UNIVERSIDAD ANDRES BELLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

"Búsqueda y caracterización de bacteriófagos específicos para

Aggregatibacter actinomycetemcomitans y Fusobacterium
nucleatum: Detern1inación del efecto bacteriolítico sobre estas
bacterias embebidas en una biopelícula dental"

TESIS ENTREGADA A LA UNIVERSIDAD ANDRES BELLO

PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN BIOTECNOLOGIA

RECIBIDO
Programa Capital Humano Avanzado
Mario Hernán Castillo Ruiz
1 2 ABR. Z012
Hora: ·?t!JoT-
F!fn:JJ.U,~
.-
~-·u~ •·•--·~~~~·
-·

Director de Tesis: Dr. Mauricio Bittner O.

SANTIAGO - CHILE

2012
 UN IVERSIDAD
ANDRES BELLO

VICERRECTORÍA DE INVESTIGACIÓN Y DOCTORADO

ACTA EXAMEN PÚBLICO
PROGRAMA DE DOCTORADO EN BIOTECNOLOGÍA

En Santiago, el día 31 de Enero de 2012, en ceremonia solemne se efectúa la defensa pública de la Tesis presentada por el Sr.
Mario Castillo Ruiz, titulada "Búsqueda y caracterización de bacteriófagos específicos para Aggregatibacter actinomycetemcomitans y
Fusobacterium nucleatum: Determinación del efecto bacteríolítico sobre estas bacterias embebidas en una biopelícula dental", como
el último requisito para la obtención del grado de Doctor en Biotecnología de la Universidad Andrés Bello. La comisión examinadora está
integrada por el Director de la Tesis Dr. Mauricio Bittner y los Doctores Claudia Saavedra, Guido Mora, Luis Burzio y Claudia Vásquez.

Esta ceremonia es presidida por el Vicerrector de Investigación y Doctorado, Dr. Andrés Gomberoff S.

Luego de escuchar la defensa de la Tesis expuesta por el Sr. Castillo, la comisión ha decidido aprobarla y manifestar sus
felicitaciones.

Por lo anterior, se otorga el grado de

Doctor en Biotecnología

Mario Castillo Ruíz

~D ·
l::Jmversidad Andrés Bello

Claudia Vásquez, Ph. .

Universidad de Santiago e Chile

CAMPUS CASONA DE LAS CONDES CAMPUS REPUBLICA CAMPUS VIÑA DEL MAR
FERNANDEZ CONCHA 700, LAS CONDES AV. REPUBLICA252, SANTIAGO 7 NORTE 1348
TELEFONO: (2) 66 1 8500 FAX: (2) 215 3767 TELEFONO: (2) 661 8000 FAX: (2) 671 1936 TELEFON0:(32) 257 0440 FAX:(32) 257 0442
e-mail; campus_casona@unab.cl e-mail: campus_republica@unab.cl e-mail: campus_vdelmar@unab.cl
www.unab.cl
A mis padres, mis grandes mentores
 AGRADECIMIENTOS

Sin duda esta tesis tiene dos componentes: Mi familia y amigos. Primero lo
primero. Gracias viejos por ser como son, por permitirme hacer de mi futuro lo que estimé
conveniente y por seguir siendo padres aun cuando "creo" que ya estoy grande. Aprendí
de Uds. la perseverancia y ha descubrir que la vida es un ciclo, que cuando uno esta bien
tiene que disfrutar de esos momentos y que cuando las cosas no están tan bien hay que
saber salir de esos momentos. Espero seguir agradeciéndoles por mucho tiempo (eso si
no con otra tesis) y decirles que sólo me queda retribuirles todo el amor entregado. A mi
hermana y sobrinos que a pesar de que nos vemos siempre, me alegran el día, espero
con el tiempo disfrutemos más tiempo en familia.

Toca la parte de los amigos y voy a comenzar por los que con el tiempo se
transformaron de compañeros de trabajo a amigos. Mauricio (si es que alguno lee estos
agradecimientos y se pregunta quien es Mauricio es el Dr. Bittner, mi tutor ......... siempre
he sido un poco patudo para mis cosas) gracias por permitirme ser parte de este grupo y
por conservar esta armonía durante tanto años, gracias por también entender que la
ciencia no tiene que ser solo sufrimiento y permitirme hacer clases (el dinero no es
importante, pero como ayuda!!!). No importa el orden que escriba de aquí en adelante no
lograré dejar a todos contentos, así que voy a intentar de hacer lo mejor posible. Pame
muchas gracias por lo comentarios siempre acertados, por los ejemplos de la vida con
películas que nunca vi, demás esta decir que muchas gracias por la ayuda con los
experimentos de la tesis. Ignacio o mejor conocido conio profesor Momo muchas gracias
por ayudarme a terminar mis experimentos y por ser una persona tan preocupada por los
demás, siempre que pueda y lo necesites estaré disponible. Leslie siempre voy a esperar
o extrañar, depende de donde esté, tus regalos de Semana Santa, de Navidad o de
cualquier fecha porque sentiste que era necesario. No tengo la menor duda que
alcanzarás todos tus objetivos, porque si hay una persona que los busca, esa eres tú .
María Francisca Pía (alias Fukita) muchas gracias por toda la buena onda y el cariño,
pero por sobre todo gracias por los chocolates blancos!!!!!!!!! Espero que sigas ganando
en el casino, pero que vayas sólo de vez en cuando (para que no te enojes le das mis
agradecimientos a la Gaby). Alejo y Milka gracias por los dichos, por la música autóctona
y por un millón de otras cosas tan distintas entre sí que se complementan perfectamente,
les deseo éxito a ambos para que este año tengamos otros dos titulados en el lab. Por
último dar las gracias a las nuevas generaciones que de a poco van dejando su huella en
ellab, Felipe y sus larvas, tortugas y quizás que otra cosa cultivaremos pronto, JP con sus
videos que nos mantienen actualizados y conectados con el mundo, Vale espero que
también dejes tu huella y que todos disfruten del ambiente del lab. No puedo olvidar a la
Meche, gracias por la música evangelizadora en la mañana y por la preocupación que
tienes por todos nosotros.

Ahora vienen los amigos de hace tiempo, esos que me aguantaron desde la U,
Jose, Charls, Karla, David y Alexis si nos seguimos juntando por algo será. Siempre
estarán en mi lista de invitados y espero que yo también en la de Uds. Por supuesto
extiendo esto a sus parejas (futuras señoras en algunos casos), que ya son parte de
nuestro grupo. Amigos míos muchas gracias por tantos años de amistad, espero que
todos cumplan sus proyectos y de ser posible encantado de ayudarlos para que los hagan
realidad.

Se que debería agradecer a muchas otras personas ya que cada uno de los que
estuvo cerca en algún momento me ayudó, aconsejó o simplemente me acompañó, pero
no puedo dejar de agradecer a la persona que ha hecho todas estas cosas juntas y
además me entendió. Si alguien se llevó los buenos y malos momentos de esta tesis es
Mariel quien me ha acompañado en este camino desde que estaba terminado mi
pregrado y ahora que ya soy todo un dostor, por eso las últimas palabras son para ti por
que sin ti esta tesis no sería lo mismo. Gracias amor por todos estos años de compañía.

Muchas gracias a todos

 ÍNDICE

ÍNDICE GENERAL

ÍNDICE GENRAL
ÍNDICE DE TABLAS iii
ÍNDICE DE FIGURAS iv
ABREVIATURAS v
RESUMEN ~

SUMMARY viii
1. INTRODUCCIÓN 1
1.1 ENFERMEDAD PERIODONTAL 1
1.2 PLACA SUBGINGIVAL Y PATOGENICIDAD 2
1.3 ENFERMEDADES SISTÉMICAS ASOCIADAS A PATÓGENOS PERIODONTALES 4
1.4 TRATAMIENTO ACTUAL Y RESISTENCIA ANTIBIÓTICA 5
1.5 BACTERIÓFAGOS Y FAGOTERAPIA 6
1.5.1 FAGO LAMBDA Y T4 COMO EJEMPLOS DE BACTERIOFAGOS ESTUDIADOS 7
1.5.2 FAGOTERAPIA 10
HIPÓTESIS 13
OBJETIVO GENERAL 13
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 14
2. MATERIALES Y MÉTODOS 15
2.1 REACTIVOS 15
2.2 MEDIOS DE CULTIVO 17
2.3 ANTIBIÓTICOS 18
2.4 SOLUCIONES 18
2.5 CEPAS BACTERIANAS 19
2.6 PLÁSMIDOS 20
2.7 PARTIDORES 21
2.8 CONDICIONES DE CULTIVO 22
2.9 AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LOS BACTERIÓFAGOS 22
2.10 TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR 26
2.11 ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO 30
2.12 FORMACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE BIOPELiCULA 30
2.13 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 32
3. RESULTADOS 33
3.1 AISLAMIENTO DE BACTERIÓFAGOS PARA FUSOBACTERIUM 33
3.1.2 ESPECIFICIDAD DE HOSPEDERO DE LOS BACTERIÓFAGOSAISLADOS 35
3.2 CARACTERIZACIÓN DE LOS VIRUS AISLADOS 37
 ÍNDICE

3.2.1 CARACTERIZACIÓN BACTERIÓFAGOS Aab$01 Y Fnp$11 37

3.2 .1.1 CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL Aab$01 Y Fnp$11 37
3.2.1.2 CARACTERIZACIÓN GENÉTICA Aab$01 37
3.2.1 .3 CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DEL FAGO Fnp$11 42
3.2.1.4 CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE Aab$01 Y Fnp$11 44
3.2.1 .4.1 ENSAYO DE ADSORCIÓN Y ONE STEP GROWTH (OSG) 44
3.2.1.4.2 CURVA DE INFECCIÓN Aab$01 48
3.2.1.4.2.1 LIBERACIÓN PROFAGO 51
3.2.1.4.3 CURVA DE INFECCIÓN Fnp$11 52
3.2.1.5 ESTABILIDAD DE Aab$01 Y Fnp$11 FRENTE A DISTINTAS CONDICIONES 53
3.3 TRANSFORMACIÓN DE LOS BACTERIÓFAGOS 56
3.3.1 CURVA DE INFECCIÓN Aab$01-1 57
3.4 ENSAYO DE REVERSIÓN DE LAS PARTÍCULAS VIRALES 58
3.5 EVALUACIÓN IN VITRO DE LA ACTIVIDAD DE LOS FAGOS 58
3.5.1 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LOS FAGOS SOBRE BIOPElÍCULAS 58
3.5.1.1 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS FAGOS Aab$01 Y Aab$01-1 58
3.5.2 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS FAGOS Fnp$11 y Fnp$02-14 65
3.5.3 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LOS FAGOS SOBRE BIOPElÍCULAS MIXTAS 70
4. DISCUSIÓN 72
4.1 AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DEL BACTERIÓFAGO Aab$01 72
4.2 AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN BACTERIÓFAGO Fnp$11 74
4.3 ENFERMEDAD PERIODONTAL Y FAGOTERAPIA 76
5. CONCLUSIONES 81
6. BIBLIOGRAFÍA 82
7. ANEXO 94
7.1 RESUMENES PRESENTADOS EN CONGRESOS 94
7.2 PUBLICACIONES 94

¡¡
 ÍNDICE

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Cepas bacterianas utilizadas en este estudio 19

Tabla 2. Partidores utilizados en este estudio 21
Tabla 3. Protocolo utilizado para la reacción de PCR 27
Tabla 4. Programas Bioinformáticos utilizados en este estudio 30
Tabla 5. Inducción lisógenos con luz UV en A. actinomycetemcomitans 35
Tabla 6. Especificidad de hospedero de Aab$01, Fnp$1 1 y Fnn$107 36
Tabla 7. Principales MLA con identidad nucleotídica (BLAST) del fago Fnp$11 43
Tabla 8. Principales dominios encontrados en MLA sin identidad nucleotídica 44
Tabla 9. Comparación datos de crecimiento fagos Aab$01 y Fnp$11 48
Tabla 1O. Estabilidad del fago Aab$01 y Fnp$11 frente a distintas condiciones 54
Tabla 11. Resumen caracterización fagos Aab$01 y Fnp$11 55
Tabla 12. Probabilidad de encontrar cepas resistentes a los fagos 58

¡¡¡
 ÍNDICE

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Esquema de protocolo de cuantificación de biopelícula con cristal violeta 31

Figura 2: Búsqueda bacteriófagos A. actinomycetemcomitans 34
Figura 3: Búsqueda bacteriófagos F. nucleatum 34
Figura 4 : Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) 37
Figura 5: Ensayo restricción y determinación de la masa molecular 38
Figura 6: Caracterización genética del fragmento A de Aab~01 40
Figura 7: Caracterización genética fragmento B de Aab~01 41
Figura 8: Ensayo restricción material genético Fnp~ 11 42
Figura 9: Ensayo de adsorción y One Step Growth (OSG) para Aab~01 46
Figura 10: Ensayo de adsorción y One Step Growth (OSG) para Fnp~11 47
Figura 11 : Curva de infección de Aab~01 50
Figura 12: Inducción liberación profago 51
Figura 13: Curva de infección Fnp~11 52
Figura 14: Estabilidad de los fagos Aab~01 y Fnp~ 11 a la temperatura 53
Figura 15: Curva infección partículas virales mutantes 56
Figura 16: Curva de infección Aab~01 - 1 57
Figura 17: Curva crecimiento biopelícula A. actinomycetemcomitans 59
Figura 18: Determinación del MOl 60
Figura 19: Efecto de los bacteriófagos sobre la biopelícula 61
Figura 20: Determinación del efecto de una segunda dosis del fago 63
Figura 21: Microscopía confocal de una biopelícula de A. actinomycetemcomitans 64
Figura 22: Formación biopelícula F. nucleatum en distintos medios de cultivo 67
Figura 23: Efecto bacteriolítico de Fnp~02-14 y Fnp~11 en distintos MOI's 68
Figura 24: Efecto de los bacteriófagos F np~02-1 4 y Fnp~11 sobre la biopelícula 69
Figura 25: Efecto bacteriolítico de Aab~01-1, Fnp~11 y Fnp~02-14 biopelículas mixtas 71
Figura 26: Efecto de los bacteriófagos Aab~01 - 1 , Fnp~11 y Fnp~ 02-14 biopelícula mixta 71

iv
 ÍNDICE

ABREVIATURAS

Abs Absorban cía

BHI Brain Heart lnfusion
Amp Ampicilina
Ca m Cloramfenicol
DO sao Densidad óptica medida a 600 nm
EDTA Acido Etilend iam inotetracético
h horas
ISP Instituto de Salud Pública de Chile
Kan Kanamicina
Kb Kilo base
pb Pares de bases
m in Minutos
PBS Tampón salino de fosfato
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
S segundo
UFC Unidades Formadoras de Colonia
ml mililitro
MLA Marco de lectura abierto
rpm Revoluciones por minuto
TAE Amortiguador Tris-ácido acético-EDTA
DNA Ácido dexosiribonucleico
uv Ultra violeta
nm nanómetro
MET Microscopía Electrónica de Transmisión
L Período de latencia
e Período de eclipse
b Burst size
OSG One Step Growth
MOl Mu/tiplicity of lnfection
aa Aminoácido

V
 ÍNDICE

RESUMEN

Las enfermedades periodontales asociadas a la placa dental son un importante

problema de salud pública, tanto en nuestro país como en todo el mundo. Se estima que
en Chile la prevalencia de esta enfermedad en la población adulta es mayor al 90%. Los
tratamientos actuales son largos y en algunos casos muy costosos lo que impide que
todas las personas tengan acceso a ellos. La etiología de las enfermedades periodontales
es atribuida tanto a factores del hospedero como a la placa dental, que corresponde a una
biopelícula constituida por un complejo microbiano embebido en una matriz polisacárida.
La acumulación de esta biopelícula dental puede producir gingivitis (inflamación de la
encía}, la manifestación clínica más leve dentro de las enfermedades periodontales, y
periodontitis, donde se produce destrucción de los tejidos de soporte del diente como
encía, ligamento periodontal y hueso alveolar. El tratamiento actual comprende, según
sea el caso, remoción mecánica de la placa, terapia antibiótica y cirugía reconstructiva,
pero todavía existe una intensa búsqueda de una terapia más efectiva, específica y
económica.
Aggregatibacter actinomycetemcomitans y Fusobacterium nucleatum son algunas
de las bacterias asociadas a la enfermedad periodontal y debido a las limitaciones del
tratamiento con antibióticos, una terapia antimicrobiana alternativa es la fagoterapia, que
consiste en utilizar virus que infectan bacterias (bacteriófagos) para erradicar la infección.
Las principales ventajas de utilizar bacteriófagos es que poseen una especificidad de
hospedero muy estricta, son inocuos para las células eucariontes y son capaces de
eliminar bacterias multirresistentes a antibióticos. En este sentido, numerosos estudios
apoyan la eficacia de esta terapia en infecciones contra peces, animales y humanos y por
ende sugieren que la fagoterapia es una alternativa viable y de bajo riesgo para la
población.
A partir de muestras de saliva y de aguas residuales contenidas en los sillones
dentales se aislaron bacteriófagos específicos para Aggregatibacter
actinomycetemcomitans y Fusobacterium nucleatum, denominados Aab~01 y Fnp~11 ,

respectivamente. Aab~01 es específico para A. actinomycetemcomitans serotipo b,

presenta una simetría binaria compuesta de una cabeza icosahédrica de 50 nm y una cola
filamentosa de 150 nm, tiene un material genético de DNA doble hebra de 30 Kpb, es
capaz de integrarse al genoma de su bacteria hospedera y de escindirse al ser inducido.
Por estas características fue clasificado dentro de la familia Siphoviridae. Por otra parte,

vi
 ÍNDICE

Fnp¡p11 es un fago virulento específico para F. nucleatum subsp. nucleatum y subsp.

polymorphum. Este fago tiene una simetría binaria con una cápside icosaédrica de 77
nm y una cola pequeña 55 nm, su material genético es de DNA doble hebra de 99 Kpb.
Las características estructurales del fago permitieron clasificarlo en la familia Podoviridae.
Por medio de mutación al azar del fago Aab¡p01 se obtuvo una partícula mutante
viral denominada Aab¡p01-1, esta partícula viral es más eficiente que la parental,
eliminando un mayor porcentaje de la población bacteriana. Cuando estos fagos fueron
probados sobre una biopelícula de A. actinomycetemcomitans, Aab¡p01 eliminó al 99,5%
de las bacterias al interior de la biopelícula utilizando un MOl de1:10, mientras Aab<P01-1
eliminó a la misma cantidad de bacterias con un MOl menor, indicando que se necesitan
menos fagos para obtener el mismo efecto. Al realizar este ensayo sobre una biopelícula
de F. nucleatum, el fago Fnp¡p11 fue capaz de eliminar completamente el cultivo
bacteriano. De la misma forma estos fagos son capaces de alcanzar sus bacterias blanco,
al interior de biopelículas complejas, pero presentan una menor eficiencia que la
encontrada en las biopelículas simples. Los resultados expuestos en esta Tesis indican
que la utilización de fagos contra bacterias pertenecientes a la placa dental como A.
actinomycetemcomitans y F. nuc/eatum, es posible y su utilización in vivo debe ser
probada con el fin de establecer una terapia complementaria a las terapias
convencionales.

vii
 ÍNDICE

SUMMARY

Periodontal diseases associated with dental plaque are a major public health
problem in both our country and around the world. The prevalence of this disease in the
adult Chilean population is greater than 90%. Current treatments are long and sometimes
very expensive. The etiology of periodontal disease is attributed to both host factors as
dental plaque, which corresponds to a biofilm formed by a complex microbial
polysaccharide. The accumulation of dental biofilm can cause the gingivitis (gum
inflammation), the milder clinical expression in periodontal disease and periodontitis, which
causes destruction of tissues supporting of the teeth, like periodontalligament and alveolar
bone. Aggregatibacter actinomycetemcomitans and Fusobacterium nucleatum are so me of
the bacteria associated with periodontal disease. Current treatment includes, mechanical
plaque removal, antibiotic therapy and reconstructive surgery, but there is still an intense
search for more specific, economical and effective therapy. Due to the limitations of
antibiotic treatment, an alternative antimicrobial therapy is phagotherapy, which consist in
the use of viruses (bacteriophages) that infect bacteria to eradicate the infection. The main
advantages of using bacteriophages is that they have very strict host specificity, are
harmless to eukaryotic cells and are able to eliminate multidrug-resistant bacteria to
antibiotics. There are numerous studies supporting the efficacy of this therapy against
infections in fish, animals and humans and therefore suggest that phagotherapy is a
viable, low risk to the public.
From saliva samples and wastewater contained in the dental chair, specific
bacteriophages were isolated for Aggregatibacter actinomycetemcomitans and
Fusobacterium nuc/eatum, called Aab~01 and Fnp~11, respectively. Aab~01 is specific for
A. actinomycetemcomitans serotype b, has a binary symmetry composed of an
icosahedral head of 50 nm and 150 nm filamentous tail, has a genetic material of double-
stranded DNA 30 Kbp, is able to integrate into the genome of its host bacterium and
cleaved to be induced. Because of these characteristics were classified in the Siphoviridae
family. On the other hand, Fnp~11 is a virulent phage specific for F. nucleatum subsp.
nuc/eatum and subsp. polymorphum. This phage has a binary symmetry an icosahedral
capsid of 77 nm and 55 nm a small tail, their genetic material is double-stranded DNA of
99 kbp. The structural characteristics of the phage allow their inclusion in the Podoviridae
family.

viii
 ÍNDICE

Through random mutation of the phage Aab~01 was obtained mutant viral particle
called Aab~01-1 , this virus particle is more efficient than the Aab~01, removed a greater
percentage of the bacteria! population. When these phages were tested on a biofilm of A.
actinomycetemcomitans, Aab~01 removed 99,5% of bacteria within the biofilm using a
MOl about 1:10, while Aab~01-1 eliminated the same amount of bacteria with a lower MOl,
indicating that fewer phages are required for get the same effect. On the other hand,
Fnp~11 phage was capable of completely eliminating the bacteria! culture. In addition,
these phages are able to achieve their targets bacteria, within complex biofilms, but have a
lower efficiency than that found in simple biofilms. The results presented in this thesis
indicate that the use of phages against bacteria belonging to plaque as A.
actinomycetemcomitans and F. nucleatum is possible and in vivo use must be tested to
establish a complementary therapy to conventional treatments.

ix
 INTRODUCCIÓN

1. INTRODUCCIÓN

1.1 ENFERMEDAD PERIODONTAL

Las enfermedades periodontales asociadas a la placa dental son un importante

problema de salud pública, debido principalmente a su alta incidencia en la población y los
costos asociados. En nuestro país un estudio reveló que más del 98% de las personas
entre 35 y 44 años presentaban alguna manifestación de esta enfermedad y que la
prevalencia en pacientes de estratos socioeconómicos bajo y medio bajo entre 65 y 74
años era del 100% (Gamonal y cols., 1998). Los estudios de prevalencia de esta
enfermedad en los pacientes chilenos indican que toda la población adulta requiere algún
tipo de higiene bucal y cerca del 50% necesitan un tratamiento periodontal completo
(Gamonal y cols., 1998).

