, no actuará la Metilasa y será
reconocido por la ER y se cortará, eliminando de esa manera el fago.

CLASIFICACIÓN

Existen muchos tipos de sistemas de R-M y se clasifican de muchas maneras, pero en este caso
vamos a ver los tipos I, tipos II y tipo III. Dentro de estos tipos, el que nos interesa para el
laboratorio es el tipo II. Del tipo II existen muchos y entre ellos están los tipos IIs pero en el
laboratorio se utilizan todos los tipos II menos los tipos IIs y este tipo de enzimas se utilizan en
el 90% de los casos.

Cuando queremos cortar algo y que el corte sea preciso las enzimas tipo II permiten hacer
esto. Primero van a permitir separar la actividad Metilasa y la actividad de la ER endonucleasa
porque la endonucleasa y la Metilasa son dos enzimas separadas. Como lo vamos a hacer in
vitro, puedo poner en un tubo la endonucleasa o bien la Metilasa de tal manera que se quiero
cortar añado la endonucleasa y si quiero proteger del corte una secuencia, pongo la Metilasa.
Otra característica es que su secuencia de reconocimiento es pequeña y además es simétrica y
el sitio de corte cae justo en la cadena de reconocimiento. Las secuencias suelen ser pequeñas
de entre 4 y 6 bases, aunque algunas también de 8, y son palindrómicas, se lee igual la cadena
de arriba de 5’ a 3’, de izquierda a derecha, que la de debajo en sentido 5’ a 3’, de derecha a
izquierda, esto se produce porque normalmente son homodímeros. Cortan justo dentro de
este sitio de reconocimiento, no tiene por qué ser en el centro, no necesitan ATP pero todas
(las ER) necesitan un ion divalente como cofactor y normalmente se utiliza el magnesio. Las
metilasas además van a necesitar ese ADN sin metionina como sustrato para la metilación.

TIPO II

En el nombre de una enzima, la primera letra que vamos a ver es el género, luego la especie,
seguido de la cepa y por último el orden, en qué orden se han ido descubriendo.

Las secuencias de reconocimiento pueden ser:

- La gran mayoría de las ER que se utilizan, permitiendo esto que sea mucho más
específico el corte, son palindrómicas y continuas, es decir, se leen igual de izquierda a
derecha en la cadena de arriba que de derecha a izquierda en la cadena de abajo.
- También hay ER que reconocen secuencias simétricas y discontinuas. Son simétricas
porque son iguales en un lado que en otro pero no todas las bases tienen que estar
reconocidas. Tengo unas partes que tienen que ser reconocidas y siempre tienen que
ser esas bases pero hay otras que me dan igual siempre que se mantenga el número
de bases entre estos dos sitios de reconocimiento. La proteína tiene unos salientes,
unas patitas, que se va a enganchar al ADN y necesita que esas dos partes estén a una
 distancia porque sino no se engancha y luego como el sitio de corte está a una
distancia del sitio de reconocimiento pues corta en unas bases.
- También pueden ser continuas y asimétricas. Es decir, todas las bases tienen que estar
pero no se lee igual en un sitio que en el otro, no son palindrómicas.

Los tipos de extremos que nos vamos a encontrar van a ser:

- Romo. Corta en el centro de la secuencia de reconocimiento y por tanto me quedan

planos, no hay ningún saliente. En los extremos romos todas las bases tienen
complementariedad, no queda ninguna de cadena simple.
- Cohesivos. La enzima no corta en el centro de la secuencia de reconocimiento sino que
corta en un extremo. Se producen dos cortes diferentes en las cadenas. Dependiendo
de si corta en la cadena de arriba hacia la izquierda o hacia la derecha de la secuencia
de reconocimiento, tenemos extremos protuberantes 3’ o 5’. Los protuberantes 5’ son
los que la cadena protuberante es la 5’ y esto sucede cuando la enzima corta hacia la
izquierda del centro en la cadena de arriba. Los 3’ es cuando la enzima corta hacia la
derecha del centro en la cadena de arriba en el sitio de reconocimiento.

Los extremos romos siempre son complementarios, se pueden pegar con cualquier extremo
romo, no hay ninguna restricción. Sin embargo, los extremos cohesivos tienen que ser
complementarios, lo que vaya a pegar tiene que complementarse con la otra cadena y hay
complementariedad de secuencia. Lo que no sobresale no tiene por qué ser complementario y
ser igual que el sitio de reconocimiento pero lo que sobresale sí tiene que ser complementario.
A la hora de ligar los extremos romos es mucho más difícil, la ligación es mucho más eficiente a
la hora de extremos cohesivos que de extremos romos.

Un isoesquizómero son dos proteínas que reconocen la misma secuencia y dan los mismos
cortes, los extremos que hacen son iguales. A nivel funcional son lo mismo pero al ser
proteínas distintas van a tener condiciones distintas y características proteicas distintas, por
ejemplo en su temperatura óptima de corte, en temperatura de degradación, en el buffer que
utilizan, todas las condiciones de reacción van a cambiar en una enzima y otra. Esto es
importante porque a veces necesitaré trabajar en algunas condiciones y otras veces en otras y
si tengo dos enzimas que hacen lo mismo en condiciones distintas, podré optimizar mis
condiciones.

Otra cosa que podemos encontrar son enzimas que reconociendo la misma secuencia nos den
extremos distintos y esto nos va a permitir jugar mucho con el tipo de corte que necesitemos.
Por ejemplo, SmaI y XmaI van a dar extremos diferentes. Si necesitamos extremos romos
cortamos con SmaI y si necesitamos extremos cohesivos hacer una inserción direccional
usamos XmaI. Ambas reconocen un sito de corte, el mismo sitio de restricción, y con un solo
sitio de restricción podemos obtener cosas diferentes.

