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Conceptos de Virología
CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS VIRUS

Los virus se diferencian de otros agentes infecciosos por su tamaño especialmente pequeño y porque son parásitos intracelulares estrictos (obligatorios), es decir tienen un
requerimiento absoluto de células huésped vivas para multiplicarse. No obstante, comparten ambas propiedades con ciertas bacterias pequeñas. En la actualidad se sabe que las
verdaderas caracterísiticas distintivas de los virus se relacionan con su organización estructural simple y su mecanismo de replicación (Tortora et al., 2007). En consecuencia, los
virus son estidades que:

Contienen un único tipo de ácido nucleico, sea DNA o RNA.

Contienen una cubierta proteica (a veces incluida en una envoltura de lípidos, proteínas e hidratos de carbono) que rodea el ácido nucleico.

Se multiplican dentro de las células vivas mediante el uso de la maquinaria de síntesis de la célula.

Inducen la síntesis de estructura especializadas capaces de transferir el ácido nucleico viral a otras células.

Los virus tienen pocas o ninguna enzima metabólica propia; lo cual carecen de enzimas para la síntesis de proteínas y la generación de ATP. Para multiplicarse deben tomar el control
de la maquinaria metabólica del huésped. Esto tiene considerable importancia médica para el desarrollo de fármacos antivirales, dado que la mayoría de los fármacos que podrían
interferir en la multiplicación viral también interferirían en el funcionamiento de la célula huésped y en consecuencia serían demasiado tóxicos para el uso clínico.

El siguiente cuadro 1 se comparan los virus con las bacterias para una mejor claridad (Tortora et al., 2007).

Cuadro 1: Comparación entre virus y bacterias.

Espectro de huéspedes

El espectro de huéspedes de un virus es el espectro de células a las que puede infectar. También existen casos aislados donde los virus cruzan la barrera del rango de huéspedes y lo
expanden. Hay virus que infectan invertebrados, vertebrados, plantas, protistas, hongos y bacterias pero la mayoría de los virus pueden infectar tipos específicos de células de una
sola especie huésped (Tortora et al., 2007).

El rango particular de huéspedes de un virus está determinado por los requerimientos del virus para la fijación específica a la célula huésped y por la disponibilidad de los factores
necesarios para la multiplicación viral. Para que un virus infecte a una
célula huésped la superficie externa del virus debe establecer interacciones
químicas con sitios receptores
específicos sobre la superficie celular. Los dos
componentes complementarios se mantienen unidos mediante enlaces débiles, por
ejemplo enlaces hidrógeno. La combinación de
muchos sitios de fijación y
receptores conduce a una fuerte asociación entre la célula huésped y el virus (Tortora et al., 2007).

ESTRUCTURA VIRAL

Un virión es una partícula viral infecciosa

completa, totalmente desarrollada, compuesta por ácido nucleico y rodeada de
una cubierta proteica que la protege del medio y que es un
vehículo de
transmisión de una célula huésped a otra. Los mismos se clasifican según las
diferencias de las estructuras de estas cubiertas (Tortora et al., 2007).

Ácido nucleico:

En contraste con las células procariontes y

eucariontes, en las cuales el DNA siempre es el material genético primario, un
virus puede tener DNA o RNA. El ácido nucleico de un virus
puede ser monocatenario
o bicatenario. Según el virus, el ácido nucleico puede ser lineal o circular. En
algunos virus, el ácido nucleico aparece en varios segmentos separados
(Tortora et al., 2007).

El porcentaje de ácido nucleico en relación con

la proteína es de alrededor del 1% en el virus de la gripe y de aproximadamente
el 50% en ciertos bacteriófagos. La cantidad total de
ácido nucleico varía
desde unos pocos miles de nucleótidos hasta 250.000 nucleótidos (Tortora et al., 2007).

Cápside y envoltura:

El ácido nucleico de un virus está protegido por

una cubierta proteica denominada cápside, como se puede observar en la fig. 1.
La estructura de la cápside está determinada en
última instancia por el ácido
nucleico viral y representa la mayor parte de la masa de un virus. Cada cápside
está compuesta por subunidades proteicas denominadas capsómeros.
En algunos
virus las proteínas que componen los capsómeros son de un único tipo mientras que
en otros virus pueden estar presentes muchos tipos de proteína. A menudo se
visualiza cada uno de los capsómeros en las microfotografías electrónicas. La disposición de los capsómeros es característica de
un tipo de virus particular (Tortora et
al., 2007).


Figura 1. Morfología de un virus poliédrico

sin envoltura (Tortora et al., 2007).

En algunos virus la cápside está recubierta por

una envoltura (fig. 2), que suele consistir en alguna combinación de lípidos,
proteínas e hidratos de carbono. Algunos virus animales
son liberados de la
célula huésped mediante un proceso de extrusión que recubre el virus con una
capa de la membrana plasmática de la célula huésped; esta capa se transforma en
la envoltura viral. En muchos casos la envoltura contiene proteínas
determinadas por el ácido nucleico viral y los materiales derivados de componentes
de células huésped normales
(Tortora et
al., 2007).

Figura 2. Morfología de un virus helicoidal

con envoltura (Tortora et al., 2007).

Según el virus, las envolturas pueden estar

cubiertas o no por espíenlas, que son complejos de hidrato de carbono-proteína
que sobresalen de la superficie de la envoltura. Algunos
virus se adosan a las
células huésped mediante espículas. Estas espículas son características tan
confiables de algunos virus que se pueden usar como medio de identificación. La
capacidad de ciertos virus de aglutinar eritrocitos se asocia con las
espículas. Estos virus se unen a los eritrocitos y forman puentes entre ellos.
La aglutinación resultante se
denomina hemaglutinación y es la base de varias
pruebas de laboratorio útiles (Tortora et
al., 2007).