La enfermedad periodontal se puede definir como cualquier alteración de los

tejidos que rodean y dan soporte al diente (periodonto). Estas enfermedades pueden ser
de carácter infeccioso, traumático, neoplásico, genético o de origen metabólico (Armitage,
2004; Jordan, 2004). Sin embargo, el término enfermedad periodontal o periodontitis
usualmente hace referencia a un conjunto de enfermedades infecciosas, transmisibles y
multifactoriales, en las cuales un complejo microbiano (bacterias, virus y levaduras)
interactúa con células del hospedero afectando el periodonto (Pihlstrom y cols., 2005).
Las manifestaciones clínicas de esta enfermedad pueden ser agrupadas bajo la
denominación de gingivitis y periodontitis. La gingivitis, la forma más leve de la
enfermedad, corresponde a una inflamación de los tejidos blandos del diente,
fundamentalmente la encía, sin extenderse a otros tejidos de soporte. Por el contrario, el
término periodontitis se utiliza para definir la destrucción progresiva de estructuras
periodontales tales como el ligamento periodontal, tejido conectivo gingival y hueso
alveolar. Esta destrucción progresiva comienza con la destrucción del ligamento
periodontal y por lo tanto, la pérdida de la adhesión de la encía al diente. Esto último
conlleva a la formación del saco periodontal, el cual aumenta en profundidad a medida
que la enfermedad progresa. Finalmente la destrucción de los tejidos de soporte puede
terminar con la pérdida de la pieza dental (Pihlstrom y cols., 2005).

En términos generales es aceptado que un grupo de microorganismos y no sólo

una especie bacteriana son los involucrados en el desarrollo de la enfermedad. Este

1
 INTRODUCCIÓN

grupo forma parte de la placa dental, que ha sido definida como una comunidad de
diversos microorganismos (no sólo bacterias) adheridos a la superficie del diente como
una biopelícula. Esto quiere decir que los microorganismos se encuentran embebidos en
una matriz de polímeros provenientes tanto de las bacterias como del hospedero. Como
entidad microbiana es parte de la flora normal y como tal coexiste en armonía con su
hospedero. La enfermedad se establece cuando se pierde este equilibrio, ya sea por
cambios en la magnitud o naturaleza de la comunidad microbiana, pasando de una placa
dental "normal" a una "patógena", o por factores del hospedero, que incluyen los hábitos
higiénicos, alimenticios, el establecimiento de otras enfermedades o alteraciones en la
respuesta inmunológica (Marsh y cols., 2004; Nishihara y Koseki., 2004).

1.2 PLACA SUBGINGIVAL Y PATOGENICIDAD

La estructura y patogenicidad de la placa subgingival es intensamente estudiada y

se estima que existirían más de 700 especies bacterianas capaces de colonizar la cavidad
oral en humanos. Alrededor de la mitad de estas especies aún no son cultivables in vitre
(Paster y cols., 2006; Warburton y cols., 2011), por lo que a pesar de las estimaciones no
está claro como las distintas especies compiten, coexisten y/o cooperan para iniciar este
proceso infeccioso crónico (Paster y cols., 2001).

La placa dental sería iniciada por la colonización de los colonizadores tempranos

que incluyen miembros de los género Streptococcus, Actinomyces, Haemophilus,
Neisseria, and Veillonella (Marsh, 1994). Estas bacterias se adhieren a la película
adquirida del esmalte dental por interacciones moleculares específicas y no específicas
entre las adhesinas de la célula y los receptores de superficie (Busscher y cols., 1992;
Marsh, 1994). Una vez establecida esta microflora permite la coagregación de otras
especies bacterias. La coagregación es una propiedad común en el desarrollo de la placa
dental y permite que bacterias que no tienen la capacidad de adherirse al diente y/o
tejidos presentes en la cavidad oral puedan colonizarlos. Tal es el caso de Fusobacterium
que forma un "puente" que permite la colonización de Porphyromonas gingiva/is,
Treponema denticola y Tannerel/a forsythia, considerados colonizadores tardíos y los
principales agentes etiológicos de la enfermedad (Marsh, 1994; Olson y cols., 2011). La
sucesión ecológica de las poblaciones microbianas, comenzando por cocáceas Gram
positivo y finalizando por anaerobios Gram negativo de diversa morfología, lleva a un

2
 INTRODUCCIÓN

cambio en la composición de la biopelícula que se correlaciona con la aparición de la

gingivitis y la periodontitis (Marsh, 1994; Olson y cols., 2011).

El análisis de la microflora bucal ha permitido identificar diversas asociaciones

entre los microorganismos que conforman la biopelícula dental incorporando diferentes
especies dentro de grupos o complejos. Esta biopelícula (placa dental) es propia de todas
las personas, tanto sanas como periodontalmente enfermas. La diferencia radicaría
principalmente en las proporciones en que se encuentran los diferentes grupos dentro de
cada persona (Dzink y cols., 1988; Socransky y cols., 1988; Socransky y cols., 1998;
Socransky y cols., 2005). Hasta la fecha se han descrito 6 complejos, donde los
complejos azul, amarillo, verde y morado, incluyen especies consideradas no patógenas y
predominantes en personas sanas; y los complejos rojo y naranjo que estarían
involucrados en la iniciación y progresión de la enfermedad (Socransky y cols., 1988;
Socransky y cols., 2005). El complejo naranjo está compuesto por Prevotella intermedia,
P. nigrescens, Micromonas micras (ex Peptostreptococcus), varias subespecies de
Fusobacterium nucleatum, F. periodonticum, Streptococcus constellatus, Eubacterium
nodatum, Campylobacter rectus y C. showae, mientras que el complejo rojo está
compuesto por Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola y Tannerella forsythia (ex
Bacteroides forsythus o Tannerella forsythensis). Adicionalmente Aggregatibacter (ex
Actinobacillus) actínomycetemcomitans es otra bacteria que ha sido involucrada en la
progresión de la enfermedad periodontal, pero que no ha sido agrupada en ninguno de los
complejos anteriormente mencionados (Socransky, 1988 y cols.; Socransky y cols., 2005).
A pesar de que los mecanismos de patogenicidad y los factores de virulencia asociados a
estos patógenos son bastante estudiados, aún no está claro de qué manera se inicia y se
gatilla esta enfermedad (Henderson y cols., 2003; Holt y Ebersole, 2005). Tampoco está
totalmente esclarecido cómo interactúan unos microorganismos con otros dentro de la
biopelícula, ni cuáles son las condiciones que inducen la expresión de sus factores de
virulencia. Sin embargo, aunque microorganismos específicos han sido asociados con la
enfermedad periodontal, dicha asociación se sustenta en las observaciones de cultivos in
vitro y debido a que sólo un 60% de las especies en la placa dental orales son cultivables
(Paster y cols., 2006; Warburton y cols., 2011) los análisis cultivo-independientes podrían
llevar a un nuevo nivel de comprensión de las asociaciones e interrelaciones que ocurren
en la placa subgingival (Armitage, 2010; Olson y cols., 2011).

3
 INTRODUCCIÓN

Por otra parte, la placa dental como cualquier biopelícula, es una comunidad
compleja y muy organizada que confiere muchas ventajas a sus especies constituyentes
respecto a sus contrapartes de vida libre. Las ventajas más relevantes para las bacterias
de la biopelícula dental son la protección frente a las defensas del hospedero (fagocitosis
y sistema del complemento) y a los agentes antimicrobianos como los antibióticos y
antisépticos (Marsh y cols., 2005; Socransky y cols., 2002).

Aun cuando esta enfermedad no es de riesgo vital sus consecuencias conllevan un

deterioro en la calidad de vida de las personas, así como costos económicos importantes
asociados al tratamiento. Además se ha demostrado en diversos estudios clínicos que los
patógenos periodontales pueden ser traslocados y liberados desde el surco gingival al
flujo sanguíneo. Esta bacteremia transitoria ocurre en el 17%-100% de los individuos
infectados luego de procesos dentales tanto preventivos como terapéuticos, incluyendo el
cepillado, la masticación, el tratamiento periodontal y las extracciones dentales (Berbari y
cols., 1997).

1.3 ENFERMEDADES SISTÉMICAS ASOCIADAS A PATÓGENOS PERIODONTALES

La asociación de bacterias orales con determinadas infecciones extraorales

localizadas y sistémicas, así como su potencial relación con una mayor prevalencia de
determinadas patologías se ha resumido en una serie de revisiones (Berbari y cols., 1997;
Seymour y cols., 2007; Taubert y cols., 2001; Wada y cols., 2010). La mayoría de estos
hallazgos se limita a estudios epidemiológicos, mientras que los detalles etiológicos
continúan no aclarados. Por ejemplo, la amigdalitis se ha caracterizado como una
infección dada por Streptoccoccus beta hemolíticos del Grupo A (SGAB), pero
actualmente el posible rol de anaerobios Gram negativos en el proceso inflamatorio agudo
en las amígdalas está basado en observaciones tales como un alto aislamiento de estas
bacterias en infecciones asociadas a no SGAB, desde abscesos, celulitis peritonsilar y
mononucleosis infecciosa, así como la detección de respuesta inmune a Prevotella
intermedia y Fusobacterium nucleatum (Brook, 2005). Más aún, Fusobacterium
necrophorum puede causar tonsilitis necrotizante y septicemia, llevando a expandir la
infección y desarrollando abcesos en pulmones y cerebro (una forma de Síndrome de
Lemierre) (Hagelskjaer-Kristensen y cols., 2008).

4
 INTRODUCCIÓN

Por otra parte, se ha estudiado con gran interés el efecto de la presencia de

bacterias asociadas a la enfermedad periodontal con el desarrollo de enfermedades
como diabetes mellitus, reumatitis artroide y diversas patologías cardíacas (Mealey y
cols., 2008; Hujoel y cols., 2000; Kshirsagar y cols., 2005). De estas últimas las más
estudiadas son aterosclerosis, aneurismas arterioscleróticas, enfermedad coronaria,
enfermedad Buerger y endocarditis infecciosa (Wada y cols., 201 0). Dentro de los
patógenos periodontales se estudia la presencia de la bacteria Aggregatibacter
actinomycetemcomitans como la bacteria más importante dentro del grupo HACEK
asociadas endocarditis infecciosas (Paturel y cols., 2004). Actualmente también han
ganado protagonismo Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum y Prevotella
intermedia asociados a estas patologías (Seymour y cols., 2007; Wada y cols., 2010).

1.4 TRATAMIENTO ACTUAL Y RESISTENCIA ANTIBIÓTICA

Hasta la fecha, la principal estrategia para contener la progresión de la

enfermedad son el destartraje mecánico de la placa y el pulido radicular, más la utilización
de antisépticos tópicos y antibióticos sistémicos. Sin embargo, estos tratamientos son
paliativos y todavía existe controversia respecto a la efectividad y seguridad del
tratamiento antibiótico actual. Esto, fundamentalmente porque los antibióticos utilizados
(Amoxicilina y Metronidazol) pueden interferir con el desarrollo de la flora normal de todo
el organismo (Siots, 2002; Slots y Jorgensen, 2002). Otro punto a considerar en la
utilización de antibióticos, es que la biopelícula genera una barrera que retarda la difusión
de éstos, por lo que se requieren mayores dosis para un mismo efecto. Además la
aparición de cepas capaces de sintetizar enzimas que son exportadas al medio
extracelular como j)-lactamasas puede llevar al fracaso de la terapia. Aun cuando sólo
ciertas especies pueden producir estas enzimas, su difusión contribuye a la resistencia de
toda la biopelícula, ya que quedan atrapadas en la matriz inactivando los antibióticos. Por
otra parte, es importante considerar que la tasa de crecimiento que presentan las
bacterias dentro de la biopelícula es relativamente baja, producto principalmente de un
metabolismo disminuido y de un cambio en la expresión genética. Esto se traduce en una
menor efectividad de los antibióticos, ya que la mayoría de ellos actúa a nivel de la
replicación del material genético, la síntesis de proteínas o la biosíntesis de pared. Más
aún, el estilo de vida comunitario que se presenta dentro de la placa favorece la
transferencia horizontal de genes. Recientemente en un estudio realizado por Weinbauer
y cols. (2011) se aislaron 32 nuevos plásmidos desde muestras provenientes desde la

5
 INTRODUCCIÓN

placa supra y subgingival lo que facilitaría enormemente la aparición de cepas resistentes

a los antibióticos (Marsh y cols., 2005; Socransky y cols., 2002). Se estima que un 2% de
los anaerobios cultivables pertenecientes a la placa subgingival son resistentes a
metronidazol, un 3% a penicilina G y un 0,5% a amoxicilina (Malik y cols., 2010).
Asociado a esta resistencia se ha demostrado que tanto la concentración inhibitoria
mínima (MIC) como la concentración bactericida mínima (MBC) de los antibióticos
incrementan cuando los microorganismos están creciendo en una biopelícula, siendo
imposible eliminarlos con el sólo uso de antibióticos (Costerton y cols., 1999; Sedlacek y
cols., 2007).

En términos generales el principal problema de la terapia antibiótica actual es la

aparición de numerosas especies bacterianas multirresistentes a éstos. Datos de la Food
and Drug Administration (FDA) indican que cerca del 70% de las bacterias que causan
infecciones intrahospitalarias son resistentes a las drogas comúnmente utilizadas. Esto ha
traído como consecuencia la disminución en las alternativas terapéuticas, un aumento en
los costos y peor aún, tratamientos infructuosos (Boyce y cols., 2005; Levy y Marshall,
2004; Obritsch y cols., 2005; Wilke y cols., 2005).

1.5 BACTERIÓFAGOS Y FAGOTERAPIA

La decadencia de la terapia antibiótica, ha sido uno de los principales factores que

ha permitido que la terapia con fagos se haya convertido nuevamente en una alternativa
interesante. Al igual que los virus que infectan eucariontes, los fagos consisten
básicamente en una cubierta proteica en cuyo interior se encuentra el material genético
(nucleocápside). La cubierta proteica o cápside puede presentar una simetría pleomórfica,
poliédrica, helicoidal (filamentosos) o una combinación de las dos últimas que da origen a
los fagos con "cola" (Ackermann, 2001). El ciclo replicativo de estos virus procariontes
posee varias etapas que son comunes para todos los virus, como son: la adsorción, la
separación del material genético de la cápside proteica (desnudamiento), la expresión y
replicación del material genético, el ensamblaje del virión, la liberación y posterior
transmisión. La adsorción o fijación ocurre en dos etapas: la primera es reversible y
permite el acercamiento del fago a la superficie bacteriana. Durante la segunda etapa, se
produce una unión irreversible entre alguna estructura del fago (ej. fibras proteicas de la
cola) y un receptor específico de la célula blanco (ej, polisacáridos, fimbrias, flagelo), lo
que hace altamente selectiva la infección viral. Una vez adsorbido, a diferencia de los

6
 INTRODUCCIÓN

virus animales, los fagos deben atravesar la pared bacteriana, para lo cual utilizan
enzimas tipo lisozima que hacen permeable la pared. Esto se traduce en la entrada de su
material genético al citoplasma bacteriano y la retención de la cápside en la superficie
celular. Una vez dentro, el genoma viral se puede integrar al genoma bacteriano o
permanecer libre en el citoplasma. De cualquier forma, este material genético se puede
expresar y puede comenzar la replicación del genoma viral (Weinbauer, 2004).

El desarrollo del ciclo replicativo viral permite agrupar a los fagos en cuatro grupos:
(1) los fagos de ciclo lítico (fagos líticos o virulentos), no integran su material genético sino
que redirigen el metabolismo bacteriano hacia la producción de nuevos fagos, los que son
liberados durante la lisis de la bacteria. (2) Los fagos de ciclo lisogénico (fagos
temperados o lisogénicos), donde el genoma del bacteriófago es integrado en el genoma
bacteriano, manteniéndose en su hospedero en un estado silente (profago). Su material
genético se replica junto con el de la bacteria sin destruirla, hasta que, bajo ciertas
condiciones (ej. radiación UV), se induce la expresión del genoma del fago y comienza su
replicación, ensamblaje y su liberación mediante la lisis de la célula hospedera. (3) Los
fagos de infección persistente o ciclo pseudolisogénico, donde los fagos se multiplican
sólo en una fracción de la población bacteriana y (4) los fagos de infección crónica, que se
caracterizan por una liberación constante de la progenie del fago por gemación sin
destruir a la bacteria. La gran mayoría de los fagos estudiados hasta la fecha
corresponden a fagos de ciclos líticos y lisogénicos, por lo que en general sólo se hace la
distinción entre estos dos tipos de bacteriófagos (Matsuzaki, 2005; Weinbauer, 2004).

1.5.1 FAGO LAMBDA Y T4 COMO EJEMPLOS DE BACTERIOFAGOS ESTUDIADOS

Ciclo infectivo Fago Lambda

El fago A-, es uno del los bacteriófagos más estudiado y se considera el prototipo
de una serie de fagos considerados tipo-Lambda o Lamboides, ya que comparten una
serie de características genéticas y estructurales con este fago. El fago A, tiene un material
genético de DNA doble hebra de 48.502 pb, conteniendo aproximadamente 50 genes, que
codifican para 5 proteínas relacionadas con la regulación, 7 con la recombinación, 21 con
la morfogénesis de la cápside y cola, 2 con la replicación y 2 con la lisis bacteriana
(Chauthaiwale y cols., 1992). El genoma del fago A, está organizado de tal forma que
presenta grupo de genes en unidades funcionales. A la derecha del sitio attP (sitio de

7
 INTRODUCCIÓN

integración del fago), se localizan los genes relacionados con la recombinación,

posteriormente los genes relacionados a la regulación, le siguen los de replicación, los de
lisis y finalmente los genes relacionados para la formación de la cápside y de la cola
(Oppenheim y cols., 2005). La infección es realizada básicamente en dos etapas, la
adsorción y la inyección del DNA. La adsorción es reversible a bajas temperaturas, pero
resulta irreversible una vez que el DNA ha sido inyectado. Lambda infecta eficientemente
a 3rC y se ha descrito el requerimiento de cationes bivalentes como Mg 2+ y Ca 2 + para
que el proceso de adsorción sea funcional (Gárces y De Vidania, 1984). El producto del
gen J del fago A, reconoce al receptor de maltosa LamB ubicado en la membrana externa
de E. coli (Charbit y cols., 1994). Luego de la adsorción el DNA del fago es circularizado al
interior de la bacteria por la unión de sus extremos cohesivos en los sitios cos (regiones
de cadena sencilla de ADN de 12 nucleótidos y cuyas secuencias se complementan,
Chauthaiwale y cols., 1992). El fago A es un fago temperado por lo que una vez que
inyecta su material genético debe "escoger" entre la vía lítica y la vía lisogénica. Esta
decisión se encuentra finamente regulada a través de la expresión diferencial de sus
genes. El desarrollo del ciclo lítico de A se da en tres etapas. (i) Debe expresar los
productos génicos N y Gro, los cuales darán origen al producto N que suprime los
terminadores de la transcripción (antiterminador) y Cro que es un regulador negativo del
ciclo lisógenico. Estos genes están comandados por los promotores pL y pR,
respectivamente y los transcritos terminan tempranamente en los terminadores de la
transcripción denominados tL 1 y tR 1. En presencia de N, estos terminadores de la
transcripción son inhibidos permitiendo la transcripción de genes tardíos (Friedman y
Court, 1995). (ii) Los genes tardíos incluyen reguladores del ciclo lisogénico como Cll y
Clll, genes involucrados con la replicación del DNA (O y P) y la proteína Q. (iii) La
siguiente etapa está regulada por la acumulación de Q, la que actúa como un
antiterminador, modificando la RNA polimerasa y permitiendo la transcripción de genes
que están relacionados con la morfogénesis y la lisis de la célula (Oppenheim y cols.,
2005).