Existen ER que, aunque reconocen secuencias distintas, BamHI reconoce una secuencia
diferente que BglII, lo que cambian son las partes de fuera del sitio de reconocimiento de
donde está en sitio de corte. Cuando corto, los extremos que generan son iguales entonces
ambos son complementarios y podré unir fragmentos BamHI con fragmentos BglII. Cuando yo
una con una ligasa un fragmento con el otro, esa será la nueva diana que nos encontramos,
modifica el sitio de reconocimiento. Esto ya no es lo mismo que teníamos antes, va a cambiar
respecto a las originales, las letras de los extremos van a modificarse. Por tanto, vamos a
perder los sitios de reconocimiento de las dos enzimas cuando unimos extremos compatibles
de enzimas que reconocen secuencias distintas y lo que tenemos es la pérdida de la secuencia
de ambas enzimas. Esto puede ser bueno cuando yo quiero concatenar insertos, nos interesa
que esos sitios de corte internos, si lo que quiero hacer un polímero, por ejemplo, muchas
veces interesa que estos sitios de corte se pierdan porque si no se pierden esos sitios de corte
cuando intente sacar esos fragmentos de algún sitio pues lo cortaré otra vez. Sin embargo, si
es una pieza sola cuando yo corte con una ER solo cortará en los extremos y podré sacar ese
polímero.

Todo esto son características de las enzimas que nos van a permitir dar mucho juego a la hora
de hacer nuestros clonajes. Teniendo en cuenta estas cosas yo podré utilizar las enzimas de
unas maneras o de otras para poder hacer los clonajes.

A veces las enzimas tienen sitios de reconocimiento degenerados. Esto quiere decir que no
todas las bases tienen que estar ahí, sino que tienen que ser un número en concreto y luego
algunas posiciones no pueden cambiar. Reconocen una secuencia que tiene varias bases que
tienen que ser esas y luego otras que nos da igual que base sea o que tiene que ser una purina
o una pirimidina pero da igual cual y tienen que tener ese orden, tiene que ser la misma
longitud y hay posiciones que pueden variar. En AvaI, por ejemplo, la primera y tercera citosina
y la cuarta y sexta guanina tienen que estar pero en la segunda y en la quinta posición, las
bases da igual las que sean, tienen que ser purinas o pirimidinas, pero hay más margen de
reconocimiento. Esto a veces es bueno porque abre más posibilidades a que dentro de una
misma secuencia pueda cortar más veces. También puede ser malo porque puede que yo
tenga muchos sitios de corte, aumenta mucho la probabilidad de que esto se dé porque voy a
tener un sitio de reconocimiento que solo cuatro de las bases tienen que ser las que son,
tienen que estar ahí, pero abre el abanico de posibilidades.

USOS EN EL LABORATORIO

Antes se utilizaban prácticamente para todo. Pero ahora las ER tienen un uso para clonaje,
para cortar en sitios determinados. Una ER para clonar se usa simplemente haciendo que el
fragmento que yo quiero introducir en una célula, para tener luego más copias o para que
exprese algo, lo voy a aislar, normalmente se aísla por PCR. Lo que haré es que en unos sitios le
introduciré a mi fragmento en los primers un sitio de corte para una ER en 5’ y en 3’ le
introduciré otro sitio de corte de ER. Esto se hace para que cuando yo corte el fragmento para
que tenga extremos cohesivos, estos extremos cohesivos sean compatibles con los mismos
extremos cohesivos que he generado el vector. De tal manera que se va a producir una
inserción bidireccional solo que el extremo de NcoI se une solo al extremo NcoI porque solo
será compatible con ese y el otro extremo de HindIII se unirá en el otro y por lo tanto solo se
unirá en una dirección y no dada la vuelta. Una vez que ya tengo los dos extremos compatibles
pongo una ligasa y se cierra mi vector y esto sería una construcción que lo meto en la célula y
haría lo que se quisiera.

En el laboratorio también se usan las ER para ver que el clonaje está bien. Cuando yo meta
este plásmido voy a poder tener una mezcla, voy a tener esas moléculas pero no todas se van a
ligar, a veces puede que se religue el vector y tenga lo del principio otra vez. Las células
transformantes son aquellas que tienen la construcción, un plásmido, y las células
recombinantes son las que tienen el plásmido con el inserto. Las transformantes tienen el
vector y por tanto tienen la resistencia a un antibiótico, que se la da ese vector, y las
recombinantes son las que tienen ese mismo plásmido y además el inserto. Las ER se puede
usar para hacer un screening de transformantes. Cojo distintas colonias de bacterias y veo qué
plásmido tienen, si tienen el plásmido con el inserto o solo tienen el plásmido. Cojo una ER y
corto, linealizando el vector. Si hago una electroforesis tendré la banda que corresponderá al
tamaño del vector. Si algún vector es más grande que otro, ese trozo de ADN es más grande y
al ser más grande, en una electroforesis recorrerá menos distancia que el más corto y por
tanto esas colonias serán transformantes y otros serán recombinantes. El conjunto de
plásmidos e inserto se llama constructo.

OTRO VÍDEO

Antes se usan prácticamente para todo porque eran la base de la biología molecular y de la
ingeniería genética pero actualmente se han quedado para dos usos.

Para clonaje siempre se usa. Se cortan los insertos, el ADN que se quiere aislar en una célula,
ese se corta con 2 ER y se va a introducir dentro de un vector que va a ser un ADN con
capacidad de replicación y algunos de ellos con todos los elementos para que eso se replique y
no se pierda dentro de la célula y por tanto, va a permitir clonar y tener muchas secuencias de
esto dentro de una célula porque voy a tener muchas copias. Además, algunos van a permitir
expresar la proteína o hacer algunas otras cosas. En el clonaje siempre se inserta un
fragmento de ADN, el que yo quiera, que se aísla por PCR normalmente aunque se puede aislar
por otros métodos, y este fragmento lo voy a cortar y lo voy insertar dentro de un vector que a
su vez tiene que estar cortado con una enzima que permita esa unión, es decir, que tenga
extremos compatibles y utilizando una ligasa ya tengo mi construcción y lo metería en la célula
para hacer lo que quisiera.