Los virus cuyas cápsides no están cubiertas por

una envoltura se denominan virus sin envoltura ( fig. 1). La cápside de
un virus sin envoltura protege al ácido nucleico de las enzimas
nucleasas
presentes en los líquidos biológicos y favorece la fijación de los virus a las
células huésped susceptibles (Tortora et
al., 2007).

Cuando el huésped ha sido infectado por un

virus su sistema inmunitario es estimulado para que produzca anticuerpos. Esta
interacción entre los anticuerpos del huésped y las
proteínas del virus debería
inactivar al virus y detener la infección. Sin embargo, algunos virus pueden
escapar de los anticuerpos porque las regiones de los genes que codifican
estas
proteínas de superficie de los virus son susceptibles a las mutaciones. La
progenie de los virus mutantes tiene proteínas de superficie alteradas, por lo
que los anticuerpos no
pueden reaccionar con ellas. El virus de la gripe sufre
con frecuencia estos cambios en sus espículas. Por ello, aunque un individuo
haya producido anticuerpos contra un virus de la
gripe, el virus puede mutar y
volver a infectarlo (Tortora et
al., 2007).

La información estructural es necesaria para la

clasificación de los virus y para establecer relaciones entre la estructura y
la función de proteínas virales. Las características
estructurales particulares
de cada familia de virus dependen de las funciones del virión. El conocimiento
de la estructura viral incrementa la comprensión de los mecanismos de
ciertos
procesos, como la interacción de partículas virales con los receptores de
superficie celular y neutralización por anticuerpos. Puede llevar también al
diseño racional de
fármacos antivíricos capaces de bloquear la unión viral,
eliminar la cubierta viral o el ensamble en células susceptibles (Brooks et al., 2011).

MORFOLOGÍA GENERAL

Según Tortora et al., 2007 estos se

clasifican en:

1.      
Virus helicoidales: se asemejan a largos
bastones que pueden ser rígidos o flexibles. El ADN viral se encuentra dentro
de una cápside cilíndrica hueca con estructura helicoidal.

2.      
Virus poliédricos (de muchas caras): la cápside de
la mayoría de los virus poliédricos tiene la forma de un icosaedro, un poliedro
regular con 20 caras triangulares y 12 ángulos.

3.      
Virus con envoltura: son casi esféricos y su
cápside está cubierta por una envoltura.

4.      
Virus complejos: los virus bacterianos poseen
estructuras complicadas. Un ejemplo es el bacteriófago, que, en algunos casos,
estos tienen cápsides a las que se adosan
estructuras adicionales.

MODELOS DE REPLICACIÓN

Entre los modelos de replicación que puede presentar una especie de virus se encuentran: el secuestro de las actividades de síntesis normales de la célula hospedadora y las
reorientan para utilizar los materiales disponibles para elaborar ácidos nucleicos y proteínas que forman un virión nuevo, inserción (integración) del DNA del virus al DNA
cromosómico de la célula hospedadora (el DNA viral integrado se conoce como provirus).

Otro modelo a considerar es el de los retrovirus, estos infectan el DNA de las células eucariontes, y sintetizan sus estructuras utilizando RNA como un molde, por medio de la
transcriptasa inversa. El genoma retroviral es una cadena simple de RNA que codifica esta enzima y una pocas moléculas de la enzima son empaquetados junto con el genoma de
RNA en cada partícula viral.

Existen dos tipos básicos de infección viral. (1) En la

mayor parte de los casos, los virus secuestran las actividades de síntesis
normales de la célula hospedadora y las reorientan
para utilizar los materiales
disponibles para elaborar ácidos nucleicos y proteínas que forman un virión
nuevo. En otras palabras, los virus no crecen como las células; se ensamblan
de
forma directa a partir de sus elementos para crear viriones de tamaño maduro.
Por último, la célula infectada se disuelve (experimenta lisis) y libera una
nueva generación de
partículas virales capaces de infectar a las células
próximas. (2) En otros casos, el virus no causa la muerte de la célula
hospedadora, sino que inserta (integra) su DNA al DNA
cromosómico de la célula
hospedadora. El DNA viral integrado se conoce como provirus (Karp, 2013, p. 25).

En la actualidad se sabe que los virus son esencialmente genes rodeados de una cubierta proteica protectora. Sin embargo, estos genes deben entrar en una célula y utilizar la
maquinaria celular para expresar sus genes mediante la síntesis de proteínas y replicar sus cromosomas; en muchos casos la célula infectada estalla (lisis) y libera la progenie de
virus, que pueden tener acceso a las células vecinas (Alberts et al., 2011, p. 223).

Aunque hay muchas semejanzas entre los virus bacterianos y eucariontes, un importante tipo de virus -el retrovirus- se encuentra solamente en las células eucariontes. En muchos
aspectos, los retrovirus se asemejan a los retrotransposones. Una característica clave del ciclo de vida de ambos elementos genéticos es un paso donde el DNA se sintetiza
utilizando RNA como un molde (el término retro se refiere a la inversión de flujo habitual de la información del DNA al RNA) y la enzima que realiza este paso es la transcriptasa
inversa. El genoma retroviral es una cadena simple de RNA que codifica esta enzima y una pocas moléculas de la enzima son empaquetados junto con el genoma de RNA en cada
partícula viral (Alberts et al., 2011, p. 225)

CICLO LÍTICO

Virus: Bacteriófagos
T simétricos

Son virus granes,

complejos y sin envoltura. Su DNA es equivalente al 6% de E. coli, pero el fago
tiene DNA suficiente para 100 genes, su ciclo de multiplicación posee las 5
etapas que
todos los virus tienen fijación, penetración, biosíntesis,
maduración y liberación.