La inhibición o ausencia de las proteínas involucradas en el desarrollo del ciclo

lítico de A no son suficientes para que este fago realice un ciclo lisogénico. Esta
respuesta se da a través de una serie de eventos como la integración del DNA, la
represión eficaz de los promotores pL y pR y la inhibición oportuna de la expresión de
genes líticos (activación de la lisogenia). Para llevar a cabo estos pasos, A requiere que

8
 INTRODUCCIÓN

Cll se acumule en una concentración que sea capaz de inducir los promotores pi, pRE y
paQ. pi y pRE comandan la transcripción de los genes lnt-Xis y Cl, respectivamente. lnt y
Xis catalizan la recombinación sitio-específica del genoma de A en su hospedero y Cl
actúa como un inhibidor de los promotores pL y pR inhibiendo el ciclo lítico (esta
característica le permite actuar como proteína de inmunidad). Por otra parte, desde el
promotor paQ se generará un transcrito antisentido que impedirá la traducción del
antiterminador Q inhibiendo con ello la síntesis de proteínas involucradas en la lisis celular
(Oppenheim y cols., 2005). Una vez integrado en el genoma de la bacteria, Cl comienza a
ser expresado desde el promotor pRM, este cambio permite que el fago A se mantenga
como profago (mantención de la lisogenia, Reichardt y Kaiser, 1971 ).

La escisión del profago requiere de la activación del ciclo lítico. Uno de los
estímulos más estudiados que induce la liberación de partículas virales integradas es la
acción de la luz UV. La luz UV induce mutaciones y quiebres a nivel del DNA, este daño
en el DNA resulta en la activación de la proteína RecA (Witkin y cols., 1987). Esta
proteína de origen bacteriano promueve la degradación de Cl impidiendo que este
represor se una al DNA. Al liberarse de la represión por Cl comienzan a transcribirse los
promotores pL y pR lo que conlleva a una nueva activación del ciclo lítico y la liberación
de una nueva progenie viral.

Ciclo infectivo Fago T4

Los fagos tipo T (T-even phages) como el fago T2 y T4 han sido uno de los
modelos más utilizados para el desarrollo de la biología molecular. El estudio de estos
fagos permitió reconocer que los ácido nucleicos son el material genético, que el código
genético está codificado en tripletes, se descubrió el mRNA, los sistemas de modificación-
restricción del DNA entre otros aspectos fundamentales de la biología molecular actual
(Miller y cols., 2003). Las ventajas de T4 como modelo de estudio radican en parte que el
virus inhibe completamente la expresión de genes de su hospedero, permitiendo
claramente diferenciar entre la síntesis de proteínas del fago y del hospedero (Miller y
cols., 2003) T4 tiene un material genético de DNA doble hebra de 168.903 pb,
conteniendo aproximadamente 300 genes, de los cuales 289 codifican proteínas, 8
codifican para tRNA's y al menos otros dos genes codifican pequeños RNA's sin una
función asignada. De estos genes, sólo 62 son esenciales para comprender como T4
realiza un ciclo infectivo en condiciones de laboratorio, la mayoría de ellos codifican para

9
 INTRODUCCIÓN

proteínas del replisoma, reguladores transcripcionales y proteínas estructurales del fago

(Miller y cols., 2003). T4 es un miembro de la familia Myoviridae que infecta
específicamente a E. coli y fue el primer virus visualizado por microscopía electrónica
(Luria y Anderson, 1942). Tiene una cápside icosahédrica, una cola con un aparato
contráctil que le permite la introducción del DNA en la bacteria y largas fibras en la cola
que le permiten el reconocimiento y fijación en la superficie de la bacteria (Kuznetsov y
cols, 2011). T4 comienza su ciclo infectivo al reconocer el lipopolisacárido (LPS) de E.
coli, permitiendo con ello la adsorción del fago (Henning y Jann, 1979; Picken, 1981 ).
Luego de inyectar su material genético comienza a sintetizar y replicar su material
genético en forma secuencial para poder finalizar con la lisis bacteriana. T4 utiliza tres
clases de promotores, los cuales definen el desarrollo del ciclo infectivo del fago. Estos
promotores se conocen como promotores tempranos (Pe), medios (Pm) y tardíos (Pi).
Cuando T4 inyecta su DNA también entra una proteína llamada gpAit, esta proteína tiene
como función ADP-ribosilar la RNA polimerasa bacteriana en un residuo de arginina y con
ello aumentar la afinidad de ésta por los Pe (Miller y cols., 2003). Uno de los genes
transcritos desde los Pe corresponde a asiA. La proteína AsiA es capaz de formar un
complejo con el factor cr 70 que redirige la RNA polimerasa bacteria hacia los Pm (Orsini y
cols., 1993). Desde estos promotores se transcribe un factor sigma viral denominado gp55
o s55 el cual tiene como función dirigir la holoenzima a los PI. Finalmente desde estos
promotores se expresarán los genes relacionados con la morfogénesis y liberación viral
(Williams y cols., 1994).

Debido a que T4 sólo realiza ciclo lítico, este fago y fagos tipo T4 han sido
ensayado como posibles agentes antibacterianos (Bruttin y Brussow, 2005; Levin y Bull,
2004; Matsuzaki y cols., 2005; Raya y cols., 2011).

1.5.2 FAGOTERAPIA

Los fagos virulentos o de ciclo exclusivamente lítico han sido considerados, desde
su descubrimiento, como potenciales agentes antimicrobianos. En sus inicios la terapia
con fagos o fagoterapia tuvo éxitos y fracasos, estos últimos principalmente por el
desconocimiento de la genética viral. Hacia 1940 su estudio se abandonó en occidente
por el advenimiento de los antibióticos, pero continuó en oriente dónde existen
importantes centros de fagoterapia en varios países de la ex Unión Soviética.

10
 INTRODUCCIÓN

La fagoterapia posee numerosas ventajas en comparación a los tratamientos

antibióticos actuales:

(1) a diferencia de la terapia con antibióticos, los fagos son efectivos contra bacterias
patógenas multirresistentes, debido fundamentalmente a que los mecanismos mediante
los cuales se induce la lisis bacteriana son diferentes;

(2) es altamente específica y tiene un rango de hospedero reducido. Si bien esto podría
parecer una desventaja, puede ser utilizado para seleccionar el blanco específico sobre
una población bacteriana. Esto disminuye el problema que presentan los antibióticos de
amplio espectro al eliminar la flora normal sensible junto con los microorganismos
patógenos. Del mismo modo se evitarían así las infecciones por proliferación de
microorganismos oportunistas como es el caso de la colitis pseudomembranosa producida
por Clostridium difficile;

(3) los fagos pueden responder rápidamente a la aparición de mutantes resistentes, ya

que ellos mismos pueden mutar. Además, como los fagos utilizan estructuras de la
superficie bacteriana para infectar, al mutar estas estructuras e impedir el ingreso del
genoma viral, la bacteria puede perder importantes factores de virulencia;

(4) los fagos son modificables y renovables en el tiempo, ya que se pueden reproducir por
millones manteniendo un cultivo in vitro del hospedero adecuado. Esto hace que el
desarrollo de este sistema sea más económico que el desarrollo de un nuevo antibiótico;

(5) los antibióticos sólo pueden eliminar exitosamente o inhibir el crecimiento de una
población bacteriana susceptible cuando existe una concentración efectiva del antibiótico
en el sitio de la infección (farmacocinética). Sin embargo, los fagos son replicativos, de
modo que una baja concentración de éstos puede amplificarse dentro de una población
bacteriana suficientemente densa y fisiológica y genéticamente permisiva;

(6) los fagos pueden codificar exopolisacaridasas lo que les permitía encontrar con mayor
facilidad a su bacteria blanco embebida en una biopelícula;

(7) finalmente, debido a que los fagos o sus productos no afectan a las células
eucariontes, la fagoterapia per se debería ser inocua.

11
 INTRODUCCIÓN

Estudios pre-clínicos en animales han demostrado la eficiencia de los

bacteriófagos en el tratamiento de enfermedades bacterianas. Smith y cols demostraron
que la diarrea generada experimentalmente por Escherichia coli en becerros puede ser
completamente controlada por la administración de una mezcla de 6 bacteriófagos (Smith
y cols., 1987). Además, Sheng y cols. demostraron que la combinación de los
bacteriófagos KH1 y SH1 reduce el número de E. coli 0157:H7 en ovejas (Sheng y cols.,
2006). Un estudio reciente, realizado en voluntarios humanos que recibieron oralmente
dosis elevadas (1 0 5 UFP/ml) del fago T 4 de E. coli, no reportó efectos adversos
relacionados con la aplicación del bacteriófago (Bruttin y Brussow, 2005; Levin y Bull,
2004; Matsuzaki y cols., 2005). En el año 2006 la FDA aprobó el uso de una suspensión
de fagos para el control de Listeria monocytogenes en diversos productos alimenticios
(Lang, 2006). En el área odontológica, existen reportes sobre el aislamiento de
bacteriófagos para bacterias orales de la placa dental, como Fusobacterium nucleatum
(bacteriófago Fnn<j>02, Machuca y cols., 201 O) y Enterococcus faecalis. Este último
bacteriófago específico para E. faecalis eliminó completamente una infección bacteriana
de dentina humana (Paisano y cols., 2004). Estos hallazgos permiten considerar a la
fagoterapia como una alternativa viable para el control de los patógenos orales.

12
 HIPÓTESIS

HIPÓTESIS
"La utilización de bacteriófagos líticos para Aggregatibacter actinomycetemcomitans y
Fusobacterium nucleatum tienen un efecto selectivo sobre estos patógenos embebidos en
la placa dental.".

OBJETIVO GENERAL
Buscar y caracterizar bacteriófagos específicos para Aggregatibacter
actinomycetemcomitans y Fusobacterium nuc/eatum y determinar su efecto bacteriolítico
sobre estas bacterias embebidas en una biopelícula.

13
 OBJETIVOS

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Aislamiento de bacteriófagos específicos para Aggregatibacter

actinomycetemcomitans y Fusobacterium nuc/eatum.

1. 1 Aislamiento desde saliva y placa dental de personas sanas y pacientes con

periodontitis.
1.2 Aislamiento desde aguas residuales de sillones dentales y centros odontológicos.
1.3 Determinación de la especificidad de hospedero de los bacteriófagos

2. Caracterización de los virus aislados.

2.1 Caracterización estructural a través de microscopía electrónica

2.2 Caracterización genética: Determinación del tipo de material genético, tamaño y
posibles secuencias.
2.3 Caracterización del crecimiento: Determinación de la tasa de adsorción, período de
eclipse, período de latencia, período de auge y burst size

3. Transformación de los bacteriófagos lisógenos a bacteriófagos líticos.

3.1 Mutación al azar mediante luz UV y obtención de placas lisis limpias

4. Evaluación in vitro de la actividad de los fagos sobre los patógenos

periodontales:

4.1 Formando biopelículas simples compuestas por A. actinomycetemcomitans o

F. nuc/eatum.
4.2 Formando biopelículas mixtas generadas a partir de muestras de saliva.

14
 MATER IALES Y MÉTODOS

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Reactivos.
Acetato de sodio (AplliChem , Biochemica Chemica Synthesis Services)
Ácido clorhídrico (Merck)
Ácido nalidíxico (Sigma Chemical Co.)
Acetato de amonio (Merck)
Agar-agar (Merck)
Agarosa (Lafken, Fermelo biotec e lnvitrogen Life Technologies)
0
Alcohol Etílico Absoluto Anhidro (96%, J.T Baker' ACS)
Alcohol etílico técnico (BioslabChile)
Alcohol lsopropílico (lsopropanol, Winkler LTOA)
Ampicilina (Sigma Chemical Co.)
AnaeroGen (Oxoid)
Arginina
Bacitracina (Sigma Chemical Co.)
Bromuro de etidio (Sigma Chemical Co.)
Carbonato de calcio (Merck)
Cisteína
Cloroformo-Alcohol iso-amílico 24:1 (Winkler LTOA)
Cloroformo (Winkler LTOA)
Cloramfenicol (Fiuka Biochemika)
Oimetil-sulfóxido (OMSO, Chemix)
ONA Ladder 1 Kb (promega Corporation y Bioslabs)
ONA Ladder 1 Kb plus (BiosForza)
ONA Ladder 100 pb (Bioslabs y BiosForza)
ONA Ladder t.JHindlll (BiosForza)
ONA ligasa T4 (lnvitrogen Life Technologies)
ONA polimerasa Taq (lnvitrogen Life Technologies, Bioslabs y BiosFoza)
ONAsa 1 (lnvitrogen Life Technologies y RBC Bioscience)
dNTP's (dTTP, dCTP, dATP,dGTP, lnvitrogen Life Technologies)
EOTA sal disódica (ácido etilendiaminotetraacético, Winkler LTOA)
Enzima de restricción BamHI (lnvitrogen Life Technologies)
Enzima de restricción Oral (Promega Corporation)

15
 MATERIALES Y MÉTODOS

Enzima de restricción EcoRI (Promega Corporation)

Enzima de restricción Hindlll (lnvitrogen Lite Technologies)
Enzima de restricción Kpnl (lnvitrogen Lite Technologies)
Enzima de restricción Pstl (lnvitrogen Lite Technologies)
Enzima de restricción Xbal (lnvitrogen Lite Technologies)
Enzima de restricción Xhol (lnvitrogen Lite Technologies)
Extracto de levadura (MercK)
Fenol saturado básico (Winkler LTOA)
Filtros 0,22 11m (Millipore)
Filtros 0,45 11m (Millipore)
Fosfato disódico (Merck)
Glucosa (Merck)
Hemina-Menadiona
Infusión cerebro-corazón (BHI, Oifco™, Becton and Oickinson Company)
KCI (Merck)
Microbiology Anaerocult® A mini (Merck)
Microbiology Anaerocult® P (Merck)
MgCI 2 (RBC BiosCience)
MgS0 4 x 7H 20 (Merck)
NaCI (Merck)
Na2HC04 (LabTec)
Placas poliestireno multipocillo (Orange LTOA)
PEG 6000 (polietilenglicol, Calbiochem)
Peptona de caseína (Merck)
Proteinasa K (Sigma Chemical Co.)
RNAsa 1 (lnvitrogen Lite Technologies)
Sangre de cordero
SOS (dodecil sulfato de sodio, Winkler LTOA)
Suero de caballo (Hyclone)
Suero fetal bovino (Hyclone)
Tampón TAE 50% (Tris-Ácido acético-EOTA, Winkler LTOA)
Tripticasa de soya (Oifco™, Becton and Oickinson Company)
Urea (Winkler LTOA)

16
 MATERIALES Y MÉTODOS

Vancomicina (Sigma Chemical Co.)

Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega Corporation)
Wizard® SV Gel and PCR clean-up system (Promega Corporation)

2.2 Medios de cultivo

- Caldo Brain Heart lnfusion (BHI): 3,7% Brain Heart lnfusion. Disolver en agua bidestilada y
esterilizar en autoclave por 20 min.
- Agar BHI: 3,7% Brain Heart lnfusion y 1,5% Agar-agar. Disolver en agua bidestilada,
esterilizar en autoclave por 20 min.
-Caldo CMT
a) Preparar CMT-1 (2X): 1% Peptona y 1% extracto de levadura. Disolver en agua
bidestilada, esterilizar en autoclave por 20 min.
b) Preparar CMT-2 (20X): 0,8% Fosfato disódico, 5% Carbonato de calcio, O, 12% Urea y 5%
KCI. Disolver en agua bidestilada, esterilizar en autoclave por 20 min.
e) Preparar CMT-3 (20X): 4% Glucosa, 0,35% Arginina y 1% Cisteína. Disolver en agua
bidestilada y esterilizar por filtración (filtro 0,22 ¡.tm)
Para la preparación de 100 ml de CMT se deben mezclar
50 ml de CMT-1
5 ml de CMT-2
5 ml de CMT-3
5 ml de suero fetal bovino o equino
1 ml de hemina menadiona
34 ml de agua
- Caldo Luria: 1% Triptona, 0,5% Extracto de levadura y 0,5% Cloruro de sodio. Disolver en
agua bidestilada y esterilizar en autoclave por 20 min.
- Agar Luria: 1% Triptona, 0,5% Extracto de levadura, 0,5% Cloruro de sodio y 1,5% Agar-
agar. Disolver en agua bidestilada, esterilizar en autoclave por 20 min.
- Agar CVE: 1% Tripticasa, 0,5% Extracto de levadura, 0,5% Cloruro de Sodio y 1,5% Agar-
agar. Disolver en 94 ml de agua bidestilada y esterilizar en autoclave por 20 min.
Posteriormente agregar Glucosa (0,2%), L-Triptófano (0,02%), Sangre (5%), Eritromicina (4
¡Jg/ml) y Cristal Violeta (5 ¡Jg/ml).

17
 MATERIALES Y MÉTODOS

- Agar TSVB: 4% Tripticasa, O, 1 % extracto de levadura y 1,5% Agar-agar. Disolver en 90 ml

de agua bidestilada y esterilizar en autoclave por 20 min. Posteriormente agregar Bacitracina
(75 ¡..tg/ml), Vancomicina (5 ¡..tg/ml) y Suero de caballo (1 0%).

2.3 Antibióticos
Los antibióticos se usaron a las siguientes concentraciones finales: Ampicilina 100 ¡Jg/ml,
Cloramfenicol 20 ¡Jg/ml, Kanamicina 50 ¡Jg/ml, Ácido Nalidíxico 15 ¡Jg/ml.
Todos los antibióticos utilizados fueron preparados en agua bidestilada, a excepción de
Cloranfenicol el cual fue disuelto en Alcohol absoluto (alcohol etílico al 96%)

2.4. Soluciones
-Solución Na 2 HP0 4 1 M: Agregar 26,8 g de Fosfato de sodio dibásico ?-Hidrato y luego
completar con agua bidestilada hasta 100 m l. Esterilizar en autoclave por 20 min. Mantener a
temperatura ambiente.
-Solución NaH 2 P0 4 1 M: Agregar 13,79 g de Fosfato monobásico de sodio 1-Hidrato y luego
completar con agua bidestilada hasta 100 m l. Esterilizar en autoclave por 20 min. Mantener a
temperatura ambiente.
- Solución de glucosa: 20% Glucosa. Esterilizar por filtración. Mantener a 4°C.
- Solución de SDS: 10% Dodecilsulfato de sodio. Esterilizar en autoclave por 20 min. Mantener
a3rc.
-Solución de EDTA 0,5 M: Agregar 18,6 g de Na 2 EDTA x 2 H20, disolver en 70 ml de agua
bidestilada usando un agitador magnético. Ajustar a pH 8,0 con una solución de NaOH 1O M.
Completar 100 ml de solución con agua bidestilada y esterilizar en autoclave por 20 min.
Mantener a 4 oc.
-Tris EDTA (TE): Tris-HCI 10 mM; pH 8,0 y EDTA 1 mM. Esterilizar en autoclave por 20 min.
Mantener a 4°C.
-Tampón TAE: Tris-acetato 40 mM; pH 8,0 y EDTA 1 mM. Esterilizar en autoclave por 20 min.
Mantener a 4 oc.
- Tampón de carga para electroforesis de DNA en geles de agarosa (Biue 11, 6x): 25 ml de
Glicerol 100%, 5 ml de EDTA 0,5 M, 50 mg de Xilene cyanol, 75 mg de Azul de bromofenol y
20 ml Agua bidestilada.

18
 MATERIALES Y MÉTODOS

2.5 Cepas Bacterianas

Tabla 1. Cepas bacterianas utilizadas en este estudio.