El otro uso normal es el screening de bacterias transformantes. Una bacteria transformante es

la que tiene un vector pero no tiene el inserto mientras que la recombinante es la que tiene el
vector con el inserto, el constructo completo. Hago una ligación y tengo el plásmido solo, si se
religa entre sí, o el plásmido con el inserto. Cuando lo meta en bacterias, las voy a transformar,
tiene un ADN foráneo, y cuando meta la mezcla habrá bacterias transformantes o
recombinantes. Pincharé varias colonias y veré cuales de ellas salen positivas para mi inserto.
Corto con una ER y veré que las recombinantes tendrán un fragmento más grande que las que
son transformantes que solo tienen el vector.

OTRAS APLICACIONES DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN: MAPAS DE RESTRICCIÓN, PCR-RFLP

Esto se hacía más antiguamente pero se siguen usando para hacer mapas de restricción. Lo
que se hace es que se van cortando con distintas enzimas y se ve qué fragmentos me va dando
ese fragmento de ADN. A partir de los distintos fragmentos, haciendo cortos simples y dobles,
podré montar donde cae cada sitio de corte. Estos mapas de restricción son específicos de
cada secuencia. Para poder ver, por ejemplo, de qué tipo es la carne o el pescado, en los
controles se hacen mapas de restricción porque aunque dos especies de atún, por ejemplo, se
parezcan mucho, van a tener una secuencia de ADN distinta en su ADN genómico, van a tener
secuencias que son polimórficas y tendrán mutaciones, que serán distintas a las de la otra
especie. Por tanto, su mapa de restricción va a ser distinto y lo que se hace es que se extrae el
ADN de ese atún y se compara con el de la otra especie y si el mapa de restricción no es el
mismo, no son la misma especie.

También se suele realizar el genotipado con ER. Los polimorfismos de un solo nucleótido, los
SNPs, son cambios de un nucleótido de un alelo a otro, no todas las personas vamos a tener las
mismas secuencias. Podemos genotipar y ver qué alelos tenemos por PCR-RFLP que
básicamente es hacer una PCR en la cual se amplifica ese fragmento y luego busco una enzima
de restricción que tenga una diana de corte justo donde hay un polimorfismo, de tal manera
que si el polimorfismo tiene el alelo que corresponde con la secuencia de reconocimiento de la
enzima, tendré banda, y sino pues no tendré banda, y así podré saber si eres homocigoto para
un alelo o para otro o heterocigoto.

EN EL LABORATORIO: REACCIÓN DE DIGESTIÓN CON ER

Lo más importante es fijar qué es lo quiero hacer, qué cadena de ADN quiero cortar, qué
secuencia tiene lo que quiero cortar y con qué enzima y ver cuántas veces corta la enzima esa
secuencia.

Lo segundo es hacer la reacción de PCR. Primero añadimos el agua, el agua necesaria para
llegar a 50 microlitros, aunque se suele utilizar menos volumen, depende de la cantidad que
quieras cortar. Añadimos el buffer de reacción, para que las moléculas choquen pero si se
pone mucho volumen, el ADN y las ER nunca van a chocar y no se va a producir la reacción,
que normalmente están a una concentración de 10X y su composición suele ser un buffer para
mantener el pH, sales para que se mantenga la fuerza iónica necesaria para que la enzima se
pegue pero no sea inespecífico el corte (si no se añade, la ER podría pegarse al ADN por
hidrofobicidad o por interacciones que no son específicas de secuencia) y no mucha, estas
rodean el ADN y por tanto las ER solo se pegará cuando la unión sea específica, el cofactor que
necesite la enzima y una proteína que se llama BSA que protege de la degradación a la enzima
y así la enzima está más tiempo siendo activa y se usa para congelar la enzima. Una vez que
tenemos el agua y el buffer y las condiciones de la enzima adecuada, añado el ADN, sin
contaminantes, que no se suele añadir más de 1 microgramo. Lo siguiente es la ER, que es lo
último ya que son muy débiles y trabajan a 35ºC y cuando los calientas se degradan y siempre
se manejan en frío, incluso toda la reacción se hace en frio hasta que una vez que esté todo
mezclado se pone a 37ºC. Llevan glicerol, una alta concentración de glicerol estas enzimas para
que no se degraden0. Una unidad de actividad enzimática de estas enzimas es la cantidad de
enzima que corta complementariamente 1 microgramo de ADN de fago lambda en 50
microlitros de volumen total en 1 hora. Una vez que ya he añadido todo, lo mezclo, doy un spin
down que es coger el tubo y meterlo en una centrífuga y bajar todo el volumen hacia abajo, y
lo pongo a 37ºC todo durante una hora. El tiempo depende del tipo de enzima y del tipo de
ADN. No se deja más tiempo porque la enzima se va a empezar a degradar y cuando se
degrada, no pierde su función del todo sino que empieza a perder su conformación y al
perderla, esa secuencia de reconocimiento que depende de la estructura y si esta cambia el
reconocimiento se puede relajar y cortar en sitios donde no debería. Una vez que ha
terminado la reacción hay que frenar a la enzima porque si he cortado y quiero ligar, si dejo la
enzima puede que rompa otra vez esa ligación. Para romper la enzima, como son muy débiles,
se realiza con un choque térmico, puedo calentarlo a 65-80ºC durante 20 segundos y así se
rompen completamente, en el 99% de los casos, pero en algunas de ellas esto es más
complicado y hay que hacer una rotura con disolventes orgánicos y una posterior
precipitación. Normalmente hay que poner la mezcla de reacción con una mezcla de
fenol/cloroformo que abriría la estructura de la célula y por tanto dejaría de ser activa y luego
haciendo una precipitación del ADN, con etanol y sales, para quitar la ER.