Figura 3: Bacteriófago T simétrico (Tortora et al., 2007).

Fijación:

Ocurre cuando
una bacteria y un bacteriófago interactúan entre sí, este último se adosa a un
sitio receptor complementario de la bacteria, formando enlaces débiles entre el
sitio de
fijación y el receptor. Los bacteriófagos utilizan fibras en su
extremo cola para fijarse.

Penetración:

Luego de la
fijación, inyecta su DNA dentro de la bacteria mediante liberación de una
enzima, la lisozima del fago, la cual le permite degradar la pared celular
bacteriana. Durante la
penetración, la vaina de la cola se contrae y el núcleo
es el inyectado a la bacteria. La cápside queda fuera de la célula, el fago actúa
como si fuese una jeringa hipodérmica mientras
inyecta su DNA (Tortora et al.,
2007).

Figura 4: Fijación y penetración del ciclo lítico del bacteriófago T simétrico  (Tortora et al., 2007).

Biosíntesis: Una vez que el DNA del bacteriófago llega hasta el citoplasma de la célula huésped ocurre la biosíntesis del ácido nucleico y la proteína viral. La síntesis de proteínas del
huésped es detenida por la degradación del DNA del huésped inducida por el virus, las proteínas virales que interfieren en la transcripción o la represión de la traducción. Todo el RNA
transcrito en la célula es mRNA transcrito a partir del DNA del fago para la biosíntesis de las enzimas del fago y las proteínas de la cápside. Los ribosomas, las enzimas y los
aminoácidos de la célula huésped se usan para la traducción. Los controles genéticos regulan la transcripción de las distintas regiones del DNA del fago en mRNA durante el ciclo de
multiplicación

Maduración: Se ensamblan los DNA y las cápsides de los bacteriófagos para formar viriones completos. Los componentes virales se ensamblan espontáneamente para generar una
partícula viral y así se elimina la necesidad de muchos genes no estructurales y productos génicos. Las cabezas y las colas de los fagos se ensamblan por separado a partir de
subunidades proteicas y la cabeza se llena de DNA del fago y se adosa a la cola.

Liberación: La etapa final de la multiplicación viral es la liberación de viriones por la célula huésped. En general se usa el términolisis para aludir a esta etapa de la multiplicación de
los fagos T simétricos porque en este caso la membrana plasmática realmente se rompe (se lisa). La lisozima codificada por un gen del fago se sintetiza dentro de la célula. Esta
enzima induce la ruptura de la pared de la célula bacteriana y los bacteriófagos recién producidos son liberados de la célula huésped. Los bacteriófagos liberados infectan otras
células susceptibles cercanas y se repite el ciclo de multiplicación viral dentro de esas células


Figura 5: Biosíntesis, maduración y liberación del ciclo lítico del bacteriófago T simétrico  (Tortora et al., 2007).

GENÉTICA VIRAL

Introducción a la terminología

Es necesario aclarar algunas terminologías

básicas antes de continuar con la descripción de la genética viral, entre los
términos a mencionar encontramos los siguientes:

Genotipo (información genética

definida por las secuencias de ácido nucleico, que comprende regiones que se
expresan como RNA y proteínas, al igual que regiones regulatorias),
fenótipo
(características observables, producto de la expresión del genotipo). Por otro lado,
los términos cepa, tipo, variante y mutante son más frecuentemente aplicados
extensa e
indiscriminadamente a vírus que difieren en caracteres heredables, de
un virus parental o Wild type (silvestre). El término Wild type (wt) se emplea
comúnmente para virus cultivados
en laboratorios, en ese contexto, es necesario
diferenciarlos de los vírus wt, que no son otra cosa más que virus
recientemente aislados de su hospedero natural. Ahora bien, serotipo
es
definido por neutralización cruzada de la infectividad ( un mismo serotipo
incluye varias cepas) y variante es utilizado para aludir que un virus es
genotípicamente diferente del wt
(Carballal et
al, 2014).

Bases moleculares de los cambios genómicos

En términos generales, las

variaciones de los genomas ocurren por dos mecanismos que cambian la secuencia
de los ácidos nucleicos, de manera tal que por lo menos algunos
miembros de la
progenie no resultan idénticos al (los) progenitor (es), dichos mecanismos son
la mutación y la recombinación, o inclusive por reordenamiento de moléculas
para
aquellos virus que tienen su genoma repartido en varias moléculas de DNA o
RNA, que se conocen como genomas segmentados (Carballal et al, 2014).

Mutaciones

Las mutaciones son cambios en la

secuencia nucleotidíca. Comprenden cambios de un nucleótido por otro
(transiciones: una purina por otra o una pirimidina por otra;
transversiones:
una pirimidina por una purina y viceversa), inserciones de uno o más
nucleótidos y deleciones (eliminación de uno o más nucleótidos de la secuencia
original)
(Carballal et al, 2014).

Interacciones genéticas entre vírus

Recombinación

Los vírus con genomas que

consisten en una sola molécula de DNA o RNA pueden intercambiar información
genética en una célula infectada simultaneamente con dos virus
distintos por
interacción física directa de sus genomas (Carballal et al, 2014).

Los vírus grandes a DNA (adeno,

herpes, pox) pueden intercambiar información genética por recombinación
homóloga. Generalmente, lá recombinación entre dos mutantes que
coinfectan una
célula produce proporciones equivalentes de los tipos de recombinantes
recíprocos, además de viriones con los genomas parentales. La recombinación
puede ocurrir
también entre vírus de distintos tipos dentro del mismo grupo
(por ejemplo, adeno tipo 2 y 5), pero sólo en regiones de alta homología de
secuencia nucleotidíca. Los eventos 
moleculares que conducen a la recombinación ocurren de forma simultanea
con la replicación del genoma (Carballal et
al, 2014).

