Adn y analisis forense GUILLERMO J. JUVENAL (1) - DAVID A. GANGITANO (2) - RICARDO A. PADULA (2) (1) Divisi6n Bioquimica Nuclear - Centro Atomico Constituyentes ~ Comisién Nacional de Energla Atomica | (2) Policia Federal Argentina | La ciencia ha contribuid al desarrollo de diferenesdisciplinas. La forense no ha sido jena a estos adelante. En lo que resect a fa identifica Clin de personas, desde la observacidn de Juan Vacetich, reader del sistema dactilescipico, sean venido utilizando divers martadbrs para fa fi Iacin, El anditsis de ciertas eeueneias de ADN pose varias vntajas sobre el analisis de otros marcadores es muy estable, st eneuentra en cast to- das ls vestigos oligos, se neesitan muy pocas cantidades de muestras,y 1a mayor ventaja esque permite una inclusién superior det 99,99% Er presente artculo tiene como objetivo comentar los privcpios dela téenica del analiss del ADN en la idetifcacn frense, Estas ténicas se vie~ ‘nen sealizando en ia Camisién Nacional de Energia Atomica conjuntamente con la Policéa Federal Argentina desde varios afios, permitiendo la dilucidacin de varies dei. Science has contributed to the development of different disciplines. The forensic one was not an exception. Related to persons identifica- tion, since the creation by Juan Vucetich of the finger prints method, it has being used several marker for fliation, The analysis of certain se- quences of DNA has several advantages over the analysis of other markers: is very stable, is present in almost all the biologic traces, very small samples are needed, and the major advantage is that permits an inclusion of more than 99,99%, The objective of this papers to com> ‘ment the principles ofthe ONA analysis technique in forensic identficaton. This technique is being used in the National. Atomic Energy Com- mission, jointly with the Argentine Federal Police, since some time ago, enabling the elucidation of several crimes, Introduccién El genoma humano esta localizado principalmente en el nticleo celular. Une pequefia parte se lo encuentra en la mitocondria (Fig. 1). EI ADN es un polimero formado por dos cadenas anti paralelas constituidas por nucledtidos, unidos en forma covalen- tea través de uniones fosfodiester, descripta por primera vez por James Watson y Francis Crick en 1953. Cada nucleétido contie- ne: un azticar (la desoxiribosa), un grupo fosfato y una base ni- trogenada, En el ADN hay cuatro nucledtidos diferentes que di- fieren solamente en la base nitrogenada. Estas son la adenina (A), le citosina (C), la guenina (G) y a timina (1). Las dos cade- nas estén estabiizadas por la formacién de puentes de hidi6ge- no entre las bases complementarias de cada cadena (A con T, C con G) manteniendo juntas las dos cadenas. Esta implica que si ‘en una cadena encontramos la secuencia 5'..CGTTGTAAGCC..3" en la otra debemos encontrar 3°..GCAACATICGG..5". A cada apareamiento (G-C, AT) lo llamamos par de bases (Fig. 2) +109 bases) de la mayor parte del genoma humano se calcula ‘ADN nuclear que el ntimero de genes es de alrededor de 31000 a 35000 aunque este numero va vatiando a medida que se estudia con mayor detalle las secuencias abtenidas, El ADN es estable, sin embargo ocasionalmente ocurren mutaciones cambiando la se- EL ADN nuclear es lineal y se encuentra formando parte de los cromosomas. Una celula diploide de un ser humano contienen 23 pares de cromosomas: 22 pares de autosomas y un par de cromosomas sexuales (Xe Y). Cada uno de les cromosomas de un par proviene uno del padre y otto de la made. A cada par lo llarmamos cromosomas homélogos. Los 23 cromosomas contie- nen en total 3 mil millones de pares de bases aproximadamen- cuencias de nuclestidos. Esto puede traer consecuencias seve~ ras si en esas secuencias por ejemplo reside la informacién pa- ra una proteina, te. De éstas una muy pequefia proporcién comresponde a genes, En la actualidad luego dal secuenciamiento (a lectura de las 3 ran La mayorla de los genes determinan cuales son y en que orden eestarén dispuestos los aminodcidos de una determinada protei-na. A este ADN lo conocemos como ADN codificante. Sin em: bargo la mayor parte del ADN nuclear es no codificante. Parte del ADN no codificante esta constituido por ADN repetitive que como su nombre lo indica conesponde a diferentes se- cuencias de ADN que se encuentran repetidas a lo largo de todo el genoma, Dentro de éstas encontramos las de repet cidn interdispersa o intercalada