Cepas Genotipo/Fenotipo relevante Fuente

Gram negativo de la cavidad oral
A. actinomycetemcomitans Cepas clínicas
PAA002 Serotipo b Este trabajo
PAA005 Serotipo b Este trabajo
SAA002 Serotipo b Este trabajo
PAA001 Serotipo e Este trabajo
PAA003 Serotipo e Este trabajo
PAA004 Serotipo e Este trabajo
Fusobacterium nucleatum A TCC 25586 Cepa de referencia ATCC
F. nuc/eatum subsp. nuc/eatum Cepa clínica Este trabajo
F. nuc/eatum subsp. polymorphum Cepa clínica Este trabajo
Fusobacterium necrophorum ATCC 25286 Cepa de referencia ATCC
Bacteroides vulgatus ATCC 8482 Cepa de referencia ATCC
Bacteroides ureolyticus Cepa clínica Este trabajo
Porphyromonas gingivalis A TCC 33277 Cepa de referencia ATCC
Porphyromonas gingivalis Cepa clínica Este trabajo
Porphyromonas endodontalis Cepa clínica Este trabajo
Prevotel/a intermedia Cepa clínica Este trabajo
Prevotel/a nigrescens Cepa clínica Este trabajo
Gram positivo de la cavidad oral
Streptococcus mutans ATCC25175 Cepa de referencia ATCC
Streptococcus sanguinis Cepa clínica Este trabajo
Propionibacterium acnes (4) Cepa clínica Este trabajo
Actinomyces naeslundii Cepa clínica Este trabajo
Eubacterium limosun Cepa clínica Este trabajo
Eubacterium /entum Cepa clínica Este trabajo
Otros Gram positivo
Streptococcus pyogenes Cepa clínica ISP
Streptococcus aga/actiae Cepa clínica ISP
Staphy/ococcus aureus A TCC 43330 Cepa de referencia ATCC
Staphy/ococcus aureus Cepa clínica ISP
Staphylococcus epidermidis Cepa clínica Este trabajo
Staphy/ococcus epidermidis ATCC 14 990 Cepa de referencia ATCC

19
 MATERIALES Y MÉTODOS

Otros Gram negativo

Escherichia co/i Cepa clínica ISP
Salmonel/a enterica sv. Typhi Cepa clínica ISP
Salmonella Typhimurium Cepa clínica ISP
Proteus vu/garis Cepa clínica ISP
Proteus mirabilis Cepa clínica ISP
Klebsiella pneumoniae Cepa clínica ISP
Klebsiella oxytoca Cepa clínica ISP
E. co/i DHSa F- ~80 lacZ M15 endA recA Stock del
hsdR(r-K m-K) supE thi gyrA reiA laboratorio

~(lacZYA-argF )U169
PAAOOS ANr Cepa clínica, serotipo b, Este estudio
espontáneamente resistente a
ácido nalidíxico
ISP, Instituto de Salud Pública de Chile

2.6 Plásmidos
pGEM-T easy: Vector de clonamiento comercial (Promega) de alto número de copias que
posee el gen bla como marcador de selección (¡3-lactamasa; resistencia a ampicilina). Además,
posee un sitio de múltiple clonamiento dentro de un fragmento del gen /acZ, lo que permite
seleccionar clones por a-complementación en la cepa adecuada de E. coli o S. Typhi. Por
último, posee un promotor que es inducible por IPTG.
pSU19: Vector de clonamiento de bajo número de copias, generado a partir de los vectores
pACYC184 y pUC19. Este plásmido posee el gen cat como marcador de selección
(cloranfenicol acetiltransferasa; resistencia a cloranfenicol) y un sitio de múltlipe clonamiento
dentro de un fragmento del gen /acZ, lo que permite seleccionar clones por alfa-
complementación (Suh y Escalante-Semerena, 1993).

20
 MATERIALES Y MÉTODOS

2.7 Partidores

Tabla 2. Partidores utilizados en este estudio

Secuencia Tamaño
Nombre Blanco Referencia
(5' - 3') (pb)

Pgin-1 16S rDNA Porphyromonas TGTAGATGACTGAAAACC

197
Pgin-2 gingivalis ACGTCATCCCCACCTTCCTC Tran & Rudney,

Aa-1 16S rDNA Aggregatibaeter ATTGGGGTTTAGCCCTGGTG 1999

360
Aa-2 aetinomyeetemeomitans ACGTCATCCCCACCTTCCTC

Fspp-1 16S rDNA Fusobaeterium GGATTTATTGGGCGTAAAGC Boutaga y cols,

167
Fspp-2 nue/eatum GGCATTCCTACAAATATCTACGAA 2005

P14 Antígeno O (serotipo b) AAAACTTTTCTTCGGGAATG

P11 A. aetinomyeetemeomitans TCTCCACCATTTTTGAGTGG 333

Kaplan y cols,
P14 Antígeno O (serotipo e) AAAACTTTTCTTCGGGAATG
2001
P12 A. aetinomyeetemeomitans GAAACCACTTCTATTTCTCC 268

Partidores diseñados para

la secuenciación de

M13F insertos clonados en los GTTTTCCCAGTCACGAC

vectores M13 y plásmidos

pUC. Estos partidores

Messing 1983
también pueden ser

utilizados para la
M13R secuenciación de otros CAGGAAACAGCTATGAC

plásmidos que contienen

JaeZ como pGEM.

FragA-F Partidores diseñados para GAAAGCCGCCCGAGAGCGTT

FragA-R amplificar secuencia del 390 Este trabajo

CCGCGACGCTCATCAACGGA
fago Aa~01 (Fragmento A)

21
 MATERIALES Y MÉTODOS

2.8 Condiciones de cultivo.

A. actinomycetemcomitans se cultivó en medio Brain Heart lnfusion (BHI, 37 g/L) a 3rC en
capnofilia (atmósfera de 5% de C0 2 ). Las bacterias de la cavidad oral (Tabla 1), exceptuando
A. actinomycetemcomitans, se cultivaron en medio Tripticasa de Soya (TS, 30 g/L) o BHI
suplementado con 5% de sangre de cordero y 1% de Hemina-menadiona (H-M) a 3rc en
condiciones anaerobias (Kuboniwa y cols., 2009). El resto de las bacterias Gram positivo y
negativo utilizadas en este estudio (Tabla 1) se cultivaron en medio BHI a 3rC en aerobiosis.
Los cultivos en medio sólido se llevaron a cabo en los mismos medios base conteniendo 15 g/L
ó 8 g/L (agar semi-sólido) de Bacto agar. Los antibióticos se utilizaron a las siguientes
concentraciones finales: ampicilina (Amp) 100 ¡.tg/mL, kanamicina (Kan) 50 ¡.tg/mL, cloranfenicol
(Cam) 20 ¡.tg/mL, ácido nalidíxico (Nal) 15 ¡.tg/mL.

2.9 Aislamiento y caracterización de los bacteriófagos

2.9.1 Propagación, aislamiento y caracterización de los Bacteriófagos
Las posibles partículas virales se propagaron desde muestras de saliva provenientes de
personas sanas y enfermas. Además se recolectaron las aguas residuales de los escupideros
de los sillones dentales de la Clínica Odontológica de la Universidad Andrés Bello y del Hospital
Barros Luco. Todas estas muestras fueron centrifugadas a 10.000 x g durante 15 m in y
posteriormente filtradas con filtro 0,45 ¡.tm (Millipore Corp., Bedford, Mass). 2 mL de las
muestras filtradas se adicionaron a 20 mL de en un cultivo de las distintas cepas hospederas
(F. nucleatum, A. actinomycetemcomitans o P. gingivalis) a una densidad óptica (OD) de O, 15 -
0,2. Luego de 24 h de cultivo se centrifugó a 10.000 x g durante 15 min y el sobrenadante
nuevamente se filtró con filtro de 0,45 ¡.tm. A esta suspensión se le denominó lisado. Con el fin
de determinar si ellisado contenía partículas virales se realizó un spot-test sobre un césped de
las cepas indicadoras según está descrito previamente por Chang y cols. (2005). Brevemente,
las distintas cepas se cultivaron en las condiciones antes mencionadas durante toda la noche
(0/N) . 1 mL de este cultivo se mezcló con 7 mL de agar semi-sólido (0,8% agar) y se vertió
sobre una placa de BHI. Una gota de 5 ¡.tL del lisado se depositó sobre la placa y se incubó
durante 24 a 48 h. La sensibilidad de la bacteria se determinó por la aparición de una zona libre
de crecimiento.

22
 MATERIALES Y MÉTODOS

2.9.2 Titulación de los bacteriófagos

El lisado obtenido anteriormente se diluyó en dilución decimal en agua destilada estéril y 5
11L de cada dilución se plaquearon sobre un césped de la bacteria sensible. El número de
placas de lisis (UFP) se contó luego de la incubación y se clasificaron de acuerdo al grado de
claridad en turbias o limpias. Las placas de lisis se extrajeron del agar semi-sólido y se
propagaron.
UFP/mL= UFP x Factor de dilución x 1000 u.L
Volumen plaqueado (¡1L)

2.9.3 Rango de hospedero

Para determinar el rango de hospedero de los bacteriófagos aislados se realizaron césped
en agar semi-sólido de las distintas bacterias utilizadas en este estudio (Tabla 1). Sobre el
césped formado se depositó una gota de 5 ¡1L de los lisados y se incubó durante 24-48 h en
anaerobiosis, aerobiosis o capnofilia, según corresponda. El resultado se consideró positivo
cuando se generó una zona de inhibición del crecimiento.

2.9.4 Purificación de las partículas virales

La purificación se llevó a cabo según el protocolo establecido por Machuca y cols. (201 0).
Aproximadamente 100 mL de un lisado con titulo de 1 x 108 UFP/mL se centrifugó a 3.500 x g
durante 20 min a 4°C (Sorvall RC 5C, rotor SS34). El sobrenadante se filtró a través de un filtro
de 0,45 11m y posteriormente se ultracentrifugó a 30.000 x g durante 3 h a 4°C (Sorvall RC 90,
rotor AH-629/17) . Finalmente el sedimento se resuspendió en agua bidestilada y se guardó a
4°C hasta su uso.

2.9.5 Microscopia electrónica

50 mL del lisado se precipitaron en ultracentrifuga Sorvall RC 90 utilizando el rotor AH-
629/17 a 30.000 x g durante 3 h. El sobrenadante se eliminó y el sedimento se resuspendió en
5 ¡1L de agua bidestilada. Una gota de la suspensión de bacteriófagos se fijó en glutaraldehído
2,5% a temperatura ambiente durante 20 min. Esta suspensión se dispuso sobre una grilla
cubierta con parlodion/carbón y se dejó durante 60 s. Luego se colocó una gota de acetato de
uranilo al 2% acuoso y se dejó actuar durante 60 s. Una vez seca la grilla se observó en
microscopio electrónico de transmisión Philips Tecnai 12 BioTwin a 80 kV.

23
 MATERIALES Y MÉTODOS

2.9.6 Mutagénesis de las partículas virales

Una suspensión de los bacteriófagos en tampón fostato pH 7,2 se expuso a la luz UV (260
nm) desde una ampolleta germicida de 15-W durante 15 min (Tessman, 1985). Luego del
tratamiento con luz UV se realizaron diluciones seriadas de la suspensión en agua bidestilada y
100 ¡..tL de cada dilución se plaqueó sobre un césped de la bacteria sensible. Las placas de lisis
limpias se seleccionaron y propagaron tal como fue descrito anteriormente.

2.9. 7 Ensayo reversión

En placas de BHI se plaqueron 200 ¡..tL de los distintos fagos a una concentración 1O veces
mayor que las bacterias. Sobre este césped bacteriano se sembraron entre 1x1 06 y 1x1 08
UFC/m y se incubo durante 24 ó 48 h para permitir una tasa de replicación bacteriana. La
probabilidad de encontrar una cepa resistente se calculó en base a las colonias obtenidas
luego de la incubación en relación a las UFC plaqueadas.

2.9.8 Curvas de crecimiento

A partir de un cultivo 0/N se realizó una dilución 1:200 de las bacterias. El crecimiento
bacteriano se midió a través de espectrofotometría a una densidad óptica de 600 nm (00 600 )
cada 1 h. Cuando el cultivo se encontraba en la fase exponencial temprana (00 600 O, 15-0,2) se
infectó con los fagos en una multiplicidad de infección (MOl) de aproximadamente 0,01
(UFC:UFP).

2.9.9 Ensayo de adsorción

El ensayo se realizó según el protocolo descrito por Sillankorva y cols (2008), con algunas
modificaciones. Un cultivo bacteriano en fase exponencial temprana (00600 O, 15-0,2) se infectó
con una suspensión de fagos en una relación de 1:100 (MOl de 0,01 ). La mezcla se incubó a
temperatura ambiente y cada 1 min se tomó una muestra de 100 ¡..tL. Las muestras se trataron
con cloroformo, se centrifugaron a 10.000 x g durante 3 min y luego se diluyeron y plaquearon
sobre un césped de la bacteria sensible. Luego de la incubación se realizó un recuento de
UFP/mL.
La tasa de adsorción se calculó con la fórmula establecida por Barry y Goebel en el año 1951
k= (2.303 logP 0/P)/t(B)
Donde P0 = concentración inicial fagos; P= concentración final fagos
t= tiempo; 8= concentración de bacterias
24
 MATERIALES Y MÉTODOS

2.9.10 One Step Growth

El ensayo se realizó según el protocolo descrito por Sillankorva y cols. (2008), con algunas
modificaciones. Para determinar el período de latencia, período de eclipse, período de auge y
el burst size, un cultivo bacteriano en fase exponencial temprana (00 600 O, 15-0,2) se infectó
con una suspensión de fagos en una relación de 1:100 (MOl de 0,01 ). Esta mezcla se incubó
durante 5 min a temperatura ambiente para permitir la adsorción del fago. Luego de la
incubación se tomaron dos muestras, las primeras se plaquearon inmediatamente sobre un
césped de la bacteria sensible, mientras que las segundas fueron previamente tratadas con
cloroformo al 1% (vol/vol) para permitir la liberación de los fagos que aún se encontraban en el
intracelular. Las UFP/mL se determinaron a través de diluciones seriadas.

El burst size (b) se calculó de la siguiente forma:

b= Concentración fagos finales
Concentración bacterias

2.9.11 Estabilidad de los bacteriófagos

La estabilidad de los fagos se evaluó en diferentes condiciones. Para evaluar la resistencia
a la temperatura, los distintos fagos se incubaron a -20, 4, 25 y 37°C durante 1, 1O, 20, 30 y 40
días. Para evaluar la resistencia a cloroformo, los fagos se incubaron a diferentes
concentraciones (1, 5 y 10%) durante 5 minutos. De la misma forma los fagos fueron sometidos
a agitación por vortex durante 1 y 3 min. Para determinar la estabilidad de los fagos a la saliva,
está se obtuvo a partir de un voluntario y se esterilizó por filtración (filtro de 0,22 ¡.¡.m). Luego se
incubaron en dos concentraciones de saliva (50 y 90%) durante 5 min. Para determinar la
estabilidad de los fagos al pH, el lisado se incubó en una solución 200 mM en
NaHP0 4/NaH2P0 4 a pH 5,5- 6- 6,5- 7- 7,5 u 8. En todos los casos ellisado sin el tratamiento
sirvió como control. Luego de cada una de las incubaciones se determinó el número de
UFP/ml. Los resultados están expresados de la siguiente forma:

% estabilidad= UFP luego de la incubación x 100

UFP antes de la incubación

25
 MATERIALES Y MÉTODOS

2.9.12 Ensayo de exopolisacaridasa

Con el fin de separar las enzimas solubles del fago de las partículas virales, el lisado se
ultracentrifugó a 100.000 x g durante 3 h a 4°C en ultracentrífuga Sorvall RC 90 con rotor AH-
629/17 (Hughes y cols., 1998) Para determinar si los fagos poseen la actividad
exopolisacaridasa , 5 J.!L del sobrenadante se plaquearon sobre un césped de la bacteria
sensible.

2.10 Técn icas de biología molecular.

2.1 0.1 Extracción de DNA cromosoma! bacteriano.
Las cepas se cultivaron en 5 mL de BHI o en BHI suplementado con suero fetal bovino y
Hemina/Menadiona, según corresponda, durante 24-48 h a 37°C en anaerobiosis o capnofilia.
Se centrifugó 3 mL del cultivo por 5 min a 16.000 x g en una microcentrífuga Eppendorf
Centrifuge 5415R. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento se lavó 3 veces con 1 mL de
agua estéril. Luego de los lavados el sedimento se resuspendió en 350 11L de buffer TE (Tris-
HCI 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM) y se agregó 40 J.!L de SOS 10% y 10 11L de proteinasa K (10
mg/mL). La mezcla se agitó suavemente y se incubó por 1 h a 60 °C. Luego se agregó %
volumen de cloroformo:alcohol isoamílico (24: 1) y % volumen de fenol saturado básico. Se
agitó vigorosamente hasta obtener una emulsión y se centrifugó 20 min a 16.000 x g a
temperatura ambiente. La fase acuosa (superior) se transfirió a un tubo limpio y el DNA
cromosoma! se precipitó agregando 0,5 volúmenes de Acetato de Amonio 7,5 M y 2,5
volúmenes de etanol absoluto frío. Se agitó por inversión hasta la aparición del precipitado y se
dejó durante 20 mina -20 °C. Se centrifugó 15 mina 16.000 x g y se descartó el sobrenadante.
El precipitado se lavó con 500 11L de etanol 70% frío, se centrifugó por 5 min a 16.000 x g, se
eliminó el sobrenadante y se dejó secar a temperatura ambiente. Finalmente, el DNA se
resuspendió en 50 11L de H2 0 destilada estéril y se mantuvo a 4°C hasta su uso.

2.10.2 Identificación bacteriana mediante PCR

La identificación bacteriana se realizó primero por tinción Gram y luego por PCR con
partidores específicos descritos en la tabla 2.

26
 MATERIALES Y MÉTODOS

Tabla 3. Protocolo utilizado para la reacción de PCR

Reactivo Volumen

Buffer de PCR 1OX 2,0 ).!L

MgC1z25 mM 1,2 ).!L

dNTP's 10 mM 0,4 ).!L

Partidor 1 (25 mM) 0,2 ).!L

Partidor 2 (25 mM) 0,2 ).!L

Templado 1,0 ).!L

HzOd 14,9 ).!L

DNA polimerasa Taq (5 U/).!L) O, 1 ).!L

El programa utilizado para determinar la especie fue: denaturación inicial de 5 min a 94°C;
35 ciclos de 94 oc por 30 s, ssoc por 30 s y 72°C por 30 s; y una extensión final a 72°C por 1O
min. El programa utilizado para determinar el serotipo fue: denaturación inicial de 5 min a
94°C; 35 ciclos de 94°C por 30 s, sooc por 30 s y 72°C por 30 s; y una extensión final a 72°C
por 10 min.

2.1 0.3 Extracción de material genético viral.

El DNA del fago se aisló a partir de 1O mL de lisado. A este volumen se le agregaron 1O ).!L
de DNasa 1 (10 mg/mL) y se incubó durante 30 mina 37 oc. Luego se agregó 4 mL de solución
precipitante (NaCI 3.3 M y PEG 6000 0.055 M) y se incubó en hielo durante 1 h. Se centrifugó a
10.000 x g durante 1O min a 4 oc y se descartó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió
en 600 ).!L de solución CSM (NaCI 0.1 M, MgS04 7H 2 0 8 mM, Tris 0,05 M pH 7,5 y 0,01%
gelatina). Luego se agregó un volumen de Fenoi:Cioroformo:Aicohol lsoamílico (3: 1 :0,05) y se
centrifugó a 16.000 x g por 1O m in. El DNA contenido en la fase acuosa se precipitó con un
volumen de isopropanol y se incubó a -80 oc durante 15 min. Luego se centrifugó a 16.000 xg
durante 1O m in y se descartó el sobrenadante. El precipitado se lavó con 500 ).!L de etanol 70%
frío, se centrifugó por 5 min a 16.000 x g, se eliminó el sobrenadante y se dejó secar a
temperatura ambiente. Finalmente, el DNA se resuspendió en 50 ).!L de H2 0 destilada estéril y
se mantuvo a 4°C hasta su uso. El DNA del fago se resolvió en un gel de agarosa al 0,7% en
bufferTAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA), teñido con bromuro de etidio y visualizado bajo
luz UV.
27
 MATERIALES Y MÉTODOS

2.10.6 Extracción de DNA plasmidal.

Las cepas se cultivaron en 5 mL de BHI, suplementado con el antibiótico que corresponda,
durante toda la noche a 37°C con agitación. Se centrifugó 3 mL de cultivo a 16.000 x g por 5
min. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento se lavó 3 veces con 1 mL de agua. Luego de
los lavados el sedimento se resuspendió en 100 ¡..tL de solución de lisis estéril (Tris-HCI 25 mM
pH 8,0, EDTA 1O mM, Glucosa 50 mM). Después de incubar 5 min a temperatura ambiente se
agregó 200 ¡..tL de solución desnaturante (NaOH 0,2 N, SOS 1%) preparada en el momento, se
mezcló suavemente y dejó en hielo durante 1O min. Luego se agregó 150 ¡..tL de Acetato de
Potasio (7,5 M y pH 4,8) y se mezcló por inversión. Se dejó en hielo por 10 min. Se centrifugó
1O min a 16.000 x g y se recuperó 300 ¡..tL del sobrenadante. A continuación se agregó %
volumen de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y % volumen de fenol saturado básico. Se
agitó vigorosamente hasta obtener una emulsión y se centrifugó 15 min a 16.000 x g a
temperatura ambiente. La fase acuosa (superior) se transfirió a un tubo limpio. El DNA
plasmidal se precipitó con 0,5 volúmenes de Acetato de Amonio 7,5 M y 2,5 volúmenes de
etanol frío por 20 min a -20 °C. Luego, se centrifugó por 15 min a 16.000 x g, se eliminó el
sobrenadante y se lavó el precipitado con 500 ¡..tL de etanol 70% frío. Se centrifugó 5 min a
16.000 x g, se descartó el sobrenadante y se dejó secar a temperatura ambiente. Finalmente el
DNA plasmidal se resuspendió en 50 ¡..tL de H20 bidestilada estéril y se mantuvo a 4°C hasta su
uso.