Reasociación de segmentos genómicos (reassortment)

En los genomas no segmentados, la

frecuencia de recombinación depende de la distancia de los marcadores genéticos
(por ejemplo, mutaciones ts enndos genes distinto, A y B)
sobre el cromosoma,
llegando a un máximo teórico de 50% sólo en el caso de que los marcadores estén
alejados a una distancia infinita (Carballal et al, 2014).

Los vírus con genoma segmentado,

en cambio, exhiben un comportamiento muy distinto: dado un par de marcadores,
la frecuencia de recombinación es muy alta (hasta 50%),
cuando éstos pertenecen
a segmentos distintos, o es muy baja cuando los marcadores se encuentran sobre
el mismo segmento (Carballal et al, 2014).

Complementación

En una infección mixta, dos

mutantes letales condicionales pueden dar progenie wt por recombinación (o re
asociación en el caso de genomas segmentados). Este wt será el único
miembro de
la progenie capaz de replicarse en la condición no permisiva. Por otra parte,
en condiciones no permisivas también es posible producir un aumento en el
rendimiento  de
la progenie de los
mutantes sin que cambien sus genomas. En este fenómeno de complementación, uno
de los mutantes proporciona el producto génico defectuoso en el otro y
viceversa (Carballal et al, 2014).

Interacciones no genéticas
entre virus

Heterocigosis

Dado que, en general, los virus

no poseen un número diploide de cromosomas, no puede hablarse de homo y
heterocigotas. Sin embargo, los genomas de los retrovirus son diploides
y
consisten en dos moléculas del RNA genómico; de manera que en este caso los
virus pueden ser heterocigotas para cualquiera de sus genes. Otro caso
particular es el de varios
virus a DNA, que contienen regiones repetidas donde
es factible la heterocigosis (herpes simplex). En virus envueltos, con genomas
haploides, es posible encontrar partículas
multiploides como resultado de un
empaquetamiento poco prolijo. En este caso, cuando de una coinfección
con dos variantes resulta la producción de un aparente recombinante a
partir de
mutantes ts éste segrega las dos variantes originales luego de su
aislamiento y cutivo (Carballal et al, 2014).

Interferencia

La interferencia en el
crecimiento entre dos virus homólogos o muy relacionados se observa cuando alguno
de los dos posee una ventaja sobre el otro. Puede ocurrir en distintas
etapas
de la infección: adsorción (por ejemplo, el paramixovirus NDV), penetración
(retrovirus) o replicación (muchos virus) (Carballal et al, 2014).

Mezcla fenotípica
En una célula infectada por un
par de virus relacionados pueden producirse viriones compuestos por proteínas
estructurales de ambos y el genoma de uno u otro. Este proceso se
conoce como
mezcla fenotípica y ocurre porque las proteínas homólogas (con la misma función
y estructuras muy similares) de uno y otro virus pueden sustituirse unas a
otras en la
formación de cápsides y en el ensamblaje con el material genético
(por ejemplo, poliovirus tipos 1 y 2). Las características antigénicas de tales
partículas están dadas por las
proteínas externas y no reflejan la identidad
del genoma (Carballal et al, 2014).

VIRUS DE DNA
ONCOGÉNICOS

Los virus
oncogénicos se encuentran en muchas familias de virus que contieiien DNA. Estos
grupos incluyen Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Papovaviridae y
Hepadnaviridae.
Entre los papovavirus los papilomavirus causan cáncer uterino (cervical).

Casi todos los

cánceres cervicales son causados por papilomavirus humano (HPV); el HPV-16 es
la causa del alrededor de la mitad de todos los cánceres cervicales. Varios
estudios
clínicos recientes de una vacuna contra cuatro HPV, incluido el
HPV-16, han sido muy promisorios. El virus de Epstein-Barr (EB) fue aislado en
1964 por Michael Epstein e Ivonne Barr
de células de linfoma de Burkitt. La
prueba de que el virus EB puede causar cáncer se halló accidentalmente en 1985,
cuando un niño de 12 años conocido solo como David recibió un
trasplante de médula
ósea. Varios meses después del trasplante el niño murió de cáncer. La autopsia
reveló que el virus había sido introducido en forma inadvertida en el niño con
el
trasplante. Otro virus de DNA que causa cáncer es el virus de la hepatitis B
(HBV). Se han realizado muchos estudios en animales que indican con claridad el
papel causal del HBV en
el cáncer de hígado. En un estudio realizado en seres
humanos casi todas las personas con cáncer de hígado habían sufrido infecciones
previas por HBV.

VIRUS DE RNA
ONCOGÉNICOS

Entre los virus

de RNA solo los oncovirus de la familia Retroviridae causan cáncer. Los virus
de la leucemia de linfocitos T humanos (HTLV-1 y HTLV-2) son retrovirus que causan
leucemia de linfocitos T del adulto y linfoma en los seres humanos (Los
linfocitos T constituyen un tipo de leucocitos que intervienen en la respuesta
inmunitaria). Los virus que
causan sarcoma en gatos, pollos y roedores y los
virus que provocan tumores mamarios en ratones también son retrovirus. Otro
retrovirus, el virus de la leucemia felina (EeLV), causa
leucemia en los gatos
y es transmisible entre estos animales. Hay una prueba para detectar el virus
en suero de gato. La capacidad de los retrovirus de inducir tumores se relaciona
con su producción de una transcriptasa inversa por el mecanismo descrito antes.
El provirus, que es una molécula de DNA bicatenaria sintetizada a partir del
RNA viral, se integra al D
N A de la célula del huésped; de ese modo se
introduce nuevo material genético en el genoma del huésped y esta es la causa
clave por la cual los rétrovirus con ­tribuyen al cáncer.
Algunos retrovirus
contienen oncogenes; otros contienen promotores que activan oncogenes u otros
factores causantes de cáncer.