que corresponden a secuen- cias de niimero variable de bases que se encuentra repetidas en diferentes lugares del genoma. Otras secuencias llamadas satélites estan repetidas en tandem, como los vagones de un tren (Fig. 3). De acuerdo a su tamano se las clasifica en sa- télites, mini y microsatélites. EI nlimero de repeticiones varia de una persona a otra, asi por ejemplo un individuo puede tener 7 repeticiones de determina: da secuencia en un cromosoma, heredadas del padi, y 13 re peticiones en el otro, heredadas de la madre. Mientras que en ‘oto individuo la misma secuencia se encuentra 11 veces repe- tida, es decir que lo que varies el largo del tren, en ambos c1o- ‘mosomas por ejemplo. Si bien dos individuos no emparentados pueden llegar a tener el rismo ntimero de repeticiones de una determinada secuencia, es muy dificl que dos individuos pre- senten el mismo perfil, sakio que sean gemelos, una ver anali- n el caso de que una persona tenga dos rmismos alelos para un determinado marcador se dice que es homocigota, si los alelos son diferentes para un mismo marca- dor entonces es heterocigota. Existen alelos que son mas proba bles de ser compartidos por diferentes individuos de une misma e'tnia, Se hace imprescindible contar por lo tanto con una base de datos (frecuencias de un alelo en une determinada pobla- cidn) a fin de poder interpretar los resultados y realizar los estu- dios estadisticos adecuados. Metodologia Hasta hace unos 15 attos los andlisis de filacion s6lo se basa- ban en el estudio de los sistemas de grupos sanguineos (ABO, Rh etc) y otras proteinas. La ventaja de estudiar el ADN radica ‘no sélo en Su! éstabilidad sino también en que el ADN es idén- tico tanto si se lo analiza en sangre, hueso, sernen, etc. En el ca~ 50 de patemidad se puede obtener el ADN de un bebe a pati, Por ejemplo, de un hisopado bucal. Por otra parte se necesitan cantidades infimas y el andlsis del ADN permite una inclusion superior al 99.99 En el caso de un estudio de paternidad se toman muestras de sangre o hisopados bucales de los supuestos padres y del hijo y se obtienes los respectivos En un hamicidio 0 vi ¥e compara el ADN extraido de diferentes fuentes tales como manchas de sangre, semen o saliva, depositados en ropa, vasos, cgarillos, sobres; hisopa dos vaginales o anales obtenidas de vietimas de violacién; objetos personales como peines, maquinas de aitar, cepi- llos de dientes, etc, obtenidas en la escena del crimen con el ADN de los posibles sospechosos, En la actualidad los métodos de deteccién del ADN requieren de tuna cierta cantidad de tal forma que el ADN extraldo debe ser ~amplifcado. Esto se logra mediante la técnica de reaccién en ca- ran ENTde trabajar a esta temperatura, Luego de varios ciclos, alrededor de 30-35 cidlos, se obtienen millones de copias (2n-2, donde n es el niimero de ciclos y es mayor que 2) (Fig. 4) Una vez amplificado la zona deseada del ADN, en es- te caso las secuencias repetidas en tindem, se iden- tifica el tamafo de los alelos mediante una electrofo- resis en gel y posterior comparacién con marcadores 3" 0CTEATTS, (Conn. .cORAEOCE 5° SCOACEARC...(2eA)m. .oanEneaR 3” Sete detec 8: gat Precmerirentoh om nn Ui i h i fl de tamanto conocido (Fig, 4). En la actualidad hay la boratorios, incluido el nuestro, que disponen de equi- pos automatizados. Estos equipos perniten el andliss, de. 16 marcadores a la vez, al emplear "primers" mar- cados con fluorescencia, permiten que el laser emit do por el equipo excite al colorante y la sefal emitida sea analizada por el mismo, Los comienzos La aplicacién del estudio de estas secuencias en el campo de la medicina forense fue descubierta por Alec Jeffreys de la Universidad de Leicester en In- glaterra en 1984, condecorado mas tarde con el ti- tulo de Sir. En. 1985 se emple6 por primera vez el andlisis del ADN en el Ambito de la justicia para la resoluci6n de un caso de inmigracién en el que es- taba involuctada una familia procedente de Ghana Y que residia en el Reino Unido. Uno de los ninos fue a visitar a su padre a Ghana y al regreso a Gran. Bretafa el funcionario de inmigracién no lo dejé en- trar aduciendo que la documentacién era falsa. Lue- go de realizados los estucios, llevados a cabo en el laboratorio de Jeffreys, comparando el ADN del ni fo con el de su madre y hermanos se pudo resol- ver su identidad. Posteriormente el mismo grupo pudo esclarecer un caso de violacion y asesinato. En 1983 