2.1 0.5 Ensayo de restricción

Para el ensayo de restricción el DNA del fago fue digerido con las siguientes enzimas:
EcoRI, Xba l, Pstl, Kpnl, Oral, BamHI, Hindll l y Sau3AI. La mezcla de digestión se incubó
durante 3 h a 37°C. Luego de la incubación el patrón de restricción se visualizó en gel de
agarosa al 0,7% utilizando el marcador de masa molecular 1 Kb DNA ladder y Lambda/Hindlll
marker. El protocolo utilizado fue el siguiente: 6,5 ¡..tL de Agua libre de nucleasas, 1,O ¡..tL de
Buffer enzima 10X, 0,5 ¡..tL Enzima (10 U/¡..tL) y 2,0 ¡..tL del DNA del fago (200 ng/¡..tL
aproximadamente).

2.1 0.6 Clonamiento.

El DNA del fago digerido anteriormente se clonó en el vector de clonamiento pSU19 (Suh y
Escalante-Semerena, 1993) o pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega). La mezcla de
ligación fue la siguiente: 5 ¡..tL Buffer enzima 2X, 1 ¡..tL T4 DNA Ligasa (10 Uf¡..tL), 3 ¡..tL DNA fago
28
 MATERIALES Y MÉTODOS

(60 ng aproximadamente) y 1 ¡.¡.L Plásmido (20 ng aproximadamente). Esta mezcla se incubó

0/N a temperatura ambiente.
Luego de la incubación esta mezcla se dializó con filtro de 0,045 ¡.¡.m y se electroporó en la
cepa DH5a. Los clones se seleccionaron en placas con cloramfenicol (20 ¡.¡.g/¡.¡.L) o ampicilina
(1 00 ¡.¡.g/¡.¡.L) si se utilizó el vector pSU19 o pGEM®-T Easy, respectivamente. Los distintos
clones obtenidos se sometieron a una extracción de plásmido con el kit Wizard® Plus SV
Minipreps (Promega) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los clones seleccionados
para su secuenciación se escogieron por su patrón de migración y ensayo de restricción en gel
de agarosa al O, 7%.

2.1 O. 7 Secuenciación
La secuenciación parcial se llevó a cabo con terminadores dideoxinucleótidos marcados por
fluorescencia utilizando el kit ABI PRISM big Oye terminator cycle sequencing ready reaction
(Applied Biosystems, Foster City, California) y 5 pmol de los partidores M13 forward y M13
reverse, junto con 0,2 ng de DNA del plásmido. Las secuencias de nucleótidos fueron
analizados con el analizador genético ABI PRISM 310 (Applied Biosystems). Las secuencias
generadas fueron reunidos y editadas electrónicamente con los programas ALIGN, EDITSEQ y
Megalign programa (DNASTAR, Madison, Wisconsin).
La secuencia completa del fago fue obtenida por secuenciación masiva utilizando el sistema
de pirosecuenciación 454. En este sistema segmentos del DNA del fago son amplificados y
capturados en pequeñas cuentas. Estas cuentas son cargadas luego en un placa (PicoTiter™),
en estas placas ocurre la reacción de amplificación del segmento de DNA gracias a la DNA
polimerasa. El pirofosfato liberado se convierte en luz a través de un proceso enzimático
mediado por la enzima luciferasa. Las señales luminosas son proporcionales al número de
nucleótidos incorporados en un flujo y están representados en diagramas de flujo.
Posteriormente el software Amplicon Variant Analyzer-454 LifeSciences-Roche es utilizado
para alinear todas las secuencias leídas.
Los resultados obtenidos en ambas secuenciaciones se compararon con la base de datos
pública BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov).

2.1 0.8 Electroforesis en geles de agarosa.

Los geles se prepararon usando agarosa a concentraciones entre 0,8% y 1% en buffer TAE
(Tris-acetato 40 mM pH 8,0, EDTA 1 mM). Las muestras de DNA a analizar se mezclaron con
29
 MATERIALES Y MÉTODOS

el volumen adecuado de buffer Blue 11 6X antes de ser cargadas en el gel. La electroforesis se

realizó a 100 V constantes y luego el gel se tiñó por 5 min en una solución de bromuro de etidio
(5 1-lg/mL). Las bandas de DNA se visualizaron y se fotografiaron sobre un transiluminador UV
(FOTODYNE, FOTO/Phoresis UV Transilluminator).

2.11 Análisis bioinformático.

Los distintos análisis computacionales para realizar las predicciones bioinformáticas se
realizaron a través de los programas que se describen en la tabla 4.

Tabla 4. Programas Bioinformáticos utilizados en este estudio

Nombre Dirección web

BLAST
(Basic Local Alignment http://www.ncbi. nih.gov/BLAST1
Sequence Tool)
ClustaiW www.ebi.ac.uk/clustalw/
ORF Finder www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/
Pfam http://pfam.sanger.ac.uk/
KEEG (Kyoto http://www.genome.jp/kegg/
Encyclopedia of Genes
and Genomes)

2.12 Formación y cuantificación de biopelículas

2.12.1 Saliva estéri l.
Se recolectó saliva de personas periodontalmente sanas y se centrifugó por 1O m in a 6000
rpm. Se recuperó el sobrenadante y se incubó con DTT 2,5 mM a temperatura ambiente por 1O
min. Luego de la incubación, se ultracentrifugó a 18700 rpm por 20 min. Se recuperó el
sobrenadante y se esterilizó por filtración (filtro 0,22 IJm). Se almaceno a -20°C hasta su
utilización.

2.12.2 Formación y cuantificación de biopelícula en placas de cu ltivo de 96 pocillos

Para el desarrollo de la biopelícula, las placas de cultivo de 96 pocillos de fondo plano
(Cellstar® Greiner Bio One, Germany) se inocularon con 200 ~-tL de una dilución 1:100 de un
cultivo 0/N de la bacteria. La placa se incubó en anaerobiosis o en capnofilia según fue el caso.
30
 MATERIALES Y MÉTODOS

Luego del tiempo de incubación el sobrenadante del cultivo se removió y la placa se lavó con
200 f.LL de agua destilada. La biopelícula contenida en las placas se tiñó con cristal violeta al
0,01% por 15 min y luego se lavó dos veces con agua destilada. La cantidad de biopelícula se
cuantificó agregándole 200 f.LL etanol 95% por cada pocillo e incubándolo por 5 min para
solubilizar el cristal violeta . El etanol se transfirió a una nueva placa de cultivo de 96 pocillos y
se cuantificó midiendo su absorbancia a 595 nm con un lector de placa (SQ-2800 model
spectrophotometer, United Products & lnstruments lnc., Dayton, USA) (Davey, 2006; Sedlacek
y Walker, 2007). Adicionalmente, se cuantificó el número de células viables en cada ensayo a
través de recuento en placa de unidades formadoras de colonias (UFC).
Cuando fue necesario la placa de poliestireno fue previamente recubierta con 10 f.LL de
saliva estéril sin diluir.

Tinción Cristal Violeta Solubilización colorante

y lectura (Abs 595nm)
Cultivo biopelícula

Figura 1: Esquema de protocolo de cuantificación de biopelícula con cristal violeta.

2.12.3 Determinación del MOl y ensayo de infección de la biopelícula

Luego de 24-48 h de formación de la biopelícula el medio de cultivo fue removido y se
agregó nuevo medio de cultivo conteniendo fagos en diferentes concentraciones (MOI's 2:1,
1:1, 1:10, 1:100, 1:1000 y 1:10000). 24 h post-infección se cuantificó las UFC/mL y la cantidad
de biopelícula tal como fue descrito anteriormente.
Para el ensayo de infección, luego de 24-48 h de formación de la biopelícula el medio de
cultivo fue removido y se agregó nuevo medio de cultivo conteniendo fagos en una razón de
1:100 (1 por cada 100 bacterias). 24 h post-infección la biopelícula se re-infectó con una
segunda dosis de fagos a la misma concentración. Luego de cada dosis se cuantificó las
UFC/mL y la cantidad de biopelícula. Además para determinar si las partículas virales se
propagaron al interior de la biopelícula, el sobrenadante se recuperó luego de la infección y se
determinó la tasa de propagación a través del recuento de UFP.

31
 MA TERIALES Y MÉTODOS

La tasa de supervivencia bacteriana se expresó en base al recuento de las bacterias post-

infección en relación a las UFC luego de 24 h de formación de la biopelícula (recuento inicial),
según la siguiente fórmu la:
% supervivencia= UFC/mL post-infección x 100
UFC/mL iniciales

2.12.4 Biopelículas mixtas

Para la generación de biopelículas mixtas se recolectó aproximadamente 5 mL de saliva de
una persona periodontalmente sana. Esta saliva fue recolectada en la mañana misma del
ensayo y se midieron parámetros como pH salival y capacidad tamponante con el fin de hacer
lo más reproducible el ensayo. Esta saliva fue inoculada en medio CMT (dilución 1:1 00) e
incubada por 48 h en anaerobiosis. Una dilución 1:100 de esta saliva propagada fue
nuevamente inoculada en medio CMT. Adicionalmente a este inoculo se inoculó una dilución
1:100 de un cultivo 0 /N de A. actinomycetemcomitans y F. nucleatum. 100 ¡.LL de este cultivo
fueron incubados en placas de poliestireno en anaerobiosis durante 48 h, luego de la
incubación se cuantificó la cantidad de biopelícula por absorbancia a 595nm y se realizó un
recuento de UFC en los medios selectivos CVE (F. nuc/eatum) y TSVB (A.
actinomycetemcomitans). Además con el fin .de establecer un número aproximado de las
especies cultivables presentes en esta biopelícula mixta se realizó un cultivo de la saliva diluida
en agar sangre Hemina-Menadiona en anaerobiosis durante 1 semana. Se analizó la
morfología macroscópica de la colonia y la morfología microscópica por medio de tinción Gram.

2.12.5 Microscopía Confoca l

Una biopelícula generada sobre cubreobjetos (22 x 22 mm) se tiñó con 5 ¡.LL de una dilución
1:1 de los marcadores loduro de propidio [30 IJM] y Syto9 [6 IJM] del kit LIVE/DEAD Baclight™
Bacteria! Viability L 13152 (Molecular Probes, lnvitrogen). Las muestras se observaron en un
microscopio confocal (FiuoView™ FV1000, Confocal laser scanning microscope, Olympus
Corporation) con el objetivo de 60X.

2.1 3 Análisis Estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa SPSS 17.0

32
 RESULTADOS

3. R ESULTADOS

3.1 Aislamiento de bacteriófagos para Fusobacterium nucleatum y Aggregatibacter

actinomycetemcomitans serotipo b.

Para el aislamiento de los distintos bacteriófagos se recolectaron muestras de saliva

de pacientes periodontalmente enfermos, personas sanas y aguas residuales de
hospitales y centros odontológicos. Estas muestras se filtraron para eliminar las bacterias
presentes y posteriormente se cultivaron en presencia de las bacterias hospederas para
permitir una propagación de las potenciales partículas virales. Las bacterias hospederas
utilizadas fueron: Porphyromonas gingivalis (complejo rojo), Fusobacterium nucleatum
(complejo naranjo) y Aggrebatibacter actinomycetemcomitans serotipo b.

A partir de una muestra de agua residual del centro odontológico de la Universidad

Andrés Bello se obtuvo una muestra positiva correspondiente a un bacteriófago para la
bacteria A. actinomycetemcomitans serotipo b. Éste se denominó Aab~01 (Figura 2A). El
bacteriófago Aab~01 presentó placas de lisis turbias de un tamaño de 0,5-1 mm de
diámetro (Figura 2B). De la misma forma a partir de una muestra de agua residual de
sillones dentales del Hospital Barros Luco se obtuvo una inhibición del crecimiento de la
bacteria F. nucleatum. A partir de esta muestra se realizó una dilución seriada para
determinar si la inhibición se debía a un bacteriófago u otro agente antimicrobiano. La
muestra resultó positiva en la obtención de placas de lisis por lo que el bacteriófago se
denominó Fnp~11 (Figura 3A). Este bacteriófago presentó placas de lisis limpias de 0,5-1
mm de diámetro (Figura 3B).

Ninguna de las 86 muestras analizadas dio resultados positivos para el patógeno

periodontal P. gingivalis.

33
 RESULTADOS

Figura 2: Búsqueda bacteriófagos A.

actinomycetemcomitans. A) Spot-test con
muestras obtenidas de saliva (1 -9) o aguas
residuales de sillones dentales (1 0-17) sobre un
agar semi-sólido (0,7%) de la cepa PAAOOS de A.
actinomycetemcomitans. Los números identifican
las diferentes muestras. B) Ensayo de placas de
lisis. La muestra número 13 se diluyó y plaqueó
sobre un agar semi-sólido de la cepa PAAOOS de
A. actinomycetemcomitans.

Figura 3: Búsqueda bacteriófagos F. nuc/eatum. A) Spot-test con muestras obtenidas de aguas

residuales de sillones dentales (1-9) o de muestras de saliva (1 0-1 9) sobre un agar semi-sólido
(0,7%) de Fusobacterium nucleatum. Los números identifican las diferentes muestras. B) Ensayo
de placas de lisis. La muestra número 4 se diluyó y plaqueó sobre un agar semi-sólido de la cepa
indicadoea F. nuc/eatum, observándose placas de lisis limpias correspondientes al fago Fnp~11.

34
 RESULTADOS

Debido a la existencia de lisógenos en A. actinomycetemcomitans (Haubek y cols,

1997; Resch y cols, 2004; Willi y cols, 1997), la primera aproximación fue determinar si
existía liberación de partículas virales desde las cepas de A. actinomycetemcomitans a
partir de la inducción con luz UV (302 nm). Ninguna de las cepas de A.
actinomycetemcomitans estudiadas liberó partículas virales infecciosas (Tabla 5),
indicando que Aab~01 no corresponde a la inducción de un lisógeno.

Tabla 5. Inducción lisógenos con luz UV en A. actinomycetemcomitans.

Cepa Se ro tipo Actividad lítica

post-inducción

PAA001 e Sin actividad

PAA002 b Sin actividad

PAA003 e Sin actividad

PAA004 e Sin actividad

PAA005 b Sin actividad

SAA002 b Sin actividad

3.1.2 Especificidad de hospedero de los bacteriófagos aislados

Todos los fagos aislados fueron evaluados en su rango de hospedero para determinar
si son fagos específicos o tienen un amplio espectro de infección. Para ello se infectó a
distintas bacterias de la flora oral, flora normal y cepas patógenas, encontrándose que el
fago Aab~01 es específico para A. actinomycetemcomitans serotipo b, serotipo con mayor
asociación con la manifestación clínica llamada periodontitis agresiva. En cambio los
fagos Fnp~11 y Fnn~107 son específicos para F. nucleatum. El fago Fnp~11 es efectivo
sobre todas las subespecies de F. nuc/eatum estudiadas, mientras que el fago Fnn~107

es efectivo solamente sobre la subespecie nuc/eatum (Tabla 6) lo que permitiría utilizarlo

en la fagotipificación de nuevas cepas. La presente tesis mostrará la caracterización del
fago y efectividad sobre la bacteria formando biopelículas de Fnp~11, ya que presenta
una mayor utilidad como posible como agente terapéutico.

35
 RESULTADOS

Tabla 6. Especificidad de hospedero de Aab$01 , Fnp$11 y Fnn$107.

Cepas Aabq,01 Fnpq,11 Fnnq,107

Gram negativas de la cavidad oral

A. actinomycetemcomitans serotipo b (3) +

A. actinomycetemcomitans serotipo e (3)
Fusobacterium nucleatum A TCC25586 + +
F. nuc/eatum subsp. nucleatum (3) + +
F. nuc/eatum subsp. polymorphum +
Fusobacterium necrophorum ATCC25286
Bacteroides vulgatus A TCC8482
Bacteroides ureolyticus
Porphyromonas gingiva/is A TCC33277
Porphyromonas gingivalis (3)
Porphyromonas endodontalis
Prevotella intermedia (3)
Prevote/Ja nigrescens (2)
Gram positivas de la cavidad oral
Streptococcus mutans ATCC25175
Streptococcus sanguinis
Propionibacterium acnes (4)
Actinomyces naes/undii
Eubacterium limosun
Eubacterium /entum
Otras Gram positivas
Streptococcus pyogenes (2)
Streptococcus aga/actiae (2)
Staphy/ococcus aureus ATCC43330
Staphy/ococcus aureus (2)
Staphylococcus epidermidis (3)
Staphy/ococcus epidermidis A TCC 14990
Otras Gram negativas
Escherichia co/i (2)
Sa/mone/Ja Typhimurium
Proteus vu/garis (2)
Proteus mirabilis (2)
Klebsie/Ja pneumoniae (2)
Klebsiella oxytoca (2)
+, indica inhibición del crecimiento
-, indica sin inhibición del crecimiento
(n), número de cepas ensayadas

36
 RESULTADOS

3.2 Caracterización de los virus ais lados.

3.2.1 Caracterización bacteriófagos Aabcj1 01 y Fnpcj1 11

3.2.1 .1 Caracte rización estructural Aabcj1 01 y Fnpcjl11

Los fagos fueron caracterizados según su estructura por medio de microscopía

electrónica. Aab~01 presentó una simetría binaria compuesta por una cabeza
icosahédrica de 50-60 nm y una cola filamentosa no contráctil de 150 nm de largo
aproximadamente (Figura 4A). La microscopía electrónica de Fnp~11 indicó que tiene una
simetría binaria. Fnp<j>11 tiene una cabeza icosahédrica de 77 nm y una cola filamentosa
de 55 nm (Figura 4C).

Figu ra 4: Microscopía Electrónica de Transmisión (MET). A) Se observa simetría binaria de

Aab~01 compuesta por cabeza icosahédrica y cola filamentosa. B) La flecha indica la posición de
la partícula viral infectando a A. actinomycetemcomitans. C) La flecha indica la posición de Fnp~11,
se observa la cabeza icosahédrica y una cola pequeña filamentosa. La barra horizontal indica la
escala en nanómetros.

3.2.1 .2 Caracterización genética Aabcj1 01

El genoma del fago se purificó y se trató con las enzimas DNasa 1 o RNasa A. Luego
de la incubación el genoma del fago sólo fue sensible a la acción de la enzima DNasa 1

por lo que el material genético se clasificó como DNA. Para determinar si el genoma
corresponde a DNA doble hebra, éste se trató con diversas endonucleasas de restricción
de tipo 11. El material genético del fago fue sensible al corte con las enzimas BamHI, Pstl,
Xba l, Kpnl, Oral, Hindlll , EcoRI y Sau3AI, por lo que se clasificó como materia l genético

37
 RESULTADOS

de DNA doble hebra. Para determinar el tamaño del genoma, éste se digirió con la enzima
Ora l, ya que la migración de todas las bandas obtenidas puede ser interpolada en una
ecuación de la recta obtenida a través del estándar de masa molecular 1 kb DNA ladder.
La presencia de 14 bandas indica la existencia de al menos 13 sitios de corte para la
enzima, la cual reconoce la secuencia TTT ~AAA. Con estos datos el tamaño del geno ma
se estimó en aproximadamente 30 Kpb (Figura 5A y B).

Para obtener datos de la secuencia del fago, el genoma se cortó con la enzima Kpnl y
los fragmentos se clonaron el vector pSU19. La secuenciación parcial de un fragmento de
963 pb (fragmento A) y el posterior análisis bioinformático arrojó identidad con genes
involucrados en la síntesis de la cápside de un profago de Actinobacil/us succinogenes
(Accession Number HQ014663). El fragmento presentaba 2 marcos de lectura abierto
(MLA) que tenían un 87% y un 84% de identidad nucleotídica con genes encontrados en
Actinobacillus succinogenes (Figura 6A y 68). Un posterior análisis de la secuencia
mostró una identidad aminoacídica del 96% y 84% con proteínas involucradas en la
síntesis de la cápside del profago encontrado en el genoma de la cepa de Actinobacillus
succinogenes 130Z (HK97 phage prohead protease family y HK97 phage majar capsid
protein family, Figura 6C). Por otra parte la secuenciación de otro fragmento de 827 pb
(fragmento B) mostró 4 posibles MLA (Figura 7) y tuvo una identidad nucleotídica de 69 %
con el fago Aa~23 de A. actinomycetemcomitans. La caracterización morfológica y
genética permitió clasificar a Aab~01 como un fago perteneciente al orden Caudoviral.

Figu ra 5: Ensayo restricción

y determ inació n de la masa
5
...ca molecular del genoma de
A ab~0 1 . A) Digestión del
"5 4
&l material genético Aab~01 con
i 3
enzima Oral (incubación 3 h a
37°C) en gel de agarosa al
j 2 y= -0,1477x + 5,0854
O, 7%. B) Ecuación de la recta
obtenida a través del patrón
...
o
R2 = 0,9967 de migración del estándar de
~ 1 masa molecular 1 kb DNA
...J
ladder obtenido en A.
o
o 5 10 15 20
Migración (cm)

38
 ,A
.Á.:Sur:;r:;inegeqeey AA'R'rG~Ti\J¡/\)yr~'MdA_é~TGT~i~rG'rtJl.GC/;cl>W.G¡.\~n:'JiA~N~Ar,
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 RESULTADOS

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Figura 6: Caracterización genética del fragmento A de Aabtj> 01 . A) Alineamiento de la

secuencia de Aab<jl01 con Actinobacil/us succinogenes 130Z utilizando ClustaiW. El codón de
término en HK97 family phage prohead protease está indicado negrita. El codón de inicio de HK97
family phage major capsid protein está subrayado. * indica identidad nucleotídica, - indica gap entre
las secuencias. B) Alineamiento de las secuencias de Aab<jl01 y A. succinogenes 130Z. Las flechas
indican los MLA y los bloques entre las flechas indican el porcentaje de identidad nucleotídica. C)
Blastx de las secuencia de Aab<jl01. La secuencia consenso está entre las secuencias
aminoacídicas de Aab<jl01 y A. succinogenes 130Z. +,indica aminoácido del mismo grupo.