ACTIVIDAD STAR

Es cuando la enzima, en condiciones no óptimas, corta en sitios donde no debería cortar

aunque se parezca mucho al sitio que sería.
Si estoy haciendo un clonaje y corto donde no se debería, no voy a ser capaz de reproducir las
condiciones ni saber que estoy haciendo. Esto sucede cuando estoy cortando en condiciones
que no son óptimas para la enzima.

Por ejemplo, en EcoRI su la enzima corta donde debe corta en una secuencia pero cuando
tengo una actividad STAR, corta en otra secuencia. Pasamos de una secuenciad e 6 nucleótidos
a otra de 4 nucleótidos y esto es mucho más fácil que se produzca en el genoma y puede que
aparezcan muchos sitios de corte que no había antes, entonces voy a cortar donde no debo.
Esto ocurre porque lo que hago con la proteína es que se empieza a abrir y por tanto reconoce
otras cosas.

Lo que provoca que haya actividad STAR:

- Glicerol. Las ER se guardan en glicerol porque son enzimas muy débiles, se degradan
muy rápido, y para poderlas congelar y se degraden menos se pone glicerol para que
no se formen cristales que rompan la estructura proteica. Si pongo mucho glicerol en
mi reacción porque he puesto mucha enzima, va a poder tener actividad STAR.
- Si pongo mucha enzima y poco ADN, van a pasar dos cosas: aumento la concentración
de glicerol y además voy a formar el equilibrio. La secuencia nueva no la reconoce en
condiciones óptimas pero si fuerzo mucho el equilibrio a lo mejor empieza a
reconocerse. Si pongo mucha enzima respecto a la concentración de ADN puede que
reconozca otras secuencias.
- Si pongo baja fuerza iónica, la enzima se va a pegar por hidrofobicidad al ADN y va a
cortar sin especificidad de secuencia. Tengo que poner una fuerza iónica entre 25 y
150.
- Los pH altos. Si pongo pH muy altos, la enzima se degrada, se abre un poco aunque
sigue siendo activa pero reconoce otros sitios.
- Los disolventes orgánicos. Degradan la proteína.
- Para los cofactores usar siempre magnesio porque si usamos otro cofactor como
manganeso, cobre, zinc u otro ion divalente, la especificidad puede ser menor aunque
la afinidad mucho mayor. Favorecemos que se empiecen a producir equilibrios que no
se daban antes.
- Si ponemos mucho tiempo, empieza a degradarse la proteína y sigue siendo activa
pero reconoce otras cosas.

DIGESTIÓN PARCIAL

Hay veces que se necesita hacer una digestión parcial. Se utiliza cuando tenemos muchas
dianas dentro de un ADN y queremos cortar en distintos puntos, que no nos dé todos los
fragmentos.

Tenemos un fragmento de ADN que queremos cortar en un sitio específico porque

queremos un determinado fragmento, si cortara en condiciones óptimas no podría
obtenerlo. Si corto con la enzima cortaría dos veces y tendría tres fragmentos pero no el
que queremos. Cortamos en condiciones subóptimas pero esto no quiere decir que la
enzima corte mal, sino que no le da tiempo para cortar todas las veces que debería cortar.
Si pongo el ADN durante muy poco tiempo, tengo moléculas que no se hayan cortado,
tendré moléculas que se haya cortado solo una vez, tendré moléculas que se haya cortado
solo una vez por x sitio y luego tendré moléculas que se hayan cortado 3 veces, por tanto
tendré 5 fragmentos y el completo que no se ha cortado. Conforme dejo más tiempo o
pongo más enzima, hay más probabilidad de que se produzcan todos los cortes y al final
voy perdiendo fragmentos.

Esto normalmente se hace para cortar con una enzima determinada un fragmento
determinado. Pongo muy poco tiempo, hago una electroforesis y cojo la banda que me
interesa.

También se suelen utilizar para hacer genotecas genómicas. Tengo un genoma donde
pongo la enzima haciendo digestiones parciales de tal manera que tengo todas las
opciones de todos los fragmentos del genoma cortados. Con la ER corto plásmidos y al
ponerlos con los fragmentos, tendré todas las posibilidades de ADN de todo el genoma. En
cada plásmido habrá un trozo de ADN y eso se llama genoteca genómica. Si secuencio
tendré fragmentos que se solapen y eso me permitirá, aparte de saber la secuencia, poder
armarla. Voy a poder saber que secuencias hay en cada lugar y que orden tienen esos
trozos.

Se puede utilizar para poder obtener fragmentos de un ADN en el cual hay varias
secuencias de reconocimiento, puedo tener todas las variables haciendo una digestión
parcial.

SECUENCIA A DIGERIR

Lo más importante es saber que secuencia tengo y una vez que tengo la secuencia, se coge
un programa informático, por ejemplo el Neb cutter V2.0, y se ven los sitios de corte y va
leyendo si dentro de esas letras, existen esas secuencias de reconocimiento.

A la hora de digerir se tiene que saber la secuencia para ver cuantos sitios de
reconocimiento de la enzima hay, saber que la enzima solo corte en los sitios que
queremos y no corte más veces. A partir de ver la secuencia, se elige la enzima que
queremos.