VIRUS COMO VECTORES

La tecnología de DNA recombinante ha revolucionado

la producción de materiales biológicos, hormonas, vacunas, interferón y otros productos
génicos. Los genomas virales han sido
sometidos a ingeniería genética para
servir como vectores de replicación y expresión de vectores tanto para virus
como para genes celulares. Casi cualquier virus puede ser
convertido a un
vector si se sabe lo suficiente con respecto a sus funciones de replicación,
controles de transcripción y señales de empaquetamiento. La tecnología de
vector viral se
basa en virus DNA (p. ej., SV40, parvo- virus, papilomavirus
bovino, adenovirus, herpesvirus, virus vaccinia) y RNAvirus (p. ej.,
poliovirus, virus Sindbis, retrovirus). Cada sistema tiene
diferentes ventajas
y desventajas.

Los vectores típicos de expresión eucariota

contienen elementos de regulación viral (promotores) que controla la
transcripción del gen clonado deseado, insertado adyacente a
señales para la
terminación eficiente y la poliadenilación de los productos de la transcripción
y una secuencia intrónica unida por sitios donadores y receptores de empalme.
Puede
haber secuencias que favorezcan la traducción o afecten la expresión de
un tipo celular en particular. Este método ofrece la posibilidad de producir
grandes cantidades de un
antígeno puro para estudios estructurales o con el fin
de crear una vacuna. (Bernard et al., 2010).

Adenovirus para genoterapia

Se están utilizando los adenovirus como vehículos

para administrar genes para el tratamiento del cáncer, genoterapia y estudios
de inmunización genética. Los adenovirus son
atractivos en virtud de que los
virus con replicación defectuosa recombinantes poseen las ventajas de una gran
eficiencia en la transducción de muchos tipos de células y altos
grados de
expresión de genes transducidos a corto plazo; sin embargo, las limitaciones
importantes comprenden su gran inmunogenicidad y la gran prevalencia de la
inmunidad
preexistente en seres humanos a los adenovirus del subgrupo C (los
tipos 2 y 5 se utilizan ampliamente como vectores). Otras limitantes son la
expresión de receptor variable (CAR)
en diferentes células y la imposibilidad
para integrarse en el DNA cromosómico y facilitar la expresión transgénica a
largo plazo. Se están realizando investigaciones para el diseño de
vectores y
técnicas de direccionamiento para superar estas limitaciones.

Un tratamiento antineoplásico novedoso utiliza un

adenovirus de replicación competente atenuado elaborado para replicarse sólo en
células cancerosas específicas. Este
“tratamiento oncolítico” tiene como
propósito destruir directamente las células tumorales debido a la replicación
lítica del virus (Bernard et al., 2010).

Vector retroviral

Este vector fue el más utilizado en el inicio de la terapia génica

clínica en virtud de su simplicidad genómica, ya ampliamente
explorada a nivel molecular. El genoma del retrovirus Mo-
MLV (Maloney
murine leukemia virus), que es formado por dos cadenas simples de
RNA, es la estructura básica para la construcción de vectores de
esa categoría, en el que el
genóma es compuesto por apenas tres
genes estructurales (gag, pol, env) y las secuencias
terminales LTR (long terminal repeat sequence). Los retrovirus
recombinantes pueden ser
generados al transfectar las células
empaquetadoras , que expresan los genes estructurales virales, con
vector de plásmido conteniendo las secuencias LTR, ψ
(señal de
empaquetamiento) y gen terapéutico (Ulrich
et al, 2008).

Ese
vector es usado preferencialmente para transferencia génica ex
vivo debido a la baja
tasa de infección in
vivo, pero altísima
tasa in vitro
en las células en fase de división.
Vectores
de ese tipo no infectan las células quiescentes. El pequeño tamaño
genómico de los retrovirus limita la extensión del vector a ser
construidos. O sea, el
tamaño final del
vector debe ser inferior a 9 kilobases (kb) para
haber una buena producción. Es importante resaltar que el vector
debe tener un sistema
completo de expresión génica, lo que significa
un
promotor con enhancer
(la región reguladora es opcional)
y
una secuencia de poliadenilación para señalizar el fin de la
transcripción. Con esto, el tamaño del gen para la inserción
en el
vector retroviral será mucho menor que 9kb6.
Además de eso, las células
transducidas por el vector retroviral sufren modificación genética
permanente, es decir, el genoma viral
es incertado en el genoma de la
célula diana. El tiempo de expresión puede durar el tiempo de vida
de la célula diana (Ulrich
et al,
2008).

Vector
lentiviral

La
familia retroviridae
es formada de onco-retrovirus, lentivirus
y spumavirus.
Es común que encontremos el término vector retroviral como sinónimo
de vector onco-retrovirla, que fue
el primero y más ampliamente
utilizado. En mediados de la década de 1990, fue visto que los
vectores retrovirales construídos con base en los genomas del virus
de la
inmunodeficiencia humana (HIV,
human immunodeficience virus)
y virus de la inmunodeficiencia humana (FIV,
feline immunodeficiency virus) pueden
infectar las células quiescentes,
que son las predominantes in
vivo.
A pesar de toda esa potencialidad del vector, solamente en 2004 se
aprobó el primer protocolo de terápia génica clínica usando
vector lentiviral
para tratar el síndrome de inmunodeficiencia
adquirida (AIDS, acquired
immunodeficiency syndrome).
Las
normas de bioseguridad contra el uso de este tipo de vector son muy
rigurosas (Ulrich
et al,
2008).