40
 RESULTADOS

52
1 : Putative lyttc protein Rz: 2: Hypothetical protein: 3: Hypothetic al proteín. 4: HNH endon uclease

~-,;t i·-~~1::':i'

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Figura 7: Caracterización genética fragmento B de Aab$01. A) posibles MLA obtenidos por el

programa ORF finder y su función asignada por BLAST, el número inferior indica la cantidad de
aminoácidos. B) Alineamiento de la secuencia de Aab$01 con fago Aaphi23 de A.
actinomycetemcomitans. * indica identidad nucleotídica, - indica gap entre las secuencias.

41
 RESULTADOS

3.2.1.3 Caracterización genética del fago Fnp4>11

El genoma del fago se purificó y se trató con las enzimas DNasa 1 o RNasa A. Luego
de la incubación el genoma del fago sólo fue sensible a la acción de la enzima DNasa 1

por lo que el material genético se clasificó como DNA. Para determinar si el genomas
corresponde a DNA doble hebra, se trató con diversas endonucleasas de restricción de
tipo 11. El genoma de este fago no fue digerido por las enzimas Pstl, Xbal y Xhol (Figura
8A), esta es una característica bastante común ya que muchos fagos son capaces de
proteger su DNA de la acción de las endonucleasas del hospedero. Por el contrario, el
material genético del fago Fnp~11 fue sensible al corte con las enzimas Oral, Hindlll y
EcoRI. A partir del corte con las enzimas Hindlll y EcoRI se calculó el tamaño del genoma
del fago, el cual fue estimado en 99 Kpb (Figura 88).

A B
Figura 8: Ensayo
restricción material
genético Fnp~11. En A y
23130pb B se obseNa el patrón de
corte con diferentes
9416pb
enzimas de restricción . B)
A partir del corte
4361pb simultáneo con las
enzimas Hindlll y EcoR y
2322pb
posterior comparación
con el estándar de masa
molecular A./Hindlll se
calculó el tamaño del
genoma.

La secuenciación completa del genoma de Fnp~11 a través del454 pirosecuenciación,

arrojó que el tamaño del genoma es de aproximadamente 130 Kpb, esta diferencia con el
tamañ o obtenido con el patrón de migración se puede explicar por la presencia de una
banda muy cerca del límite superior de corte de la ecuación de la recta.

42
 RESULTADOS

Fnp~11 tiene un porcentaje G+C de 24,93% y presenta 178 posibles MLA. El análisis
de estos MLA indicó la presencia de 31 genes con identidad nucleotídica, dentro de los
cuales destacan genes relacionados con sistemas de protección de su DNA y enzimas
involucradas en la replicación del fago (Tabla 7). Debido a que con la mayoría de los MLA
no se obtuvo resultado de identidad nucleotídica se buscó la presencia de posibles
dominios a nivel proteíco con el fin de otorgar una posible función a dicho MLA. Este
análisis identificó genes relacionados con la síntesis de los componentes estructurales del
fago (cápside y cola) y los posibles genes involucrados con la lisis de la bacteria (sistema
holina-endolisina, Tabla 8). Un total de 144 MLA no presentaron identidad nucleotídica ni
dominios funcionales por lo que codificarían para proteínas hipotéticas.

Tabla 7. Principales MLA con identidad nucleotídica (BLAST) del fago Fnp$11.

MLA (BLAST) Función

Phage antirepressor protein Proteína no esencial involucrada con el desarrollo

-Adenine-specific methyltransferase
-C-5 cytosine-specific DNA methylase
-N-4 cytosine-specific DNA methylases and
N-6 Adenine-specific DNA methylases
de ciclo lítico.
Catalizan la transferencia de un grupo metilo al
DNA. Generalmente son utilizadas como una forma
de proteger el DNA del corte con enzimas de
restricción.

-DNA ligase Enzimas involucradas en la replicación del material

genético
-DNA polymerase 1

-RecD-Iike DNA helicase YrrC (Helicase)

-dUTP pyrophosphatase - Es una enzima que cataliza la reacción:

dUTP + H20 ~ dUMP + pirophosphate
-Ribonucleotide reductase of class 111 Enzima que cataliza la reducción de
ribonulceótidos reduction en los correspondientes
2'-deoxyribonucleotides y juegan un papel crucial en
la síntesis de DNA
-Phage DNA binding ATPase (terminase) Proteína involucrado en la translocación del DNA a
la cápside viral

7 tRNA's RNA involucrado en el transporte de los

aminoácidos a los ribosomas
DNA-binding protein HBsu Proteína de unión a DNA encontrada tanto en
bacterias como en dsVirus

43
 RESULTADOS

Tabla 8. Principales dominios encontrados en MLA sin identidad nucleotídica mediante BLAST en
Fnp~11.

+Proteína Hipotética Función

Phage-related minor tail protein Involucrado en el ensamblaje del complejo iniciador

para la polimerización de la cola

Predicted nucleotidyltransferase Transfieren un nucleósido monofosfato

N-acetylmuramoyi-L-alanine amidase Corta el peptidoglicán entre el N-acetilmurámico y los

residuos deL-aminoácidos (posible endolisina)

PD-(D/E)XK nuclease superfamily Resolvasa

Phage holin family (Lysis protein S) Formación de poro en la membrana

RNA ligase Ligasa. Tiene como sustratos ssRNA y ssDNA

-phiKZ-Iike phage interna! head protein Proteínas involucradas en la síntesis de la cápside

-Putative capsid protein V20

La función fue asignada según la presencia posibles dominios conservados presentes en la

proteína. Dichos dominios fueron buscados con los programas Pfam y KEEG

3.2.1.4 Caracterización del c rec im iento de Aab<jl01 y Fnp<jl11

3.2.1.4.1 Ensayo de adsorción y One Step Growth (OSG)

El primer paso en la infección del fago a su hospedero consiste en un proceso

denominado adsorción que involucra el reconocimiento de receptores en la bacteria
blanco. Luego de la inyección del material genético, el fago comienza a sintetizar los
materiales suficientes para la producción de nuevas partícu las virales, este ciclo de vida
intracelular se denomina período de eclipse (e) y no involucra lisis celular. Por el contrario,
tiempo de lisis o período de latencia (L) involucra la aparición de nuevos fagos en el
medio extracelular. El período de liberación exponencial de fagos desde el cultivo
bacteriano se conoce como rise periodo período de auge y la cantidad de fagos liberados
por célula correspone al burst size (b).

En el análisis de adsorción de Aab<jl01 a A. actinomycetemcomitans se observó una

lenta primera interacción fago-bacteria durante los primeros 4 min de incubación, luego de

44
 RESULTADOS

este tiempo el porcentaje de fagos libres cayó rápidamente, llegando a un 13%.

Posteriormente, se observa una segunda fase con una adsorción más lenta que llega
hasta un 4,6% de los fagos libres en 1O min (Figura 9A). La tasa de adsorción representa
el nivel de afinidad entre los fagos y bacterias y fue calculada de acuerdo a la fórmula
establecida por Barry y Goebel en el año 1951 (ver materiales y métodos, punto 2.9.9).
Para el período comprendido entre los 4-6 min la tasa de adsorción fue 5,6x1 o- 7 mL min-1 .
Cuando se analizó la adición de dos cationes Mg 2+ y Ca 2+, se observó que la interacción
fago-bacteria en presencia de estos cationes divalentes fue más rápida, empezando a
disminuir el número de fagos libres después de los primeros 2 min de incubación. La tasa
de adsorción con 1 mM de MgCb y CaCb fue 5,6x1 o- 8 mL min-1 y 5,5x1 o-8 mL min-1 ,
respectivamente (Figura 1OA). El análisis de OSG se realizó para identificar las diferentes
fases de ciclo de vida intracelular del fago. Después de la infección de A.
actinomycetemcomitans por Aab~01, el período de latencia, el período de auge y el burst
size se determinaron comparando los fagos libre y totales. El sistema demostró que el
período de latencia y el período de auge de Aab~01 fueron de 4,5 y 5 h, respectivamente.
Aab~01 alcanzó un burst size de unos 400 UFP por célula infectada a 37 oc (Figura 98).
El período de eclipse no fue calculado para Aab~01 ya que este fago demostró ser
sensible a cloroformo (ver estabilidad del fago, punto 3.2.1.5).

A 100

-+- BHI

80 BHI1mM MgCI 2

VI
----
.....- BHI 1 mM CaCI 2
...
G)

.a 60
VI
o
m
C'll 40
u..
o~

20

o
o 2 4 6 8
Tiempo (min)

45
 RESULTADOS

B
1.Qx1Q11
1.Qx1Q10
1.Qx1Q09
1.0x1Q 08
Período de auge
1.0x 1Q07
...J
E 1.Qx1Q06
a:u.. 1.0x1Q05
::::1
1.Qx1Q04
1 .0x1Q 03 L
1.Qx1Q02
1 .0x1Q01
1.Qx1Q 00
o 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)

Figura 9: Ensayo de adsorción y One Step Growth (OSG) para Aab~01 . A) Ensayo de
adsorción, en medio BHI y BHI suplementado con 1 mM de Mg 2+ o Ca 2+. La adsorción fue medida
en relación al porcentaje de fagos libres en el sobrenadante versus el tiempo en minutos. 8)
Ensayo de OSG, la curva de crecimiento del fago fue medida en base a las Unidades Formadoras
de Placas (UFP) por mL obtenidas durante el transcurso del la curva. La barra horizontal indica el
período de latencia (L) y la barra vertical el período de auge.

Al realizar estos mismos análisis con el fago Fnp~11 se observó una rápida interacción
fago-bacteria, ya que transcurrido 1 min post-incubación el porcentaje de fagos libres
descendió a un 4,6%. Luego de este tiempo cada vez menos fagos se encuentran en el
sobrenadante llegando a un 0,3% luego de 3 min post-incubación (Figura 1OA). La tasa de
adsorción para el período comprendido entre los 0-1 m in fue de 3,1 x1 o-7 mL min-1 . Al
suplementar el medio con Mg 2 + y Ca 2 +, se observó que la interacción fago-bacteria en
presencia de estos cationes divalentes fue levemente optimizada, disminuyendo el
número de fagos libres a 2,0 y 1,9%, respectivamente (Figura 1OA). La tasa de adsorción
con 1 mM de MgCI 2 y CaCI 2 fue 3,9x10-7 mL min-1 y 4,0x10-7 mL min-\ respectivamente
(Figura 11A).

En relación al análisis de OSG se determinó que el período de latencia y el período de

auge fue de 6 h y 16 h, respectivamente. El período de eclipse fue indistinguible del
período de latencia, indicando que el tiempo de lisis es muy breve. Fnp~11 alcanzó un
burst size de unos 1O UFP por célula infectada a 37 oc (Figura 108).

46
 RESULTADOS

A 100

~ 10
----
---.-
BHI
BHI 1mM MgCI 2
BHI1mM CaCI 2
.a
-~
O)
t1. 1
~
Q

0.1 +----.,.-----r-----.-------,r-------,
o 1 2 3 4 5
Tiempo (min)

1.0x 1Q09
- - Con CHCI 3 --- Sin CHCI 3
1.0 x 1Q 08
1.0x 10° 7
Período de auge
1.0x 10°6
..J
E 1.0 x 10°5
a:
lL 1. 0 x 10°4
;:)

1.0 x 1Q03
L, e
1.0 x 1Q 02
1.0 x 10° 1
1. Qx 1Q 00
o 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Figura 10: Ensayo de adsorción y One Step Growth (OSG) para Fnpcp11. A) Ensayo de
adsorción , en medio BHI y BHI suplementado con 1 mM de Mg2 + o Ca 2+ . La adsorción fue medida
en relación al porcentaje de fagos libres en el sobrenadante versus el tiempo en minutos. 8)
Ensayo de OSG , la curva de crecimiento del fago fue medida en base a las Unidades Formadoras
de Placas (UFP) por mL obtenidas durante el transcurso del la curva. La barra horizontal indica el
período de latencia (L) y eclipse (e) . La barra vertical el período de auge.

47
 RESULTADOS

Ta bla 9. Comparación datos de crecimiento fagos Aab~01 y Fnp~11

Parámetro Aab~01 Fnp~ 11

Tasa Ads orción

BHI 5,6x1 o- 7 ml min- 1 3,1x10-7 ml min- 1

BHI 1 mM MgCiz 5,6x1 o-s ml min- 1 3,9x10-7 ml min- 1

BHI 1 mM CaCiz 5,5x10-8 ml min- 1 4,0x10-7 ml min- 1

OSG
Período de Latencia (L) 4,5 h 6h

Período de auge 5h 16 h

Perído de eclipse (e) ND 6h

Burst size (b) 400 UFP por célula 1O UFP por célula

ND, no determinado

3.2.1.4.2 Curva de infección Aabcjl01

Para diferenciar los fagos líticos de los lisogénicos se realizó en primer lugar por la
observación macroscópica de las placas lisis y posteriormente por la capacidad de los
fagos de eliminar a la bacteria hospedera en una curva de crecimiento. La curva de
crecimiento de la cepa PAA005, correspondiente a A. actinomycetemcomitans serotipo b,
tiene una fase lag que dura entre 5 y 6 h, una fase exponencial que va desde
aproximadamente las 7 hasta las 15 h y culmina en una fase estacionaria con una 00 600
de 0,75 aproximadamente. La infección con Aabcjl01 en fase exponencial del cultivo (00 600
O, 1-0,2) causó una interrupción de esta fase. En este punto la lisis bacteriana fue mayor
que la tasa de generación, por lo que se comienza a observar un descenso continuo en la
absorbancia (Figura 11 B). Este efecto varía dependiendo el MOl utilizado, ya que a mayor
MOl (mayor concentración de fagos) el descenso en la absorbancia del cultivo fue más
rápido. En el punto anterior se demostró que los cationes Mg 2+ y Ca 2+ tienen un efecto en
la adsorción del fago, por lo que se decidió realizar una curva de infección en un medio
suplementado con dichos cationes. Se observó que la adición de cationes no mejoró el
efecto del fago sobre el cultivo bacteriano, ya que las curvas con y sin cationes no
presentaron diferencias.

48
 RESULTADOS

En todas las curvas analizadas la absorbancia del cultivo nunca llegó a cero, indicando
que el fago no elimina completamente el cultivo bacteriano. Este hecho fue corroborado a
través del recuento de UFC una vez finalizadas las curvas de crecimiento (Figura 11 C).
Estas características sumado a que Aab<j>01 forma placas de lisis turbias indican que tiene
características de un fago temperado o de ciclo lisogénico. Con el fin de determinar la
posible integración del fago en el material genético de la bacteria se realizó un PCR con
partidores diseñados a partir de la secuencia obtenida del fragmento A. Se analizaron
mediante PCR 32 colonias que se recuperaron post-infección con el fago. En este análisis
se determinó que en todos los casos existió una integración del mismo (Figura 11 0),
además las colonias que presentan al fago en forma de profago fueron resistentes a la
reinfección por Aab<j>01.

49
 RESULTADOS

Ensayo exclusión
Aab<jJ01 <superinfección
1. Curva crecimiento
2. Recuento UFC
PCR
Lisógenos

PAA005 --. MOI1 :1 M011 :10

--'~'-- MOl 1:100 MOl 1:1000 --- MOl 1:10000
0.8 -+-
B

0.6
E
S::
o
~ 0.4
8
0.2
\
0.0 '
o 6 10 16 20 26
Tiempo (h)

e D 1 2 3 4 5 6 7 8 91011121314

..J
E
u
u.
:::>

Figura 11 : Curva de infecc ión de Aab<jJ 01 . A) Esquema general del ensayo de infección y
determinación de la presencia de lisógenos. B) Curva crecimiento de A. actinomycetemcomitans
cepa PAA005. La flecha indica el momento de la infección con el fago Aab<jJ01 en distintas
multiciplidades de infección (MOl). C) Recuento de UFC finales obtenidas de las curvas descritas
en B. D) PCR a colonias recuperadas post-infección con Aab<jJ01 . Carril 1 estándar 100 pb, carril 2
PCR a Aab<jJ01. Carril 3 y 4 , PCR a PAA005 . Carriles 5 al1 4 PCR colonias post-infección . Carriles
2, 4, 6, 8, 1 O, 12 y 14 muestran amplificado obtenido con partidores (FragA-F y FragA-R) para el
fragmento A. Carriles 3, 5, 7, 9, 11 y 13 muestran amplificado obtenido con partidores Aa-1 y Aa-2
para el 165 rDNA de Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

so
 RESULTADOS

3.2.1.4.2.1 Liberación profago

Con el fin de determinar la posible liberación de Aab~01, los lisógenos obtenidos en el

punto anterior fueron inducidos mediante luz UV o estrés por incubación prolongada (72
h). 7 de los 12 lisógenos analizados liberaron partículas infecciosas indicando que Aab~01

tiene la capacidad de escindirse del genoma de la bacteria hospedera (Figura 12).

Luz UV (302nm)

72 h Incubación

Lisógenos Obtención
Observación de zona de
sobrenadante
inhibición del crecimiento a
partir de una gota de 5 J..LL de
los sobrenadantes obtenidos
en el paso anterior

Figura 12: Inducción liberación profago. Los posibles lisógenos recuperados luego de una
infección con Aab$01, fueron incubados durante 72 h en aerobiosis con agitación o expuestos
durante 5 min a luz UV. El sobrenadante de estos lisógenos se probó sobre un césped de la
bacteria sensible. Los números denotan la cantidad de lisógenos ensayados. La reacción positiva
se observó por la aparición de un halo de inhibición. Como control se utilizó sobrenadante obtenido
desde la cepa PAA005.

51
 RESULTADOS

3.2.1.4.3 Curva de infección Fnp~11

La curva de crecimiento de F. nucleatum tiene una fase lag que dura

aproximadamente 15 h, una fase exponencial que va desde las 18 hasta las 34 h y
culmina en una fase estacionaria con una absorbancia a 00600 de 0,8. La infección con
Fnp~11 en fase exponencial del cultivo (00 600 O, 1-0,2) causó una interrupción de la fase
exponencial en 00 600 0,3. En este punto la lisis bacteriana fue mayor que la tasa de
generación por lo que se observa un descenso continúo en la absorbancia hasta llegar a
00600 de 0,03 (Figura 12). Al realizar un recuento de UFC una vez finalizadas las curvas
de crecimiento no se obtuvieron colonias, indicando que el fago fue capaz de lisar
completamente el cultivo bacteriano. Estas características, sumado a que en un césped
de la bacteria sensible forma placas de lisis limpias indicaron que Fnp~11 tiene
características de un fago lítico.

o
CD
E
oe 0.6 -- F. nucleatum A TCC25586
F. nucleatum ATCC25586/Fnp~ 11
o 0.4
e
0.2

o.o-}.-.~.........-=~--___;:==~~__,
o 20 40 60
Tiempo (h)
B

Figura 13: Curva de infección Fnp<j> 11. A) Curva crecimiento de Fusobacterium nuc/eatum. La
flecha indica el momento de la infección con el fago Fnp<j>11 (MOl 1:1 000). 8) Observación cultivo
bacteriano al finalizar la curva de crecimiento.
52
 RESULTADOS

3.2.1.5 Estabilidad de Aab~01 y Fnp~11 frente a distintas condiciones

Un requisito importante para la aplicación de una solución que contenga fagos es que
sea estable en el tiempo (mantenga su título). Por ello se evaluó la estabilidad de Aab~01

y Fnp~11 frente a distintas condiciones a la que es sometido durante su obtención

(cloroformo), almacenamiento (temperatura, pH) y a las que sería sometido en un posible

uso (agitación, saliva y pH). Los resultados muestran que el fago Aab~01 es estable sólo
a bajas concentraciones de cloroformo y saliva. La temperatura óptima de almacenaje fue
a 4°C (Figura 14 y Tabla 10). En contraste a lo observado con Aab~01, el fago Fnp~11 es
resistente a la acción del cloroformo, la agitación y los componentes de la saliva. Al igual
que el fago Aab~01 la temperatura óptima de almacenaje fue a 4°C (Figura 14 y Tabla
10).

