UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS – ESPE

CÓDIGO: SGC.DI.505
VERSIÓN: 1.0
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA FECHA ULTIMA
REVISIÓN: 26/10/16
CARRERA: Ingeniería en Biotecnología

GUÍA PARA LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO, TALLER O CAMPO

PERIODO PREGRADO S-II Pregra
ASIGNATURA: Biología Sintética y Edición Genética LECTIVO: OCT21 - MAR22 NIVEL: do
DOCENTE: Saúl Lema NRC: 10022 PRÁCTICA N°: 2
LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA
PRÁCTICA: Virtual
TEMA DE LA Diseño y ensamblaje de plásmidos con enzimas de restricción
PRÁCTICA:
INTRODUCCIÓN:

Los vectores plasmídicos se han convertido en una herramienta fundamental en el campo de la biología molecular. Han permitido
varios descubrimientos importantes y se han convertido en herramientas esenciales tanto en la ciencia básica, como en la aplicada;
al proporcionar elementos novedosos para acceder a las características moleculares de la vida. En general, los vectores deben
tener un conjunto de características que los hagan adecuados para la transformación y selección en el organismo huésped. El
primer componente es el origen de replicación (ori) que será reconocido por la maquinaria de replicación celular y también definirá
el número de copias de un plásmido dado en la célula. Otro importante componente es el marcador de selección, que puede ser
cualquier gen que permita una ventaja selectiva a los transformantes positivos. Los marcadores pueden ser de auxotrofia,
correspondiente a una enzima metabólica que falta en el genoma del hospedador, o de resistencia a los antibióticos. Además,
generalmente se agrega un sitio de clonación múltiple (MCS) para facilitar la clonación del ADN deseado, que contiene varios sitios
reconocidos por diferentes enzimas de restricción. Los vectores se pueden dividir en tres clases típicas más comúnmente utilizadas
por los investigadores: vectores de clonación, vectores de expresión y vectores reporteros.
Se han desarrollado diversas estrategias para el ensamblaje de vectores plasmídicos. Cuando se clona mediante digestión por
restricción y ligadura, se utilizan enzimas de restricción para abrir un vector de expresión, e insertar un fragmento lineal de ADN,
que ha sido cortado por enzimas de restricción compatibles. Luego se utiliza una ADN ligasa, que une covalentemente el vector al
nuevo fragmento, generando así un plásmido circular completo que se puede mantener fácilmente en una variedad de sistemas
biológicos. En esta práctica se construirá un vector reportero mediante ensamblaje con enzimas de restricción, que detecte la
presencia de iones arsenito o arsenato en un medio líquido. El constructo estará constituido por un promotor sensible a As(3+) y se
le agregará una proteína reportera de fluorescencia verde.

OBJETIVOS:

 Aprender sobre el diseño y técnicas de ensamblaje in silico, para construcción de plásmidos.

 Construir un dispositivo para la detección de Arsénico mediante ensamblaje con enzimas de restricción.

MATERIALES:

REACTIVOS: N/A INSUMOS: N/A

EQUIPOS: Computador

MUESTRA: N/A

INSTRUCCIONES:

- Cree una cuenta en Benchling https://www.benchling.com con el correo institucional

- Instale el software Serial Cloner
- Utilice el navegador Chrome o Firefox
ACTIVIDADES POR DESARROLLAR:

1. Esquematización del sistema en SBOL Canvas

a) Ingresar a la página de SBOL Canvas https://sbolcanvas.org/canvas/
b) Hacer un esquema del constructo a ensamblar que permita la detección de arsénico. El constructo se compone de un
promotor sensible a la presencia de (As3+) y un gen reportero.