en Narborough, una pequefia localidad cercana a Leicester, una chica de 15 aos fue viola- dena de la polimerasa (PCR) que revolucioné las ciencias biol6- gicas y que le valié el premio Nobel de Quimica en el ato 1993 a Kary Mullis. Esta técnica hace posible producr millones de co- polimerizacion la iq polimerasa, Esta enzima inicial mente fue obtenida de Thermus aquaticus (en la actualidad se obtiene por ingenierfa genética), una bacteria termofla que habi- ta en geisers y por lo tanto resistealtas temperaturas. Se debe te rer en cuenta que la desnaturalizacion del ADN requiere tempe- raturas de 95°C y ninguna enzima de organismos superiores pue- Com da y asesinada, Tres alos mds tarde otra chica fue asesinada de la misma forma en Narborough. La policia arresté @ Rodney Buckland, un joven de 17 afios, quien luego de un extenso interrogatorio admitid ser el autor del ase- sinato de la segunda joven pero no de la primera. La policia, convencida que el joven habia sido el autor de las dos viola- ciones, envié muestras de semen recogidas de las victimas y tuna muestra de sangre del acusado. El laboratorio de Jeffreys determiné que los dos homicidios habian sido cometido por la misma persona pero que n0 correspondia a Buckland convir- tidndose en el primer caso en que gracias a esta técnica pudo demostrarse la inocencia de un acusado. La polica comenz6 a realizar una enorme bisqueda a fin de dar con el culpable. Se tomaron muestras de todos los hombres de Narborough y su- butbios aledafios, alrededor de 5000. Al comienzo no se pu- do determinar al culpable, pero Colin Pitchfork en una reunionda Unicamente por via matema; es decir que sal vo que existan mutaciones, la secuencia del ADN mitocondrial es idéntica para todos los farriliares maternos. La transmision es précticamente cons- tante, se calcula una mutacién cada 30 genera- ciones aproximadamente. Estas caracteristicas son de suma utilidad en el caso del andlisis, por ejemplo, de hijos de desaparecidos en los que se pueda acceder al ADN de la abuele matema, Ade- ‘més, como el ADN mitocondial esté presente en tun nero de cientos 0 miles de copia por célu- le hace que el andlisis de este tipo de ADN sea de sume utlidad en el caso donde la muestra es muy escasa (un solo pelo) o el ADN nuclear pue- da estar degradado (huesos antiguos). Por econ. tratio, el ADN mitocondrial tiene poco poder dis- criminatorio y su andlisis requiere mayor tiempo y complejidad, Identificacién de los restos del Zar Nicolés 1 Las secuencias de ADN mitocondrial fueron las estudiadas para la identificacién de los restos hu- manos correspondientes a la ima familia real de Rusia, la del Zar Nicolds I. La familia, su médi- oy tres sirvientes, fueron brutalmente asesina- dos por los bolcheviques el 16 de julio de 1918 Ye presumia que una fosa ubicada en los Urales podia contener los huesos de los Romanov. En ju- lio de 1991 el Presidente Boris Yeltsin autorizé la exhumacién de los cadéveres. Aproximadamente 1000 fragmentos dse0s fueron ensamblados en 5 esqueletos femeninos y 4 masculinos. Un ex- perto ruso en tipficacién del ADN, Pavel Ivanov y Peter Gill del Servicio de Ciencia Forense briténi de amigos y un poco pasado de copas, comenté que habia lo- ‘grado que otra persona se presentase en su nombre para dar sangre, La mujer que atendia el ber hizo la denuncia a la policia Poco tiempo después, mediante el andlisis de su ADN se pudo determinar que Pitchfork habia sido el responsable de los asesi- ratos, ADN mitocondrial En lo que respecta al ADN mitocondrial, éste es una dable héli- ce circular de 16.569 pares de bases. Dentro de éstas se en- cuenta una region de aproximadamente 1100 pares de bases cuya secuencia presenta gran variabilidad entre individuos. El andlsis del ADN mitocondrial se basa justamente en la secuen ciacion de esta regién. Este presenta varias ventajas respecto al andlsis del ADN nuclear, Primero el ADN mitocondrial se here- co comenzaron a realizar los primeros estudios. El 15 de septiembre de 1992 Ivanov fue recibido en el aeropuerto de Heathrow por un director de la BBC quién ha- bia alquilado un coche funebre pues él sentia que "era inapro- Piado llevar los restos de la familia imperial rusa en el batil de mi Volvo". Inicialmente se establecié que 5 de los 9 esqueletos analizados correspondian a una familia, mediante el andlisis de STR, y si pertenecian a los Romanov estaban ausentes los de la princesa Anastasia y su hermano