A ·O
'()
e
100
--- 4°C
--- -20°C Figura 14: Estabilidad de los fagos
Aabcj> 01 y Fnpcj>11 a la temperatura.
La estabilidad fue medida a 4°C,
_g -20°C, temperatura ambiente
::::1
() 80 (aproximadamente 25°C) y 37°C tanto

-
'"j
e
VI
8.
VI
60
para el fago Aab<j>01 (A) como para
Fnp<j>11 (8). La estabilidad se midió
como el % de bacteriófagos luego de
o la incubación en comparación con la
Cl 40
....
•O
111 cantidad de fagos antes de la
·¡: incubación.
-m G)
()
111
20

o~
10 20 30 40
Tiempo (d)

--.-
--- 4°C 25°C

B e
·O 100
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--- -20°C __..._ 37°C

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111
20

o~
o
o 10 20 30 40 53
Tiempo (d)
 RESULTADOS

Tabla 10. Estabilidad del fago Aab~01 y Fnp~11 frente a distintas condiciones

% Estabilidad % Estabilidad
Condición
Aab~ 01 Fnp~ 11

Solvente Orgánico

Cloroformo 1% 83,0 ± 9,0 95,1 ± 18,7

Cloroformo 5% 58,8 ± 15,0 93,9 ± 17,2

Cloroformo 10% 45,9 ± 14,2 83,3 ± 10,4

Agitación

Vortex 1 min 76,8 ± 7,9 97,7 ± 8,4

Vortex 3 min 65,7 ± 6,4 108,0 ± 0,5

Fluido Orgánico

Saliva 50% 89,5 ± 2,6 99,4 ± 9,6

Saliva 90% 46,3 ± 12,0 105,0 ± 7,0

pH

5,5 82,1±10,5 102,5 ± 3,5

6,0 87,5 ± 8,1 102,5 ± 7,1

6,5 89,9 ± 7,9 105,0 ± 6,8

7,0 94,1 ± 3,5 90,0 ± 3,5

7,5 92,7 ± 7,4 95,3 ± 7,4

8,0 81,3 ± 8,3 91,3 ± 5,3

54
 RESULTADOS

A continuación se detalla un resumen con las principales características de los fagos

aislados para A. actinomycetemcomitans y F. nuc/eatum (Tabla 11).

Tabla 11. Resumen caracterización fagos Aab~01 y Fnp~11.

Caracterización

Macroscópica Placas de lisis levemente turbias de Placas de lisis limpias de 0,5-1 mm

0,5-1 mm de diámetro de diámetro

Microscópica Cápside icosaédrica de 50 nm. Cola Cápside icosaédrica de 77 nm.

filamentosa de 150 nm Cola filamentosa de 55 nm

Rango de Hospedero A. actinomycetemcomitans serotipo b F. nucleatum

Material genético DNA doble hebra de 30 Kpb DNA doble hebra de 130 Kpb

Orden Caudovirales Caudovirales

Familia Siphoviridae Podoviridae

Género Aún no subclasificado Aún no subclasificado

55
 RESULTADOS

3.3 Transformación de los bacteriófagos lisógenos a bacteriófagos líticos.

La obtención de partículas virales mutantes se realizó po r mutaciones al azar con luz

UV (260 nm), de esta forma se obtuvieron nuevas partículas virales provenientes del fago
Aab~01. Las nuevas partículas virales se seleccionaron por su capacidad de generar
placas de lisis limpias. Las placas de lisis limpias se aislaron y propagaron. Estas nuevas
partículas se probaron en una curva de crecimiento de la cepa PAAOOS . La partícula viral
mutante denominada Aab~ O 1-1 se seleccionó por tener una mejor eficiencia en la
infección de la cepa PAAOOS (Figura 15).

A 0.8

--
PAAOOS
0.6 PAAOOS/Aab~ 01-1
E PAAOOS/Aab~ O1-2
o
o
e
CD 0.4
-
-+-
PAAOOS/Aab~ 01-3
PAAOOS/Aab~ 01 -4
o
e
0.2
--- PAA005/Aab~01-5

o . o-~~::;_-------.....---------
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)

Figura 15: Curva infección partículas virales mutantes. Curvas crecimientos PAA005 infectada
con distintos lisados obtenidos por mutación al azar. La flecha indica el momento de la infección .

56
 RESULTADOS

3.3.1 Curva de infección Aab~01-1

Con el fin de evaluar comparativamente la capacidad de lisar un cultivo bacteriano la

cepa PAA005 se infectó con Aab~01 o Aab~01-1, al infectar con ambos fagos la fase
logarítmica se detuvo y se observó una disminución de la absorbancia. Con Aab~01-1 se
observó un mejoramiento en la lisis celular disminuyendo en mayor medida la absorbancia
del cultivo comparado con Aab~01, sugiriendo que el fago mutado es más efectivo en el
proceso de infección que el fago silvestre Aab~01 (Figura 16A).

Para determinar si este variante mutante perdió la capacidad de integrarse en el

genoma de su hospedero, se realizó un PCR a las colonias recuperadas post-infección.
Todas las colonias analizadas fueron positivas en el amplificado del fragmento
correspondiente al fago Aab~01, indicando que Aab~01-1 continúa siendo un fago
temperado (Figura 168). Además las bacterias que presentan integrado en su genoma a
Aab~01 o Aab~01-1 son resistentes a la reinfección por este último.

A 0.8

0.6 PAA005
E PAA005/Aab<j> 01
e
o
o 0.4 PAA005/Aab<j>01-1
CD
oe
0.2

0.0
o 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)

Figura 16: Curva de infección Aabcp01-1. A) Curva crecimiento de A. actinomycetemcomitans

cepa PAA005. La flecha indica el momento de la infección con el fago Aab<j>01 o Aab<j>01. 8) PCR a
colonias recuperadas post-infección con Aab<j>01-1. Carril 1 estándar 100 pb, carril 2 PCR a
Aab<j>01. Carril 3, PCR a PAA005. Carriles 4 al 8 PCR colonias post-infección. Carriles muestran
amplificado obtenido con partidores (FragA-F y FragA-R) para el fragmento A del fago.

57
 RESULTADOS

3.4 Ensayo de reversión de las partículas virales

Para evaluar la posibilidad de que una bacteria se vuelva resistente espontáneamente

a la infección por el fago se realizó un ensayo de reversión. La probabilidad de encontrar
cepas resistentes en todos los casos es menor a 1 x 1o-8 , esto es equivalente a decir que
en una población de 100.000.000 de bacterias, menos de una es resistente a la infección.

Tabla 12. Probabilidad de encontrar cepas resistentes a los fagos.

Aabcjl01 Aabcjl01-1 Fnpcjl11

Probabilidad 2,11x1o-s 1,35 X 10-8 2,56 x1o-s

de Reversión

3.5. Evaluación in vitro de la actividad de Jos fagos sobre los periodontopatógenos

3.5.1 Evaluación de la actividad de Jos fagos sobre biopelículas simples

3.5.1.1 Actividad antimicrobiana de los fagos Aabcjl01 y Aabcjl01-1 en una biopelícula

de A. actinomycetemcomitans.

La actividad antimicrobiana de los fagos sobre una biopelícula de A.

actinomycetemcomitans se analizó mediante la comparación de las UFC/mL obtenidas
post-infección en comparación con las UFC/mL antes de la infección. La primera
aproximación para determinar si los fagos eran capaces de eliminar a A.
actinomycetemcomitans al interior de la biopelícula, fue establecer el momento en el cual
se cuantifica la mayor cantidad de ésta. Para ello se realizó una curva de crecimiento de
la biopelícula y se estableció una relación entre la biopelícula y la cantidad de bacterias
presentes en la misma, determinándose que entre las 16-20 h post-incubación se genera
la mayor cantidad de biopelícula por cantidad de bacteria (Figura 17). Dado que una
mayor cantidad de biopelícula sería un impedimento mayor para que el fago alcance su
bacteria blanco, este tiempo de incubación se estableció como el estándar antes de
realizar una infección con el fago Aabcjl01 o Aabcjl01-1. Por otra parte se determinó el MOl
(PFU:UFC) necesario para permitir que los fagos puedan eliminar a la bacteria al interior
de la biopelícula. Tal como se muestra en la figura 18, MOI's altos de Aabcjl01 y Aabcjl01-1
fueron efectivos para provocar la lisis de A. actinomycetemcomitans al interior de la

58
 RESULTADOS

biopelícula. El MOl mínimo necesario para obtener la más alta disminución en el recuento
de A. actinomycetemcomitans fue de O, 1 para el fago Aab~01 y de 0,01 para el fago
Aab~01-1. Esto indicó que se requieren menos partículas de Aab~01-1 para producir el
mismo efecto. Este fenómeno se observó para la biopelícula generada tanto en
condiciones anaerobias (Figura 18A) como capnofílicas (Figura 188), por lo que la
actividad antimicrobiana de los fagos estudiados en la biopelícula de A.
actinomycetemcomitans no fue afectada por estas condiciones de cultivo. A pesar de que
ambos fagos son capaces de eliminar bacterias al interior de la biopelícula, no son
capaces de reducir la cantidad de biopelícula. Este último efecto sólo se observó al utilizar
los fagos en un MOl mayor o igual a 1 y estaría relacionado con una menor expresión de
la biopelícula debido a la menor biodisponiblidad de nutrientes (Figura 19).

Tiempo (h)
20 40 60 80 100
1
0.1
0.01
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Q)
0.001i
~ 1.0x10~ 6
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::S 1.0x10~ 8
o
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lo 1.0x10~ 9
·-m 1.0x10·10

Figura 17: Curva crecimiento biopelícula A. actinomycetemcomitans. Cuantificación

biopelícula (absorbancia 595nm) y recuento de UFC obtenido en medio BHI. El gráfico muestra la
relación entre la absorbancia a 595 nm y el recuento de UFC/ml obtenido durante el transcurso de
la curva de crecimiento de la biopelícula.

59
 RESULTADOS

A
D Aab<j>01 - Aab~0 1- 1

88 89

*
* *
*
8,8

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~
126
B 1 D Aab~01 Aab<j>01-1 121
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*
OJ
c.
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en
o~ 0,5 0,5
¡;,7 8,8

Figura 18: Detenninación del MOl. Una biopelícula de A. actinomycetemcomitans cultivada

durante 24 h en anaerobiosis (A) o en capnofilia (8) se infectó con Aab<j¡01 o Aab<j¡01-1 en
diferentes MOis. Los resultados están expresados como el porcentaje de UFC/m L recuperadas a
las 24 h post-infección comparadas con las UFC/mL antes de la infección. Como control se utilizó
una biopelícula de A. actinomycetemcomitans sin infectar (Aa). Las barras muestran el promedio
de tres experimentos independientes. * p<0.05.

60
 RESULTADOS

A
D Aab~ 01 - Aab~ 01-1

E
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ll)
en
ll)

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B
D Aab~ 01 - Aab~ 01-1

E
e:
ll)
en
ll)

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o'
·"
11.;•

Figura 19: Efecto de los bacteriófagos sobre la biopelícula. La biopelícula de A.

actinomycetemcomítans cultivada durante 24 h en anaerobiosis (A) o en capnofilia (B) se infectó
con Aab~01 o Aab~01-1 en diferentes MOis. Los resultados muestran la cuantificación de la
biopelícula post-infección con los bacteriófagos (Abs 595nm) . Como control se utilizó una
biopelícula de A. actínomycetemcomitans sin infectar (Aa). Las barras muestran el promedio de
tres experimentos independientes. * p<0.05.
61
 RESULTA DOS

Para comparar la eficacia de los fagos Aab~01 y Aab~01-1 y proporcionar una

aproximación al uso de estos fagos como agentes terapéuticos, se desarrolló un
experimento en el que los fagos fueron administrados en dos dosis (MOl 0,01) separadas
por un lapso de tiempo de 24 h. Tanto Aab~01 como Aab~01-1 fueron capaces de reducir
la cantidad de bacterias presentes en la biopelícula. En condiciones anaeróbicas, con la
primera dosis de Aab~01 el recuento de A. actinomycetemcomitans disminuyó en un
94,4%, mientras que con la segunda dosis se reduce la carga bacteriana en un 94,6%, en
relación con el conteo inicial. El fago Aab~01-1 fue más eficaz que Aab~01, ya que con la
primera dosis se produce la eliminación del 99,5% de las bacterias, mientras que con la
segunda dosis el 99,7% de éstas (Figura 20A). En condiciones capnofílicas, con la
primera dosis de Aab~01 el recuento de A. actinomycetemcomitans disminuyó en un
90,4%, mientras que con la segunda dosis disminuyó en un 99.9% de las bacterias.
Nuevamente el fago Aab~01-1 fue más eficiente, ya que eliminó al 99,9% de las bacterias
con la primera dosis (Figura 208). Estos resultados sugieren que una dosis es suficiente
para lograr una reducción significativa de A. actinomycetemcomitans dentro de la
biopelícula. En todos estos ensayos los fagos son capaces de propagarse al interior de la
biopelícula, ya que al hacer un recuento de las UFP/ml post-infección se observaron
títulos mayores a los adicionados en el momento de la infección. Por otra parte, para
demostrar que la actividad antimicrobiana de los fagos es específica para el serotipo b de
A. actinomycetemcomitans, se utilizó como control una cepa serotipo e de A.
actinomycetemcomitans c. No se observó disminución en el recuento de UFC/ml de esta
cepa al ser tratada con Aab~01 o Aab~01-1 lo que confirma que este fago tiene un
espectro de hospedero reducido (Figura 20). Para confirmar estos hallazgos se
caracterizó la viabilidad celular al interior de la biopelícula por microscopía confocal,
demostrando que ambos fagos son capaces de penetrar la biopelícula y producir la lisis
de A. actinomycetemcomitans serotipo b (Figura 21).

62
 RESULTADOS
C1l
:; 140
A 126,4
-~ 110,4
a>c.
120
·º.ee
Q) 91,3
100
C1J
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C1l *
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Q) 0,5 0,3
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(/)
Primera Segunda Primera Segunda Primera Segunda Primera Segunda Primera Segunda
~
C> Dosis Dosis Dosis Dosis Dosis Dosis Dosis Dosis Dosis Dosis

Serotipo b Serotipo e
C1l
B :; 120
112,6
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a>c.
o 95,2 82.4 94,3 85,4
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~
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Primera Segunda Primera Segunda Primera Segunda Primera Segunda Primera Segunda
Dosis Dosis Dosis Dosis Dosis Dosis Dosis Dosis Dosis Dosis

" ~-~~-~-- - --~--

Serotipo b Serotipo e

Figura 20: Determinación del efecto de una segunda dosis del fago. Ensayo con dos dosis de
fagos. La biopelícula de A. actinomycetemcomitans cultivada durante 24 h en anaerobiosis (A) o en
capnofilia (B) se infectó con Aab~01 o Aab~01 - 1 a un MOl de 0,01 en dos dosis. Los resultados
están expresados como el porcentaje de UFC/mL recuperadas luego de la primera o segunda
dosis comparada con las UFC/mL antes de la infección. Como control se utilizaron dos dosis de
medio de cultivo (BHI). Las barras muestran el promedio de tres experimentos independientes. *
p<0.05.
63
 RESULTADOS

Serotipo e

Aabcp01

Aabcp01-1

Control

Figura 21: Microscopía confocal de una biopelícula de A. actinomycetemcomitans luego de

la infección con Aab<j>01 o Aab<j>01-1. Una biopelícula de A. actinomycetemcomitans serotipo b o
serotipo e cultivada durante 24 h en condiciones capnofílicas se infectó con Aab<j>01 o Aab<jJ01-1 y
se tiño con el kit LIVE/DEAD BacLight™ Bacteria! Viability. Como control se utilizó una biopelícula
de A. actinomycetemcomitans sin infectar. El color verde indica bacteria viable y el color rojo indica
bacteria con la membrana comprometida .

64
 RESULTADOS

3.5.2 Actividad antim icrobiana de los fagos Fnpcj> 11 y Fnpcj> 02-11 en un biopelícu la de
F. nucleatum.

Con el fin de evaluar la actividad de los bacteriófagos sobre F. nucleatum formando

biopelículas simples, el primer paso consistió en determinar en qué medios de cultivo la
bacteria genera una mayor cantidad de biopelícula, esto debido principalmente a la pobre
capacidad de F. nucleatum de formar biopelículas simples in vitro. Para ello se utilizaron
los medios de cultivo BHI y CMT (ver materiales y métodos punto 2.2). Además de esto,
las placas de poliestireno que sirven como superficie abiótica para la formación de la
biopelícula fueron recubiertas con saliva estéril. Como control se utilizó una placa que no
recibió tratamiento. En todos los casos analizados la biopelícula se incubó durante 48 h
para permitir su máxima expresión (resultados del laboratorio no publicados). Se pudo
observar que la cantidad de biopelícula generada cuando la placa de poliestireno se
encuentra recubierta con saliva es aproximadamente el doble que cuando no existe tal
tratamiento. Sin embrago al comparar la biopelícula generada en los distintos medios no
existen diferencias significativas (Figura 22A). Al realizar una corrección por la cantidad de
bacterias presentes en la biopelícula se observa que en el medio CMT existe una mayor
cantidad de biopelícula por bacteria (Figura 22C).

Considerando los resultados antes mencionados se estandarizaron las condiciones de

cultivo de la biopelícula de F. nuc/eatum. De esta forma todos los ensayos fueron
realizados con los medios CMT o BHI (utilizado como comparación) sobre placas de
poliestireno recubiertas con saliva y con un tiempo de incubación de 48 h antes de
infección con el fago. Por otra parte, en dichos ensayos se incluyó al fago Fnp$02-14, el
cual corresponde a una variante lítica mutante proveniente del fago Fnp$02, previamente
reportado por nuestro laboratorio (Machuca y cols., 2010).

En una biopelícula formada en medio BHI ambos fagos logran eliminar la totalidad del
cultivo bacteriano, pero presentan diferencias en la eficiencia con la que lo hacen, ya que
en el caso del fago Fnp$02-14 el MOl mínimo necesario para obtener la más alta
disminución en el recuento de F. nuc/eatum fue de O,1 (MOl 1:1 0), mientras que para el
fago Fnp$11 resultó ser 0,01 (MOl 1:100), indicando que una menor concentración de
este fago es necesaria para logar el mismo efecto que Fnp$02-14 (Figura 23A). Al
analizar el efecto de los fagos sobre F. nucleatum formando biopelícula en el medio CMT

65
 RESULTADOS

se observó un comportamiento similar al descrito en el medio 8HI con algunas diferencias

en cuanto a la efectividad del fago Fnp~11, ya que a pesar de no eliminar completamente
el cultivo bacteriano logra el mismo efecto en los MOI's 0,01 y 0,001 (1 ,5 y 1,8% de
supervivencia de la bacteria post-infección), sugiriendo que la composición del medio
afecta la eficiencia con la que este fago encuentra su bacteria blanco (Figura 238). Estas
diferencias pueden explicarse por el efecto diferencial de estos fagos sobre la biopelícula
de F. nucleatum en los distintos medios, ya que en 8HI no se observa disminución en la
absorbancia a 595nm con respecto al control con ninguno de los MOI's utilizados con
ambos fagos (Figura 24A), mientras que en la biopelícula generada en el medio CMT se
observan diferencias en este punto (Figura 248). Particularmente la utilización del fago
Fnp~11 muestra un descenso en aproximadamente la mitad de la absorbancia en
comparación con el control desde los MOI's 2 hasta 0,001 (MOl 2:1, 1:1000) los que se
relacionan con su actividad bacteriolítica mencionada anteriormente. Todos estos datos
demostraron que ambos fagos son capaces de eliminar completamente a F. nuc/eatum al
interior de la biopelícula formada en distintos medios de cultivo y que Fnp~11 tiene una
mayor eficiencia que Fnp~02-14 .

66
 RESULTADOS
A o.
*
*
E
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~
~
B Recubierto con saliva
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3.2X10 8

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e Recubierto con saliva

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m 1.0x10-
1.0x1o-aa

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10
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*

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Recubierto con saliva

Figura 22 : Formación biopelícula F. nuc/eatum en d istintos medios de cultivo. A)

cuantificación biopelícula en distintos medios de cultivo. B) UFC/ml obtenidas 48 h después de la
formación de la biopelícula. C) Corrección de la biopelícula generada en cada condición, obtenida
al dividir la absorbancia 595nm por la concentración bacteriana .* p<0.05.

67
 RESULTADOS

D Fnp~02-14 - Fnp~11

* *
1 1
37 0,0 77 12

......
1).•

~
o'

B
D FnP<j>02-14 - Fnp~11

0,0 0,0 0,0 0,0 2,1 0,0

............
~
o'

Figura 23: Efecto bacteriolítico de Fnpq,02-14 y Fnpq,11 en distintos MOI's sobre una
biopelícula de F. nuc/eatum. Una biopelícula de F. nucleatum cultivada durante 48 h en BHI (A) o
en CMT (B) se infectó con Fnpq,02-14 o Fnpq,11 en diferentes MOis. Los resultados están
expresados como el porcentaje de UFC/mL recuperadas a las 24 h post-infección comparadas con
las UFC/mL antes de la infección . Como control se utilizó una biopelícula de F. nuc/eatum sin
infectar (Fn) . Las barras muestran el promedio de tres experimentos independientes.* p<0.05
68
 RESULTADOS

A
D Fnp~ 02-14 - Fnp~ 11

o.
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Figura 24: Efecto de los bacteriófagos Fnp~02-14 y Fnp~ 11 sobre la biopelícula de F.

nuc/eatum. La biopelícula de F. nucleatum cultivada durante 48 h en BHI (A) o en CMT (8) se
infectó con Fnp<P02-14 o Fnp<!J11 en diferentes MOis. Los resultados muestran la cuantificación de
la biopelícula post-infección con los bacteriófagos. Como control se utilizó una biopelícula de F.
nuc/eatum sin infectar (Fn) . Las ba rras muestran el promedio de tres experimentos independientes.