Varios
genes lentivirales expresan productos tóxicos, lo que dificulta el
establecimiento de lineas celulares productoras
de virus, como se constató para los vectores onco-retrovirales.
Para
la construcción de vectores lentivirales, el vector plasmídico que
contiene un casete de expresión del
gen
terapéutico
es co-transfectado con otros plásmidos que portan los
genes virales.
Por
lo tanto, la producción y purificación de esos vectores son etapas
criticas cuando hay la necesidad de obtención de vectores a gran
escala y con un grado de pureza
suficiente para su utilización en
seres humanos (Ulrich
et al,
2008).

Vector
de Virus Adeno-asociado

El
genoma del vector del virus adeno-asociado (AAV, adeno-associated
virus) contiene una cadena simple de DNA de 4,5kb. El AAV del
tipo 2 no es patógeno para el ser humano, y es
el más empleado en
la construcción de vectores. En las células humanas, el virus queda
latente y su activación ocurre en la presencia de un helper
virus (virus auxiliar), como el
adenovirus. Los AAV poseen amplio
espectro de tropismo para células de mamíferos. El virus de tipo 2
tiene preferencia para introducir su genoma en una región del brazo
largo del
cromosoma 19 humano. Esto implica mayor control sobre la
mutación de inserción en comparación con lo que ocurre con los
vectores retrovirales (Ulrich et
al, 2008).

Para
la construcción de vectores de AAV, células HEK 293 son
co-transfectadas por un vector plasmídico, que contiene las
secuencias ITR (inverted terminal repeat sequence) del AAV
mas
el casete de expresión del gen terapéutico y un otro vector
plasmídico, conteniendo los genes virales rep (replicación)
e cap (encapsidación), así como algunos genes del
adenovirus. UN proceso al utilizado para vectores de adenovirus y
lentivirus. La producción a gran escala e con su purificación son
también obstáculos con este tipo de vector (Ulrich
et al, 2008).

     Tabla 2. Vectores utilizados para transferencia de genes y sus características.



      Fuente: Ulrich et al, 2008.

                                                        Figura 6. Esquema de construcción de vectores virales (Ulrich et al, 2008).

Infecciones virales
latentes

Cuando los virus se encuentran dentro del cuerpo pero en

estado de reposo, este estado de reposo o latencia de la replicación vírica puede
durar un prolongado periodo de tiempo y
algunos  pueden reactivarse debido a una enfermedades o
tratamientos inmunosupresores, un ejemplo de esto son los herpesvirus humanos
que pueden estar permanentemente en
las células huéspedes y cuya reactivación resulta
peligroso bajo esas condiciones delicadas de salud. Otros ejemplos de
infecciones latentes virales son el virus de herpes simple,
que se encuentra
habitando las células nerviosas de los huéspedes de forma asintomática, sin
embargo, pueden activarse y producir infecciones recurrentes debido a la
fiebre, el
estrés, la ansiedad, la exposición prolongada al sol, etc. produciendo
ampollas de color blanquecino; el virus de la varicela, enfermedad cutánea mayormente
infantil que permanecen
latentes al pasar de la sangre a los nervios, pueden reactivarse
debido a los cambios en la respuesta inmune (linfocitaria T) y causar herpes
zoster que produce erupciones en la piel
a lo largo del nervio donde se
encontraba en estado de latencia (Tortora et al., 2007).

Infecciones virales
resistentes

Las infecciones virales persistentes o crónicas se

producen de forma gradual durante periodos prolongados de tiempo a diferencia
de las latentes que aparecen de pronto, la mayoría
son fatales y pueden ser
causadas por virus convencionales. El virus del sarampión, por ejemplo, que
después de varios años de provocar sarampión clínico y almacenarse en las
neuronas de forma incompleta puede producir panencefalitis esclerosante
subaguda (PEES), que es una enfermedad neurológica degenerativa crónica cuyos síntomas
incluyen el
deterioro progresivo del nivel intelectual y de la conciencia
(Martín et al., 2012).

Priones

Los priones causan algunas enfermedades infecciosas. En 1982 el neurobiólogo estadounidense Stanley Prusiner propuso que las proteínas infecciosas causaban una enfermedad
neurológica en ovinos denominada scrapie. La infectividad del tejido encefálico infectado por scrapie se reduce con el tratamiento con proteasas pero no con tratamiento con
radiación, lo que sugiere que el agente infeccioso sería proteína pura. Prusiner acuñó el nombre prión por partícula proteinácea infecciosa (Tortora et al., 2007). 
En la actualidad, nueve enfermedades de los animales se incluyen en esta categoría, entre ellas la “enfermedad de la vaca loca”, que apareció en 1987 en ganado bovino de Gran
Bretaña. Las nueve enfermedades son patologías neurológicas denominadas encefalopatías espongiformes porque se desarrollan grandes vacuolas en el cerebro. Las enfermedades
humanas son el kuru, la enfermedad de Creutzfeldt Jakob (ECJ), el síndrome de Gerstmann-Straüssler-Scheinker y el insomnio familiar fatal. Estas enfermedades aparecen en grupos
familiares, lo que sugiere una posible causa genética. Sin embargo, no pueden ser patologías hereditarias puras porque la enfermedad de la vaca loca se originó en el uso de carne de
ovejas infectadas por scrapie para alimentar ganado bovino y la nueva variante (bovina) se' transmitió a seres humanos que comieron carne poco cocida proveniente del ganado
bovino infectado. Además, se ha transmitido la EC con tejido nervioso trasplantado e instrumentos quirúrgicos contaminados. Estas enfermedades son causadas por la conversión
de una glucoproteína normal del huésped, denom inada PrP^- (por proteína celular de prión), en una forma infecciosa denominada PrP®^ (por pro teína de scrapie). En los seres
humanos el gen de la PrP*^ está ubicado en el cromosoma 20 (Tortora et al., 2007). 