DIGESTIÓN DOBLE

Cuando ya sé con que enzimas voy a cortar, tengo que ver es como voy a cortar y qué
precauciones tengo que tener cuando quiero cortar con esas dos enzimas, cuando quiero
hacer una digestión doble para hacer una inserción de un inserto en un vector
direccionado, que se pegue para un lado y no para otro. Tenemos que cortar con dos
enzimas para cada extremo para que el inserto se pegue por un extremo en un lado y por
el otro extremo en el otro lado. Como los extremos cohesivos necesitan
complementariedad de secuencia solo el extremo que tenga una secuencia se unirá con el
otro extremo y viceversa. Es decir, digerir un mismo fragmento de ADN con dos enzimas
de restricción, por ejemplo hacer un clonado direccional, para ello el inserto debe
introducirse correctamente por los dos extremos

Para cortar, hacer una digestión doble y un clonaje hay que tener en cuenta:

- El vector, como tengo que cortar en el vector. Ahora todos los sitios de restricción
están en un mismo sitio. En las secuencias de reconocimiento del vector se meten
todas las ER en un mismo sitio y se llama multicloning size. Ahí hay una serie de
secuencias seguidas para introducir mi inserto. Cuando vaya a cortar tengo que tener
en cuenta que las dos secuencias de reconocimiento que voy a cortar no son las
mismas y que tengan una cierta distancia de pares de bases entre ellas para que no se
 interrumpan unas con otras en el corte porque cuando corte una, la otra ya no puede
cortar al no estar la secuencia de reconocimiento y para que no haya impedimentos
estéricos.
- El fragmento. Cuando voy a cortar el fragmento, que normalmente lo aíslo por PCR,
tengo que tener en cuenta que la secuencia de reconocimiento no puede caer en el
extremo justo, siempre tiene que haber unas cuantas pares de bases en el extremo
para que cuando la ER se pegue no se caiga. El número de bases que hay que dejar
depende del tipo de enzima. Normalmente, se dejan entre 4 y 5 siempre que se pueda.

DIGESTIÓN DOBLE

Para una digestión doble también son importantes las características de cada enzima, el buffer
y las condiciones de corte.

Hay que mirar que temperatura tiene de corte cada enzima y qué buffer necesita y qué
eficiencia de corte tienen cada uno de los buffers. Elegiremos el buffer donde las dos enzimas
cortan al máximo y la temperatura óptima para las dos. Si esto no es posible, se corta primero
con una y luego con otra. Para ello, como ya he cortado con una con un buffer, tengo que
precipitar el ADN, es decir, hacer una extracción fenólica, luego precipitar el ADN, purificarlo y
volver a cortar pero esto conlleva una gran pérdida de rendimiento y de tiempo. Entonces lo
que se suele hacer cuando no hay buffers compatibles entre dos enzimas es corregir el buffer.
Corto con una en un volumen pequeño y luego duplico el volumen y cambio el buffer,
entonces el buffer anterior se va a diluir bastante y el nuevo buffer va a estar en su
concentración inicial, pudiendo salvar el experimento.

Las casas comerciales nos dan una tabla donde viene la enzima en fila y columna, el tipo de
buffer y el buffer que hay que elegir cuando hagamos digestiones dobles.

ENDONUCLEASAS

1.      NUCLEASA S1: endonucleasa que degrada ácidos nucleicos de cadena simple

dando lugar a mono u oligo nucleótidos fosforilados en 5’. Es cinco veces más activa en
ADN que ARN. Degrada todos los ADN de cadena simple totales, ADN de cadena doble
con mellas que generan cadenas sencillas, ADN con extremos de cadena simple,
desalineamiento o bucles. Tiene actividad fosfodiesterasa. Aplicaciones:
-Eliminar extremos cohesivos y transformarlos en extremos romos. Su cofactor es el Zn
2+. Rompe extremos cohesivos 5’ y 3’, lo que la distingue de la polimerasa klenow que
rompe extremos cohesivos también. Si ponemos alta concentración de enzima puede
romper la cadena doble por todas partes, quedando mononucleótidos.
-Eliminar bucles
-Localización de intrones y exones dentro de un gen: se aísla el ARN codificado por un
gen y se hibrida con el ADN genómico. Como el ARN no tiene intrones, se formarán
bucles en el ADN (que corresponden a los intrones) y las zonas que no se transcriben
tampoco solaparán. La nucleasa cortará donde no haya hibridación, eliminará la parte
del ADN que no se transcribe (como los intrones) y la región de la cola terminal del
ARN de manera que al correr los fragmentos en un gel de agarosa veré los exones.
-Localización de sitios de inicio y terminación de la transcripción: hibridamos el ARN y
ADN de un gen, y las partes no solapantes serán cortadas quedando el inicio de la
transcripción al principio de la cadena.
⮚  Nucleasa de soja: tiene una actividad menos severa y se usa para convertir
extremos protuberantes en romos.
 2.      DNAsaI: es una endonucleasa que hidroliza ADN de cadena doble y sencilla
mediante cortes en pirimindinas (C o T). Se utiliza para experimentos donde solo debe
haber ARN (por ejemplo, retrotranscripción o footprint). No es específica de secuencia.
Corta dentro de la doble cadena, una de ellas y obtenemos oligonucleótidos de
diferentes tamaños al azar. Su cofactor es Mg 2+ para hacer mellas en una de las dos
cadenas y si añadimos Mn 2+ corta ambas cadenas en el mismo sitio.

ENSAYO FOOTPRINT: para ver interacciones entre el ADN y proteínas como FT.

1.Se aísla ADN genómico y se amplifica la secuencia que quiero analizar por PCR, en la cual
añado NT marcados con P32 de manera que todas las cadenas amplificadas estén marcadas.

2.Añadir la proteína de interés que se une al ADN donde reconozca su secuencia. Esto se llama
crosslinking que es una unión covalente entre la proteína y el ADN con formaldehído (se
forman enlaces amida entre los grupos amino de los aas y grupos carboxilo presentes en el
formaldehído).