2. Diseño de un plásmido en Benchling para la detección de Arsénico

a) Ingresar a Benchling y crear un nuevo proyecto con el nombre “Ensamblaje Restricción”.
b) Importar la secuencia del promotor activado por Arsénico http://parts.igem.org/Part:BBa_J33201
c) Importar la secuencia del terminador de transcripción http://parts.igem.org/Part:BBa_B0015
d) Anotar la secuencia del terminador con el nombre BBa_B0015.
e) Buscar un vector en Addgene para la expresión de una proteína fluorescente en E. coli. Importar el vector
https://www.addgene.org/74236/
f) Hacer una digestión del plásmido pNCS-mClover3 con la enzima BsaBI para eliminar el promotor T7 nativo del vector.
Nombrar el producto de digestión como D1pNCS-mClover3.
g) Hacer una nueva digestión del plásmido D1pNCS-mClover3 con las enzimas BstBI y BspEI, para extraer el terminador
de T7. Nombrar el producto de digestión como D2pNCS-mClover3.
h) Insertar el sitio de restricción de BamHI en la secuencia del promotor de Arsénico, mediante overhang PCR. Nombrar
el Amplicón como ArsPromBamHI.
i) Ensamblar el promotor de Arsénico con el vector de expresión, mediante digestión con BamHI, utilizando la
herramienta Assembly Wizard. Nombrar el producto de ensamblaje como E1pNCS-mClover3.
j) Insertar el sitio de restricción de EcoRI en la secuencia del terminador BBa_B0015, mediante overhang PCR. Nombrar
el Amplicón como BBa_B0015EcoRI.
k) Ensamblar el terminador con el vector de expresión, mediante digestión con EcoRI, utilizando la herramienta
Assembly Wizard. Nombrar el producto de ensamblaje como Ars-Detector1.

3. Replicación del proceso de ensamblaje en Serial Cloner

a) Ensamblar el vector D2pNCS-mClover3 con ArsPromBamHI, aprovechando la ER BamHI.
b) Ensamblar el producto de ligación obtenido, con BBa_B0015EcoRI.
c) El producto de ensamblaje se nombra como Ars-Detector2.

4. Comparación de los productos de ensamblaje

a) Hacer un alineamiento entre ambos productos de ensamblaje para comparar resultados.
5. Revisión de la parte experimental

a) Revisar el protocolo de digestión en enzimas de restricción descrito en la página

http://parts.igem.org/Help:Protocols/Restriction_Digest . Ver el video que se encuentra en la página del procedimiento
general.

b) Ver el video de un procedimiento de digestión con enzimas de restricción https://www.youtube.com/watch?

v=GsWo8dCivWs

c) Ver el video de clonación con enzimas de restricción https://www.youtube.com/watch?v=ISJeduKx23w

RESULTADOS OBTENIDOS:
El estudiante debe ser capaz de responder las siguientes preguntas:

 ¿Qué características tiene el vector pNCS-mClover3 y por qué ha sido elegido para este ensamblaje?
 ¿Cuáles son las condiciones de crecimiento para la selección de las células después de la clonación?
 ¿Qué softwares se encuentran disponibles para diseñar un proceso de clonación con enzimas de restricción? Mencione al
menos 4.
 ¿Qué tamaño tiene el producto de ensamblaje Ars-Detector1? ¿Existe diferencias con el producto de ensamblaje obtenido
con Serial Cloner?
 De los videos observados, describa el procedimiento general para la clonación con enzimas de restricción.

CONCLUSIONES:

 La estrategia de ensamblaje mediante digestión y ligación, permite insertar secuencias dentro de un vector de expresión,
en dos etapas.
 Para el diseño in silico de un proceso de clonación, se requiere de la disponibilidad de sitios de restricción en la secuencia,
que tengan equivalencia con los sitios de restricción de otra secuencia.
 Cuando el proceso de clonación se lleva a una fase experimental, los marcadores de selección permiten mantener el
plásmido dentro de la bacteria, y sirven como evidencia del correcto ensamblaje del plásmido.

RECOMENDACIONES:

 Previo a un ensamblaje genómico, hacer un análisis de las enzimas de restricción disponible y los sitios donde se pueden
insertar las secuencias.
 Hacer un diagrama de proceso con los pasos requeridos para hacer este ensamblaje.
 Al momento de insertar los sitios de restricción por PCR en una secuencia, analizar las características termodinámicas de
los primers diseñados.

FIRMAS

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Nombre: Saúl Lema Ph.D. Nombre: Anabell Urbina, PhD. Nombre:

COORDINADOR DE ÁREA COORDINADOR DE LABORATORIOS
DOCENTE DE
CONOCIMIENTO