Alexei, Unico hijo varén, posi- ble mente quemados. Para establecer si se trataba de la familia Romanov se analizaron secuencias del ADN mitocondtial con descendientes de la familia. La muestra correspondiente a la Za- Fina Alejandra se pudo establecer gracias al andlisis de su sobr- no nieto de la linea matema, Felipe Duque de Edimburgo. En cuanto al Zat Nicolés fue més dificultoso. Los restos del herma- no del Zar, el Duque Georgii Romanov muerto de tuberculosis ‘en 1899, se encuentran en San Petersburgo y por aquel mo- mento se hacia dificil la exhumnacion de los mismos. Una sobri oma TErna del Zar, Tikhon Kulikovsky, se negé a cooperar, arguyendo que Gran Bretafia se habia negado a dar refugio a la familia de su tio luego de la revolucién. Se analizaron entonces muestras de parientes mas lejanos de la madre del Zar lograndose deter- miner su identidad, Posteriormente en julio de 1994 Ia Iglesia Ortodoxa Rusa accedié a que se exhumaran los restos del Du- que Romanov y se-estableci6 una cortespondencia entre las se- cuencias de su ADN mitocondral y la de los restos identifica- dos como el Zar Nicolés 1 El andlisis del ADN mitocondial sirié para determinar que el hombre de Neandertal no es antecesor del hombre moderno. La tearla sostenia que los Neandertales se extinguieron hace 30000 ahos y que coexistia con el hombre modeino en Euro- a. Sin embargo un grupo de cientifcos alemanes y estadouni- denses determinaron que los seres humanos modernos y el hombre de Neandertal divergieron genéticamente hace 500000 3 600000 afios, Otras aplicaciones Esta técnica tiene otras aplicaciones, por ejemplo determinar si una partida de caviar es genuina, identificar diferentes varieda- des de uvas, estudios de evolucién, migraciones, identificacién de especies. En algunos paises se ha comenzado a la implan- tacién en animales de raza de microchips conteniendo los mar- cadores genéticos para su identificacién. Seguramente en un futuro no muy lejano en nuestros documentos de identidad es- tarén indicados diferentes marcadores que determinarén ine- uivocamente la identidad de una persona determinada, El FBI ha desarrollado el sistema CODIS (Combined DNA Index Sys- tem) consistente en una base de datos de 13 marcadores pro- venientes de muestras de los delincuentes convictos as! como ‘en las muestras de los casos criminales con fines comparativos. tra base de datos es realizada por el Forencic Science Service en Inglaterra Nuestra experiencia La Comisién Nacional de Energia Atomica ha firmado un Con- vvenio con la Policia Federal Argentina en diciembre de! ano 1992 por el cual se realizan este tipo de estudios solicitados por la Justicia Penal, Personal de la PFA realiza estas tareas en la Diuisién Bioquimica Nuclear, Departamento de Radiobiologia del Centro Atémico Constituyentes. Esto ha permitido esclare- cer numerasos delitos de todo tipo correspondientes a justicia penal y correccional (robos, hamicidios, violaciones, etc). Este laboratorio forma parte del Grupo Iberoamericana de Trabajo tn Analisis de DNA (GITAD) y del Grupo de Expertas de Moni- toreo de ADN-Interpol. Nuestro laboratorio es evaluado a través de controles de calidad externos realizados anualmente por el GITAD. Participa ademas de un estudio multicéntrico a fin de obtener bases de datos poblacionales para los estudios de fil ion. Se han organizado también dos cursos para organismmos de seguridad de Latinoamérica con partcipacién de profesiona- Jes del Federal Bureau of Investigations (FBI). Por otra parte es- te servicio se ofrece a la comunidad para andlisis de paternided. REFERENCIAS Recombinant DNA, 2nd ed. 4. Warosn, M. Gilman, J, Witkowski, M. Zoller Scientific American Books, 1997. DNA Typing Protocols: Molecular Biology and Forensic Analysis, B. Budowle, J. Smith, T. Moret, 1A, Dizinno. ‘The Federal Bureau of Investigation, Quantico, VA. Washington, (C2000. Allele frequency in the population of Buenos Aires using Am- plitype PM+ DOA Joumal of Forensic Sciences 44:1329, 1999. RA, Padula, D. A. Gangitano, GJ. luvenal, 8. Budowle. Population Data on Eight STR Loci in Buenos Aires (Argentina) ©.A. Gangitano, G.J, Juvenal, J. A Lorente, B. Budowle, R.A Padula Journal of Forensic Sciences 46: 183, 2001 Distribution of Human HPRTB and HumF13A01 Alleles in Bue- nos Aires Population (Argentina) D. A, Gangitano, M. G. Garofalo, G. J. Juvenal, 8. Budowle, R A Padula Journal of Forensic Sciences 46: 418, 2001 (rac 2s EEE