3.Añadir DNAsaI que realizara cortes aleatorios en la cadena excepto donde la proteína esté
pegada.

4.Ensayo control: ADN sin añadir proteína.

5.RESULTADOS:

-Ensayo control: obtengo todos los tamaños moleculares de las bandas desde el máximo
(cadena completa) hasta el más pequeño

-ADN con proteínas: observo las mismas bandas excepto algunas que no se ven que
corresponden con los fragmentos donde está unida la proteína.

Para ver si un FT se une al ADN hay otros ensayos como ensa (ensayo de retardo en gel): se
observa si en la amplificación hay retardo o no, según si hay proteína o no.

⮚  Ensayos de hipersensibilidad a DNAsaI: 

La cromatina esta empaquetada gracias a las histonas. En las regiones enhancer (regiones del
ADN que facilitan la acción de los promotores) se unen FT que abren los nucleosomas y
también favorecen que se unan otros FT al promotor y que se abran los nucleosomas para que
la ARN pol se una y transcriba el gen. Para determinar qué regiones son activas
transcripcionalmente, extraigo la cromatina, hago un crosslinking para que todas las proteínas
que estaban unidas al ADN (como FT o nucleosomas) se queden unidas. Añado DNAsa I que
cortará en las regiones donde está abierta la cromatina, tanto en regiones enhancer como en
promotores como en genes que se estén transcribiendo pero no va a cortar en regiones
compactadas. Corro los fragmentos en un gel de agarosa y en las zonas más altas de las
columnas del gel tengo la cromatina condensada (alto peso molecular) y entre 100-300 pb
están los fragmentos transcripcionalmente activos que son de bajo peso molecular. Después
corto en el gel las bandas de fragmentos transcripcionalmente activos, aíslo el ADN y lo
amplifico para hacer una librería, los secuencio e identifico. Mediante métodos informáticos
compruebo con qué regiones del genoma corresponden para ver cuáles son las regiones
reguladoras del genoma.
ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE CROMATINA: un pico significa que la cromatina está abierta en
esa región. Por ejemplo: los enhancer, los promotores, la región 3’ UTR y los genes
transcripcionalmente activos son los que aparecen abiertos como eucromatina.

ENDONUCLEASA QUE CORTA ARN:

1.Ribonucleasa A: endoribonucleasa que actúa sobre ARN de cadena sencilla degradándolo

mediante cortes en pirimidinas (C o T). Se usa para eliminar ARNs cuando se aísla ADN para un
ensayo porque el ARN interfiere, por ejemplo, al extraer plásmidos de una bacteria.

2. Ribonucleasa H: endoribonucleasa que degrada el ARN de híbridos ADN-ARN. Se utiliza para

eliminar cadenas de ARN antes de sintetizar la segunda copia de cDNA y para detectar estos
híbridos que se pueden formar en la naturaleza.

EXONUCLEASAS: enzimas que degradan el ADN o el ARN en los extremos, y van cortando de
uno en uno los NT de la cadena, pueden actuar en hebra simple o doble.

Normalmente se usan cuando tengo una cadena doble de ADN para eliminar una de las
cadenas y poder secuenciar o para eliminar fragmentos que sobresalgan de cadena simple.

LAS EXONUCLEASAS NO ENTRAN EN EL EXAMEN

ADN ligasas: en la célula eucariota y procariota hay que reparar las discontinuidades en la
hebra de ADN retrasada formadas durante la replicación (fragmentos de Okazaki), durante la
reparación de errores en la replicación o bien roturas de ADN por causas químicas, físicas... Las
ADN ligasas unen estos fragmentos de Okazaki, cierran las mellas…

Su papel en biotecnología es catalizar la unión de distintos fragmentos de ADN tanto si son

romos como cohesivos. Forman el enlace fosfodiéster entre 3’ OH y 5’ P. Necesita 2 cofactores:
un ión divalente (como Mg 2+) y ATP o NAD (que proporcionarán el AMP necesario).

1.La enzima se une a ATP y para ello es necesario el corte de un enlace fosfodiéster que libere
energía. Se pierde pirofosfato y queda AMP unido a la enzima (si lo que se une es NAD+, se
liberaría NMN).

2.La rotura entre el grupo amino y el fosfato en la enzima-AMP libera energía suficiente para
que se produzca el enlace fosfodiéster entre las dos cadenas, liberándose AMP.

⮚  Las ADN ligasas del fago y humanas necesitan ATP y Mg 2+ y las de E.Coli y
las bacterianas suelen utilizar NAD+.

Las más utilizadas en biología molecular son:

⮚  ADN ligasa del fago T7

⮚  ADN ligasa de E.coli
⮚  La más utilizada es la del fago T4: es la ligasa más eficiente.
-Necesita ATP, iones divalentes (Mg 2+, Mn 2+) y agentes reductores como b-
mercaptoetanol que mantiene el estado de oxidación-reducción óptimo para
favorecer la reacción y también favorece la linealidad de las dos cadenas que
se van a unir.
-pH óptimo es 7,2-7,8
-Inhibidores: poliaminas (se encuentran en polisacáridos y secuestran iones
Mg 2+)  y altas concentraciones de iones monovalentes que se unen al ADN y
no dejan a la ligasa acceder
 -Une extremos cohesivos y romos (para romos es necesaria más cantidad de
enzima).

FACTORES A TENER EN CUENTA:

-Radio molar vector-inserto (3:1): se pone 3 veces más vector que inserto para evitar
concatenaciones entre moléculas del inserto entre sí que no tendrían extremos compatibles
con el vector y no se podrían ligar. El vector se defosforila para que no se pegue consigo mismo
pero el inserto no se defosforila.