Virus y viroides vegetales

Los virus vegetales son

semejantes a los virus animales; tienen una morfología y tipo de ácido nucleico
similar, algunos pueden multiplicarse dentro de células de insectos. Estos
virus pueden causar muchas enfermedades de gran importancia económica en
cultivos como por ejemplo en cultivos de maíz, caña de azúcar (virus tumoral de
las heridas) y papas
(virus enano amarillo de la papa). Pueden causar cambio de
color, crecimiento deforme, detención del crecimiento y hasta pueden marchitar
la planta.

Para pasar la pared celular e

ingresar a las células vegetales, los virus vegetales necesitan de heridas u otros
parásitos como, por ejemplo, nematodos, hongos o insectos. Una vez
infectada
una planta puede diseminar la infección en su polen y semillas.

Algunas enfermedades vegetales

son causadas por viroides, trozos de RNA desnudo de solo 300 a 400 nucleótidos
de longitud que carecen de cubierta proteica, pero con una
estructura
tridimensional plegada cerrada que contribuye a protegerlo del ataque de
enzimas celulares.

Los viroides son patógenos vegetales exclusicos y

causan perdidas millonarias por daños de las cosechas. Actualmente existe una
hipótesis que postula que los viroides se
desarrollaron a partir de los intrones,
lo que lleva a pensar que es posible que futuros investigadores descubran
viroides animales (Tortora et al., 2007). 

Cultivo de animales en el laboratorio

En animales vivos: Este tipo de cultivos se utiliza con la

finalidad de estudiar la respuesta del sistema inmunitario a las infecciones
virales o como procedimiento diagnóstico para
identificar y aislar un virus de
una muestra clínica. Existen algunos virus que solo se pueden cultivar en
animales vivos como cobayos o ratones, y luego de inocular la muestra en el
animal se lo observa para detectar signos de enfermedad o se lo sacrifica para
poder examinar los tejidos infectados e identificar el virus. En cambio existen
otro que no se pueden
cultivar en animales o se pueden cultivar pero no causan
enfermedad, tal es el caso del VIH que presentó muchos inconvenientes por no
poseer modelos animales naturales.

En huevos embrionados: En tiempos anteriores, este método era el

más usado para el aislamiento y el desarrollo viral y aún se lo utiliza para
cultivar virus para algunas vacunas.
Consiste en inyectar en un huevo, previamente
perforado, una suspensión viral o de tejido que presuntamente contiene un virus,
el sitio de inyección determina la membrana en lo
cual se desarrollaran los
virus. El posterior desarrollo viral es detectado por la muerte del embrión,
por el daño de las células del embrión o por la formación de las típicas
pústulas o
lesiones en las membranas del huevo.

En cultivos celulares: Estos cultivos consisten en células

desarrolladas en medios especiales en el laboratorio, que tiene la ventaja de
ser fáciles de manejar y propagar como los
cultivos bacterianos, y es más ético
que trabajar con animales enteros. Las líneas de cultivos celulares se preparan
añadiendo enzimas a un corte de tejido, para separar este en
células individuales
que luego se suspenden en una solución que contiene la presión osmótica, nutrientes
y factores de crecimiento necesarios para que inicien mitosis. Las primeras
células
formadas se adhieren al recipiente formando una monocapa, que en infectada por
el virus inoculado y provoca que las células se deterioren a medida que se
multiplican
(efecto citpático).

Hay tipos de líneas celulares que

se caracterizan por su duración; las líneas primarias derivan de cortes de
tejidos que tienden a morir después de unas pocas generaciones, las
líneas diploides
diploides, desarrolladas a partir de embriones humanos, se pueden mantener
durante unas 100 generaciones. Por otro lado, 
las líneas celulares continuas provienen
de células transformadas
(cancerosas) que se pueden mantener durante una cantidad indefinida de generaciones
y en ocasiones se denominan líneas celulares inmortales, utilizadas
comúnmente al
realizar cultivos virales de rutina en un laboratorio.

Identificación viral 

La identificación de los aislamientos virales no es sencilla. Por una parte, los virus no se ven sin el uso un microscopio electrónico. Los métodos serológicos como el Western
blotting, son los medios de identificación de uso más común. En dicha prueba, se identifica el virus por su reacción con los anticuerpos. 

Los virologos pueden identificar y caracterizar virus mediante el uso de métodos moleculares modernos tales como el empleo de los polimorfismos de longitud de los fragmentos de
restricción (RFLP) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR se utiliza para amplificar el RNA viral e identificar el virus del coronavirus asociado con el SARS en China en
2002. 

Multiplicación
viral.

El ácido
nucleico de un virión contiene solo algunos de los genes necesarios para la
síntesis de nuevos virus, entre ellos los genes para los componentes
estructurales del virión, por
ejemplo, las proteínas de la cápside, y genes
para algunas de las enzimas usadas en el ciclo vital del virus. Estas enzimas
son sintetizadas y funcionan solo cuando el virus está
dentro de la célula
huésped (Tortora et al., 2007).

Las enzimas virales

se ocupan casi exclusivamente de la replicación o el procesamiento de ácido
nucleico viral. Las enzimas necesarias para la síntesis proteica, los ribosomas,
el
tRNA y la producción de energía son proporcionadas por la célula huésped y
se usan para la síntesis de proteínas virales, incluidas las enzimas virales (Tortora et al., 2007).

Si bien los más

pequeños viriones sin envoltura no contienen enzimas preformadas, los viriones
más grandes pueden contener una o algunas enzimas, que por lo general
contribuyen
a que el virus penetre en la célula huésped o replique su propio
ácido nucleico (Tortora et al., 2007).