-Cantidad de ADN: entre 10-200 nanogramos.

-Volumen de reacción: 10-20 microlitros. Son pequeños para que las concentraciones de ADN
sean más altas y haya más probabilidad de choque y por lo tanto, se produzca la reacción.

-Para ligar extremos romos: 4ºC durante toda la noche. La temperatura es baja para no
degradar la enzima y se deja más tiempo para que haya más probabilidad de choque.

-Para ligar extremos cohesivos: 1h a temperatura ambiente. A veces tengo que poner a punto
mi ligación: la primera columna es los fragmaentos que queiro ligar sin ligasa. Cuando pongo 2
U de enzima y lo dejo 5 min casi todos los fragmentos se han ligado excepto algunos que no se
han pegado. Si pongo 2U y 45 minutos el resultado es casi el mismo, cuando añado poca
enzima (0,2 U) y 45 minutos ya los fragmentos no se unen del todo y aparecen las distintas
combinaciones de ligaciones entre fragmentos: esto quiere decir que no les ha dado tiempo a
unirse. En 5 minutos con 2U de enzima ya tendría mis fragmentos unidos.

-Para inactivar la ligasa aumento la T a 70ºC durante 10 min.

-Cantidad de ligasa: 1-10 U

Enzimas modificadores de las características del ADN para favorecer el clonaje:

FOSFATASA ALCALINA DE INTESTINO DE TERNERA (CIP): APLICACIONES 🡪

-Defosforilar el extremo 5’ P del vector y evitar el autoligamiento.

Si añado el vector de doble cadena sin P en 5’ a un fragmento de doble cadena que sí tiene
grupos P en 5’ 🡪 el extremo 5’ P del fragmento sí se va a unir pero el extremo 5’ del vector que
no lo tiene no. Queda un Nick en la cadena de abajo pero la estructura es estable y es
reconocida por la célula como si fuera un ADN dañado, por lo que los mecanismos de
reparación ligan la mella.

-Obtener sondas marcadas radiactivamente: eliminar el 5’P y sustituirlo por un fosfato

marcado (P32) gracias a una quinasa.

T4 POLINUCLEÓTIDO QUINASA (PNK): APLICACIONES 🡪

-Fosforilación de oligonucleótidos sintéticos en el extremo 5’: primer para hacer PCR que al
comprarlos carecen de este fosfato.

-Marcaje de ADN y ARN en el extremo 5’ por fosforilación con P32-ATP: hay que añadir PPP-
riboadenosina o rATP (polinucleótido quinasa).
TRANSFERASA TERMINAL (dNTT): es una ADN polimerasa que cataliza la adición de
nucleótidos al azar y sin molde al extremo 3’ protuberante y romo tanto en ADN de cadena
sencilla como doble. APLICACIONES:

-Facilitar los ensayos de clonación cuando no hay extremos compatibles: los extremos
cohesivos no son complementarios entre el vector y el inserto debido a estructuras
secundarias. Le añado un extremo cohesivo largo al vector (nucleótidos de guanina) y al
inserto le añado en otro tubo transferasa terminal y citosina por lo que tendrá extremos
cohesivos formados por C.

-Marcaje de los extremos 3’ de un ADN para identificar apoptosis: introduce NT marcados en el

extremo 3’. Se pueden marcar con radiación o bromodesoxiuridina (NT que puede ser
reconocido por anticuerpos marcados con fluorescencia). Si una célula está en apoptosis, su
DNA se encuentra fragmentado y como tiene muchos extremos 3’, se observa mucha más
fluorescencia debido a los anticuerpos unidos. Si hay menos fluorescencia es que la célula no
está en apoptosis y tiene un solo fragmento de ADN con un único extremo 3’OH.

ADN POLIMERASA NORMAL tiene 3 dominios: exonucleasa 3’-> 5’ que corrige errores,

exonucleasa 5’->3’ que elimina los primer y polimerasa 5’->3’.

ADN POLIMERASA: FRAGMENTO KLENOW

 Es un fragmento proteico de ADN pol I de E.Coli a la que se le escinde con la proteasa
subtilisina el dominio con actividad exonucleasa 5’ -> 3’ que eliminaba los cebadores y sigue
manteniendo la actividad correctora de errores en dirección 3’->5’ y la actividad polimerasa.

APLICACIONES:

-Síntesis de sondas de ADN marcadas: identifico la región para la cual quiero hacer la sonda
complementaria con PCR. Se desnaturaliza el ADN y se crean secuencias al azar de 6
nucleótidos artificialmente llamados hexámeros random (da igual la secuencia, tengo todas las
posibilidades y se pegan a cualquier lado por complementariedad de bases). Añado Klenow y
desoxinucleótidos marcados que sintetizará ADN marcado en dirección 5’ -> 3’.

-Ingeniería de extremos:

⮚  Rellenado de extremos 5’ protuberantes para generar extremos romos: tengo un

grupo 3’OH y una secuencia molde que usa para rellenar la cadena.

⮚  Sino hay un extremo 3’ OH, actúa la actividad exonucleasa 3’->5’ y recorta el

extremo 3’ protuberante para hacerlo romos (no tiene molde para añadir NT al
extremo 3’OH).

Como alternativas a Klenow tenemos la polimerasa de los fagos T4 y T7.

ADN POLIMERASAS TERMOESTABLES:

-Son como cualquier otra polimerasa pero se extraen de organismos que aguantan
temperaturas altísimas.

La PCR son ciclos divididos en 3 partes:

-Desnaturalización del ADN de doble cadena

-Hibridación con los cebadores:  se baja la temperatura

-Elongación de la cadena por la ADN pol termoestable.

La ADN polimerasa termoestable no se degraden al aguantar las altas temperaturas de la PCR y

así no haya que añadir cada nuevo ciclo de replicación una nueva polimerasa de E. coli.

CARACTERÍSTICAS:

-Termoestabilidad: es la vida media de la enzima a 92,5º. Importante para amplificaciones que

requieren un número de ciclos alto.

-Procesividad: número de nucleótidos incorporados por la ADN polimerasa antes de disociarse.

Se relaciona con la velocidad de amplificación de una secuencia y con la longitud de los
tamaños amplificados. A mayor procesividad, mayor velocidad y mayor longitud. Importante
para PCRs de diagnóstico rápido o en las que se amplifiquen grandes fragmentos (Ej. ORF
completo de un gen).

-Fidelidad: hace referencia al número de errores que comete la polimerasa durante la

amplificación. Se relaciona con la actividad exonucleasa 3’ -> 5’: si la enzima tiene esta
actividad cometerá menos errores (tendrá mucha más fidelidad). Importante cuando se
requiere mucha exactitud en la secuencia (por ej, expresión de proteínas).

-Especificidad: las amplificaciones inespecíficas y los dímeros de primers se deben a una

amplificación inespecífica. La temperatura de hibridación de los primer es 50ºC porque a
temperaturas más bajas los primer se unirían a cualquier región y la PCR sería inespecífica.
Para reducir la amplificación inespecífica se hace la PCR en hielo o se usan polimerasas hot
start que tienen un anticuerpo unido a su centro activo de manera que hasta que no se
desnaturaliza con las altas temperaturas de la PCR, el anticuerpo no se suelta del centro activo.

PRINCIPALES TIPOS DE ADN POLIMERASAS TERMOESTABLES: (TABLA DIAPO 31)

Es muy importante prestar atención a: la actividad exonucleasa; la procesividad (que longitud

de fragmentos es capaz de dar); la termoestabilidad y si presenta actividad transferasa
terminal (Cuando sintetizan añaden una adenina al final y eso se puede utilizar para hacer
clonaje.).

La Taq es muy barato y tiene una vida media alta, muy termoestable y tiene actividad
transferasa terminal. Cuando no importa mucho la secuencia se usa.

La Pfu tiene correcion de errores y es poco procesiva y poco termoestable.

Vent es la mas termoestable de todas y muy procesiva. No tiene actividad transferasa terminal.

Si quiero clonar un fragmento de PCR, se hace la PCR con la corrección de errores y en el

ultimo paso se la hace con taq para que así tengan A en el extremo. Las que tienen corrección
de error no tiene actividad transferasa terminal. Puede haber mezclas de las tres polimerasas

RETROTRANSCRIPTASAS: son DNA polimerasas dependientes de ARN que sintetizan ADN a

partir de un molde de ARN. Necesitan cebador para empezar la transcripción inversa. Estos
cebadores pueden ser:

-Oligonucleótidos de timina complementarios a la cola de A del ARNm: para retrotranscribir

ARNm.
-Hexámeros random que hibridan con cualquier secuencia del ARN (que no tienen cola poliA).
No sirven para obtener ORFs completos de un gen sino para amplificar otros ARN que no sean
mensajeros.

-Oligonucleótidos específicos de secuencia de un gen concreto.

Principales usos en biología molecular:

-Generar genotecas de expresión: una genoteca de ARNm. Aíslo ARNm, lo retrotranscribo para
obtener cADN que se introduce en vectores, como plásmidos. Con estos plásmidos
recombinantes puedo transformar bacterias.

-Analizar niveles de expresión por qRT-PCR (PCR a tiempo real): tengo mi ARNm y pongo
oligodT (complementarios a la cola poli A) para retrotranscribirlo. A continuación, se añade
ARNasa H que degrada el ARN del híbrido ADN-ARN y la segunda cadena del ADN la sintetizo
con una polimerasa normal. Después se amplifica con PCR haciendo uso de un marcador de
síntesis de ADN que cuantifica la cantidad de ADN, por lo que puedo saber de cuanta cantidad
de ADN partía al principio (la fluorescencia es proporcional al número de moléculas que había
inicialmente).

RETROTRANSCRIPTASAS USADAS EN BIOLOGÍA CELULAR:

-Procedente de aves (AMV): tiene más actividad RNAasa H y tiene actividad a temperatura
mayor (hasta 60ºC) por lo que se usa cuando el ARN tiene estructuras secundarias para
romperlas y dejar el ARN lineal. Se degrada ARN inespecíficamente, por lo que se puede perder
expresión.

-Procedente de ratón (M-MLV): se usa para producir cDNA completos porque tiene poca
actividad RNasa H y para amplificar ARNm con poca estructura secundaria porque no es activa
a altas temperaturas (hasta 50ºC).

Las que se hacen recombinantes tienen características de ambas: poca actividad RNAasa H y
trabajan a altas temperaturas.

ARN POLIMERASAS DE BACTERIÓFAGOS (transcripción in vitro):

La PCR muestra expresión total de un tejido pero la hibridación in situ muestra en qué parte de
la preparación histológica se expresa un gen.

Hibridación in situ: transcripción in vitro que se usa para obtener ribosondas marcadas
radiactivamente utilizadas en expresión de un ARN en un tejido y una célula en particular. La
sonda de ARN es complementaria con mi ARNm, por lo que hibridan y se observa la expresión
mediante fluorescencia.

En el plásmido introduzco un promotor de la ARN pol del fago y después la secuencia que se
retrotranscribe. Corto con BamHI, el plásmido se linealiza y después añado la ARN polimerasa
del fago y ribonucleótidos marcados con P32, la sonda solo reconocerá su promotor y por lo
tanto solo transcribirá mi secuencia de interés pero no el resto del plásmido.

Sp6, T7 y T3 solo reconocen sus promotores de origen viral y la polimerasa de E.Coli no los
reconoce.