En consecuencia,
para que un virus se multiplique debe invadir una célula huésped y tomar a su
cargo la dirección de la maquinaria metabólica del huésped. Un único virión
puede dar
origen a varios o incluso a miles de virus similares en una sola
célula huésped. Este proceso puede modificar drásticamente la célula huésped y
por lo general causa su muerte. En
algunas infecciones virales las células
sobreviven y continúan la producción de virus en forma indefinida (Tortora et al., 2007).

Multiplicación de los virus animales

La multiplicación de los virus animales sigue el patrón básico de la multiplicación de los bacteriófagos, pero aun así presenta sus diferencias.

Los virus animales difieren de los fagos en su mecanismo de ingreso a la célula huésped. Además, una vez que el virus esta en el interior de la célula la síntesis y el ensamblado de
los nuevos componentes virales son algo diferentes, en parte debido a las diferencias entre las células procariontes y eucariontes.  Los mecanismos de maduración y liberación y los
efectos sobre la célula huésped son distintos entre virus animales y fagos. (Tortora et al,2007). 

 El paso inicial del contacto entre el virus y la célula, denominado adsorción, está mediado por la unión de una proteína viral, situada en la superficie del virión, a un receptor de la
superficie celular. Se han identificado receptores celulares de muchos virus. La mayoría de los virus se adsorben a proteínas de la superficie celular que tienen funciones metabólicas
específicas y que sólo se expresan en un subconjunto de células diferenciadas. El virus de la rabia, por ejemplo, se une al receptor de la acetilcolina y, en consecuencia, se adsorbe a
las células nerviosas. El virus de la inmunodeficiencia humana se adhiere a las moléculas CD4 de los linfocitos T y los macrófagos, pero necesita correceptores para entrar en estas
células. Estos correceptores han sido identificados recientemente y pertenecen a la familia de los receptores de quimioquinas. También hay que tener en cuenta que se ha
demostrado que los carbohidratos actúan como receptores de virus. Por ejemplo, el poliomavirus, el virus de Sendai y el virus de la vaccinia se adsorben a los sialiloligosacáridos de
las glicoproteínas y los glicolípidos, que pueden encontrarse en la superficie de muchos tipos de células.

 Tras la adsorción, los virus tienen que atravesar la membrana plasmática para entrar en una célula. El mecanismo de penetración difiere de un virus a otro, dependiendo de la
estructura respectiva del virión. La adsorción a los receptores celulares hace que los virus entren en contacto íntimo con la membrana plasmática. Posteriormente, los virus con una
envoltura membranosa pueden inyectar directamente la cápside viral en el citoplasma por fusión de la membrana. Sin embargo, el complejo virus-receptor también puede ser
internalizado por endocitosis mediada por fosas recubiertas y llevado a los endosomas. La posterior fusión de las membranas del virus y del endosoma conduce a la liberación de la
cápside viral en el citoplasma.

 Los virus que carecen de envoltura también entran en las células por endocitosis mediada por fosas recubiertas, pero la entrada de la cápside en el citoplasma obviamente no puede
producirse a través de la fusión de membranas. En el caso del adenovirus sin envoltura, se han presentado pruebas de que las proteínas de la cápside inducen la lisis de los
endosomas, liberando así la cápside en el citoplasma.

 Una vez dentro del citoplasma, el genoma viral tiene que ser liberado de la cápside y transportado al sitio intracelular apropiado para su transcripción o replicación. Este
acontecimiento se denomina desencapsulamiento.
 En el caso de los virus de ARN, se cree que factores celulares como las proteasas desmantelan la cápside del virus inmediatamente después de su entrada, liberando el ARN viral en
el citoplasma, donde se replica y traduce. También los poxvirus, que contienen un genoma de ADN de doble cadena, se replican en el citoplasma, utilizando una ADN polimerasa
codificada por el virus. Sólo los retrovirus transcriben su genoma de ARN en ADN, que posteriormente se transloca al núcleo y se integra en el genoma celular. El genoma retroviral
integrado sirve de plantilla para sintetizar nuevos genomas de ARN.

 En el caso de los virus de ADN de replicación nuclear, se supone que la cápside se transloca a lo largo del citoesqueleto hasta los poros nucleares. En los poros nucleares, el ADN
viral se libera en el núcleo, donde se replica.

 Cuando el genoma viral llega a su sitio intracelular apropiado, tiene que interactuar con la maquinaria de biosíntesis de la célula anfitriona para amplificarse y transcribirse en ARNm
que permita la síntesis de proteínas virales (cápside y no cápside). A continuación, los factores celulares y virales median el ensamblaje de las cápsides y el empaquetamiento del
genoma viral en estas cápsides. Estos pasos se denominan maduración de la cápside. El ensamblaje de las proteínas de la cápside de los virus sin envoltura se produce en el núcleo
(por ejemplo, parvovirus, adenovirus y papovirus) o en el citoplasma (por ejemplo, reovirus). La mayoría de los virus sin envoltura dependen de la lisis de la célula huésped para su
salida.

 El ensamblaje de las cápsides de los virus con envoltura también tiene lugar en el citoplasma (la mayoría de los virus ARN, poxvirus), o en el núcleo (herpesvirus), pero el último paso
en el ensamblaje del virión está relacionado con la liberación de los viriones. La mayoría de los virus de ARN salen por gemación a través de la membrana plasmática. Se ha
demostrado que los herpesvirus salen del núcleo por gemación a través de la membrana nuclear interna. A continuación, se liberan de las células por transporte a través del retículo
endoplásmico. Los poxvirus pueden salir de las células por gemación a través del aparato de Golgi o por disrupción celular, dando lugar a partículas envueltas y no envueltas,
respectivamente. Tanto las partículas envueltas como las no envueltas son infecciosas. Una vez liberada la progenie del virus, nuevas células pueden infectarse y se inician nuevos
ciclos de multiplicación. (Faisst, 1999).

(Microbiology 101, 2014).

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