69
 RESULTADOS

3.5.3 Evaluación de la actividad de los fagos sobre biopelículas mixtas

A pesar de que los fagos son efectivos contra la bacteria cuando ésta se encuentra
embebida en su propia matriz de exopolisacáridos, es necesario comprobar que la
existencia de exopolisacáridos sintetizados y secretados por otras bacterias no ejerzan un
rol protector (barrera física) contra la acción del fago. Para comprobar esta hipótesis se
realizaron biopelículas mixtas. Para ello muestras de saliva fueron inoculadas con A.
actinomycetemcomitans y F. nucleatum y se incubaron durante 48 h en medio CMT para
permitir la formación de una biopelícula compleja. La ventaja de este medio de cultivo es
que permitiría la proliferación de un mayor número de especies presentes en la boca (Tian
y cols, 2010), por lo daría cuenta de una biopelícula compleja más parecida a la
encontrada en la cavidad oral. Al analizar las bacterias cultivables presentes en la saliva
se observaron aproximadamente 1O morfologías macroscópicas distintas, entre las que
destacaron bacterias pigmentadas de negro, bacterias alfa y gamma hemolíticas. En la
caracterización microscópica se observaron, abundantes cocáceas Gram positivo, bacilos
Gram positivo y cocobacilos Gram negativo.

Para realizar una aproximación al uso terapéutico de estos fagos (terapia combinada),
se realizaron mezclas de los mismos. De este modo la biopelícula se infectó con Fnp~11 y
Fnp~02-14 , Aab~01-1 o con una mezcla de los 3 fagos. Los resultados muestran que a
pesar de alcanzar a sus bacterias blancos, los fagos son menos efectivos que en
biopelículas simples, ya que en conjunto los fagos Fnp~02-14 y Fnp~11 con un MOl de
1:1 O eliminan aproximadamente el 85% de F. nucleatum al interior de la biopelícula
(Figura 25). Por otra parte, el fago Aab~01-1 redujo la cantidad de A.
actinomycetemcomitans en un 45%. No se observó un sinergismo, ya que el uso de los
tres fagos tuvo un efecto similar al observado utilizando los fagos de forma individual,
indicando que no existió un efecto inespecífico sobre la supervivencia de F. nuc/eatum
con el fago Aab~01-1, ni de de A. actinomycetemcomitans con los fagos Fnp~02-14 y
Fnp~11 (Figura 25). La biopelícula no se vio alterada por la acción del pool de fagos
(Figura 26).

70
 RESULTADOS

E3 Recuento Aa - Recuento Fn Figura 25: Efecto

e: bacteriolítico de Aab~ 01 -1 ,
:2 Fnp~ 11 y Fnp~02-14 sobre
u 86
...cu
Q)
biopelículas mixtas. Los
!!::: resultados están expresados
o... *
65
como el porcentaje de
c. UFC/mL recuperadas a las 24
o h post-infección comparadas
.!!! con las UFC/mL antes de la
u
e: infección. Como control se
Q)
>
·:;; utilizó una biopelícula mixta
...
Q)
sin infectar (Sin tratamiento) .
c. * Aa corresponde al recuento
::::l
CJ) 10 *
7
de A. actinomycetemcomitas y
Fn a F. nuc/eatum. Las barras
muestran el promedio de tres
experimentos independientes.
* p<O.OS.

Figura 26: Efecto de los

bacteriófagos Aab ~01-1 y/o
E Fnp~ 11 sobre una biopelícula
e mixta. Los resultados muestran la
LO
en cuantificación de la biopelícula
LO
post-infección con los
~ bacteriófagos (Abs 595nm). Como
< control se utilizó una biopelícula
mixta sin infectar (Sin tratamiento).
Las barras muestran el promedio
de tres experimentos
independientes.

71
 D ISCUSIÓN

4. DISCUSIÓN

4.1 Aislamiento y caracterización del bacteriófago Aabtjl01

La lisogenia está descrita en A. actinomycetemcomitans y se han aislado fagos

temperados tanto desde el saco periodontal, como desde individuos periodontalmente
sanos (Haubek y cols., 1997; Resch y cols., 2004). Se estima que más del 50% de los
aislados de A. actinomycetemcomitans son capaces de liberar partícu las virales
infecciosas cuando son inducidos (Willi y cols., 1997). Uno de estos fagos, denominado
~Aa17, corresponde a un fago inducido desde el genoma de A. actinomycetemcomitans
651. Entre sus características destacan que tiene una simetría binaria con una cápside
icoahédrica de 70 nm de diámetro y una cola contráctil que varía entre 127 y 47 nm
dependiendo de si se encuentra extendida o contraída. ~Aa 17 tiene una material genético
de DNA doble hebra (Steven y cols., 1982). Por otra parte, Willi y cols. describieron cinco
bacteriófagos temperados morfológicamente similares y genéticamente relacionados
denominados Aa~5, Aa~23, Aa~76, Aa~97 y Aa~99 (Willi y cols., 1993). Estos fagos
liberados desde varias cepas lisógenas de A. actinomycetemcomitans tenían una cápside
icosahédrica de 65 nm y una cola' contráctil de 11 O nm. Las partículas virales contenían
aproximadamente 45 Kpb de DNA doble hebra (Resch y cols., 2004, Willi y cols., 1993).
Particularmente el genoma de Aa~23 fue totalmente secuenciado y corresponde a un
DNA de doble hebra de 43.033 pares de bases, comparte las características con los fagos
lambdoides y es capaz de transducir marcadores de resistencia a los antibióticos (Resch y
cols., 2004, Willi y cols., 1997a). Los miembros de la familia del fago Aa~23 se han
encontrado en el 40% de las cepas de A. actinomycetemcomitans (Willi y cols., 1997).

Aab~01 fue aislado desde las aguas residua les de los sillones dentales y las cepas
utilizadas en este estudio no liberaron partículas virales infecciosas al ser inducidas, por lo
que este fago no corresponde a la liberación desde un lisógeno. El materia l genético es
de DNA doble hebra con un tamaño estimado en 30 Kpb. El análisis de 827 pb de su
genoma indicó que Aab~01 tiene una identidad nucleotídica de 69% con el fago Aa~23 de
A. actinomycetemcomitans, además al igual que los fagos relacionados a Aa~23 tiene la
capacidad de integrarse al genoma y de escindirse al ser inducido. Estos datos sugieren
que Aab~01 podría ser un miembro de esta familia. Por otra parte, el análisis de otro
fragmento de 963 pb mostró identidad con genes que codifican para proteínas de la
cápside pertenecientes a la familia HK97 y que se encuentran en un profago en el

72
 DISCUSIÓN

genoma de Actinobacillus succinogenes. Las proteínas de la familia HK97 representan el

principal componente de la cápside de los bacteriófagos HK97, phi-1 05, P27 y de otros
fagos que tienen DNA doble hebra como material genético (Cardarelli y cols., 2010). Estos
bacteriófagos se han agrupado en el orden Caudoviral, que comprende a las familias
Myoviridae, Siphoviridae y Podoviridae. La familia Myoviridae agrupa a virus con colas
contráctiles. La familia Siphoviridae comprende virus con colas largas no contráctiles,
mientras que la familia Podoviridae comprende virus con colas cortas y no contráctiles
(Maniloff y Ackermann, 1998). El análisis de microscopía electrónica indica que Aab~01

no es un bacteriófago de la familia Podoviridae. Además, diferentes micrografías de

Aab~01 mostraron la misma longitud de la cola, lo que sugiere que el fago tiene una cola
no contráctil, característica de la familia Siphoviridae (Maniloff y Ackermann, 1998). Estos
hallazgos se contraponen a los reportados por Willi y cols. indicando que a pesar de estar
en presencia de un fago relacionado a Aa~23, Aab~01 correspondería a un bacteriófago
nuevo.

Para iniciar una infección, un fago tiene que adsorberse a la superficie de su

hospedero. Este paso es comúnmente visto como un problema ligando-receptor; por lo
tanto, la tasa de "encontrar" una bacteria sensible suele suponer una cinética de acción
de masas (Katsura, 1983; Shao y Wang, 2008). Existen algunos factores que afectan
dicho proceso, tales como la temperatura de incubación, el pH del medio, el estado
fisiológico de las bacterias y la presencia de iones Ca 2+ o Mg 2+ en el medio de cultivo.
Específicamente, muchos fagos tienen requerimientos definidos de cationes (Storms y
cols., 2009), es así como los fagos T1, T3 y T4 aumentan la tasa de adsorción en
presencia de cationes monovalentes como Na+ y K+. Puck y cols. demostraron que la
presencia de Ca 2 +, Mg 2+ o Mn 2+ mejora la adsorción en mayor medida que Na+ y K+ al
utilizar el fago T1 como modelo de los fagos T. Sin embargo esta mejoría es
concentración dependiente, ya que a bajas concentraciones ( 1x1 o-3 M) se incrementa la
velocidad de adsorción, mientras que concentraciones altas (O, 1 M) inhiben este proceso.
Este efecto dual se debe en la estabilización electrostática que generan los cationes entre
la carga neta negativa del fago y de la bacteria (Puck y cols., 1950). Similar es el caso del
fago le, donde la máxima concentración de complejo fago-receptor se obtiene en
presencia de cationes divalentes (Mg 2 +, Mn 2 +, Ca 2 +) entre 1x10-3 y 2x10-3 M (Gárces y De
Vidania, 1984). Los datos obtenidos a partir del crecimiento de Aab~01 indican que la
adsorción se ve favorecida por la presencia de Ca 2+ o Mg 2 +, este efecto podría estar dado

73
 DiSCUSIÓN

por la estabilización del DNA en el interior de la cápside del fago, por el control en la
penetración eficiente del DNA en el interior de la bacteria (Sechaud y cols., 1988) y por el
un efecto estabilizador entre las proteínas del fago y la carga negativa neta presente en la
membrana de la bacteria (Puck y cols., 1951 ). Al igual que otros fagos el efecto de
cationes en el medio de cultivo no optimiza la lisis por parte de Aab~01. Estos resultados
indican que existe un efecto en la eficiencia de adsorción (definida como la fracción que
se adsorbe irreversiblemente a la bacteria), pero no en el tiempo de lisis. La eficiencia de
adsorción parece ser una propiedad inherente a la población de fagos en función del
medio ambiente, mientras que la tasa de adsorción es una propiedad que puede ser
significativamente influenciada por las condiciones del hospedero (Storms y cols., 2009).

Una vez que el material genético del fago es inyectado al interior de su hospedero,
una serie de eventos moleculares se llevan a cabo. Estos involucran el secuestro de la
maquinaria metabólica celular con el fin de sintetizar una nueva progenie viral. En este
ciclo de vida intracelular se observó que el período de latencia y el período de auge de
Aab~01 tienen valores más altos (4,5 y 5 h, respectivamente) que los que
tradicionalmente se encuentran en la familia Siphoviridae (Maniloff y Ackermann, 1998), lo
que no es de extrañar, ya que se ha demostrado que estos parámetros están muy
influenciados por la tasa metabólica de la bacteria hospedera. Por otro lado, el burst size
(400 UFP por célula infectada) se encuentra dentro del rango normal de la familia
Siphoviridae (Maniloff y Ackermann, 1998). El único reporte acerca del ciclo de vida de un
bacteriófago para A. actinomycetemcomitans corresponde al fago ~Aa17, en donde la
curva de crecimiento de este fago indicó que el fago tiene un período de latencia de
alrededor de 30 min y un burst size de 435 UFP por célula (Steven y cols., 1982).

4.2 Aislamiento y caracterización bacteriófago Fnpcp11

Al contrario de lo reportado para A. actinomycetemcomitans, sólo existen dos artículos

en la literatura de fagos para especies de Fusobacterium que habitan la cavidad oral. Uno
de estos bacteriófagos denominado FnP1 es específico para F. necrophorum y fue aislado
desde fluidos de rumen bovino. Entre las características reportadas para este fago están
que presenta una simetría binaria y que posee DNA como material genético (Tamada y
cols., 1985). F. necrophorum es un Gram negativo, anaerobio estricto que frecuentemente
se puede aislar desde la flora normal de la cavidad oral, como desde infecciones de la
mucosa oral, tracto gastrointestinal y genitourinario de humanos (Kaur y Falkler, 1992). Es
también conocido como un patógeno de animales causando abscesos y lesiones

74
 DISCUSIÓN

necróticas en diversas especies (Tamada y cols., 1985). Sin embargo, a pesar de ser
aislada desde pacientes con periodontitis, está relacionada con el desarrollo de abscesos
y lesiones endodónticas primarias, particularmente en el canal radicular, y no con el
desarrollo y progresión de esta enfermedad (Gomez y cols., 2004; Jacinto y cols., 2008).

Un segundo trabajo describe a un fago específico para F. nucleatum, denominado

Fnp<j>02, el cual presenta como características ser un fago temperado, tener una simetría
binaria, un genoma de DNA doble hebra de 56 Kpb y pertenecer a la familia Siphoviridae
(Machuca y cols., 2010). Fnp<j>02 es el primer fago descrito que infecta F. nuc/eatum. El
fago descrito en esta Tesis, denominado Fnp<j>11, comparte el rango de hospedero con
Fnp<j>02, ya que ambos son capaces de infectar distintas subespecies de F. nuc/eatum,
pero presenta una serie de características que lo diferencian de Fnp<j>02. En primer lugar
Fnp<j>11 corresponde a un fago lítico, lo que permitiría utilizarlo como terapia
antimicrobiana contra la enfermedad. Desde el punto de vista estructural, ambos fagos
comparten una simetría binaria, pero Fnp<j>11 se clasificó como un bacteriófago de la
familia Podoviridae debido a la presencia de colas cortas. Desde el punto de vista
genético, si bien ambos fagos tienen genoma de DNA doble hebra el tamaño de Fnp<j>11
es mayor y fue calculado en aproximadamente 130 Kpb.

El análisis del genoma de Fnp<j>11 indicó que el contenido G+C es similar al reportado
para F. nucleatum y el análisis de las secuencias mostró la presencia de varias enzimas
involucradas en la replicación y en la protección de su material genético. Estos hallazgos
explicarían lo restrictivo del genoma al corte con enzimas de restricción. Todos estos
datos permiten afirmar que FnM11 es un nuevo bacteriófago y es el primer reporte de un
fago lítico para la especie F. nucleatum.

Los datos obtenidos a partir del crecimiento de Fnp<j>11 indican que este fago en el
medio BHI tiene una rápida interacción con la bacteria, ya que luego de 1 min de
incubación el porcentaje de fagos libres disminuye en más de un 95%. La adición de
cationes al medio de cultivo parecería favorecer la interacción fago-bacteria, sin embargo
debido a la rápida adsorción del mismo se dificulta la medición en tiempos menores. Estos
resultados indican que al igual que Aab<j>01 existiría un efecto en la eficiencia de
adsorción, pero no en la velocidad o tasa de adsorción, ya que ésta no se ve alterada. En
relación a los parámetros del ciclo de vida de Fnp<j>11, se observó que el período de
latencia y el período de auge tiempos tienen valores más altos que el observado para el

75
 DISCUSIÓN

fago Aab~01 (6 h y 16 h, respectivamente), lo cual se relacionaría con la menor tasa

generacional de esta bacteria (Maniloff y Ackermann, 1998). Además estos períodos se
correlacionan directamente con los tiempos observados para que la lisis de la bacteria sea
observable (medible) al infectar una curva de crecimiento (7-8 h aproximadamente). Por
otro lado, el período de eclipse resultó ser muy similar al período de latencia indicando
que el proceso de lisis por parte del fago es muy eficiente. El burst size de sólo 1O fagos
por célula infectada puede ser explicado por la eficiencia en la lisis por parte de este virus.
Al contrastar estos resultados con la literatura, el único reporte del ciclo de vida de un fago
para la especie F. nuc/eatum corresponde a Fnp~02, el cual tiene un burst size de 100
UFP por célula infectada (Machuca y cols., 2010), esta mayor cantidad de fagos se
relacionaría con el hecho de que el período de eclipse de este fago fue 8 h menor que el
período de latencia (Machuca y cols., 2010), lo que le permitiría generar una mayor
cantidad de partículas virales viables en el intracelular antes de producir la lisis de la
pared bacteriana.

4.3 Enfermedad periodontal y fagoterapia

Dentro del complejo naranjo, la especie Fusobacterium nucleatum se considera uno

de los más importantes en cuanto al desarrollo y progresión de la enfermedad, ya que
tiene la capacidad de actuar como "puente", permitiendo el establecimiento de otros
patógenos periodontales (Kolenbrander y London, 1993). Un estudio realizado por nuestro
laboratorio demostró que al analizar mediante PCR convencional F. nuc/eatum está
presente en el 90% de los casos y en más del 80% cuando se analiza la ca-detección de
F. nuc/eatum y P. gingivalis, T. dentico/a, T. forsythia o A. actinomycetemcomitans (Mujica
y cols., 201 0). Adicionalmente, A. actinomycetemcomitans es otra bacteria que ha sido
involucrada en la progresión de la enfermedad periodontal (Socransky y cols., 1988;
Socransky y cols., 2005). Esta bacteria se ha aislado de la cavidad oral en el80-100% de
los casos con periodontitis agresiva y en el 25-50% de otros casos como adultos con
periodontitis crónica e incluso desde individuos sanos (Barretto y col.s, 1997; Fine y cols.,
2006; Hamlet y cols., 2001; Resch y cols., 2004; Suda y cols., 2003). Estos estudios
sugieren que ambas bacterias jugarían un rol fundamental en el inicio y progresión de la
enfermedad por lo que su biocontrol se hace necesario.

En este contexto los fagos Fnp~11 y Aab~01 aislados en esta Tesis infectan
específicamente a F. nuc/eatum y A. actinomycetemcomitans, respectivamente, por lo
tanto, un posible uso clínico de este agente antimicrobiano no afectaría a la flora normal

76
 DISCUSIÓN

del hospedero. Además Aab~01 es altamente selectivo al infectar al serotipo b, pero no al

serotipo c. Los serotipos a, b, e y f son encontrados con mayor frecuencia en la cavidad
oral que los serotipos d y e (Kawamoto y cols., 2009; Nakano y cols., 2007; Yang y cols.,
2005). El serotipo b se asocia frecuentemente con el desarrollo de periodontitis agresiva
(Asikainen y cols., 1991; Kawamoto y cols., 2009, Saarela y cols., 1992), mientras que el
serotipo e comúnmente se ha asociado con un estado de salud oral (Kawamoto y cols.,
2009; Rylev y Kilian, 2008). Sin embargo, se han observado diferencias en la distribución
de los serotipos en la población mundial. Esta diferencia estaría relacionada con los
diversos factores implicados en el desarrollo de la enfermedad periodontal, como los
factores ambientales y del hospedero (Fine y cols., 2007, Haubek y cols., 1997a, Rylev y
Kilian, 2008, Teixeira y cols., 2006). Por lo tanto el posible uso de Aab~01 contra la
periodontitis agresiva no sería universal. A pesar de esta desventaja Aab~01 podría ser
utilizado como un método rápido de laboratorio para diferenciar los serotipos b y c.

Al evaluar la capacidad del fago para eliminar a A. actinomycetemcomitans se observó

que éste no fue capaz de eliminar completamente el cultivo bacteriano. Con el fin de
encontrar una partícula viral con una mejor eficiencia en la infección, Aab~01 fue mutado
al azar y se obtuvo una partícula mutante denominada Aab~01-1. Esta partícula fue más
eficaz, ya que redujo la población bacteriana un 50% más que Aab~01. Esta mejora no
está relacionada con la generación de una partícula viral lítica o con la generación de una
mutante en los mecanismos de inmunidad (exclusión de la superinfección), ya que
Aab~01-1 se integra al genoma y los lisógenos son resistentes a la reinfección por
Aab~01-1. Más estudios, incluyendo la comparación de secuencias entre los genomas de
ambos fagos, se requieren para determinar de manera concluyente cual es la causa de
esta mejoría. Sin embargo esta mayor capacidad podría estar relacionada con una mayor
tasa de adsorción o una mayor tasa de replicación de los fagos en el hospedero
bacteriano. Diversos estudios indican que un aumento desmedido en la tasa de adsorción
influye negativamente en el fitness del fago, ya que podría determinar un tiempo de lisis
corto (período de latencia) y con ello un menor burst size (Shao y Wang, 2008). Es así
como las cepas que tienen un tiempo de lisis intermedio tiene el mayor fitness, indicando
la existencia de tiempo de lisis óptimo (Wang, 2006).

El control de enfermedades asociadas a la placa dental se ha basado tradicionalmente

en la remoción no específica de la placa por medios mecánicos. En general se cree que
las estructuras tipo biopelícula son resistentes a muchas condiciones de estrés,

77
 DISCUSIÓN

incluyendo al uso de agente antimicrobianos como antibióticos y bacteriófagos (Costerton

y cols., 1995; Fux y cols., 2005). Sin embargo, varios estudios han demostrado que los
fagos de hecho pueden infectar a la biopelícula en un entorno experimental (Corbin y
cols., 2001; Doolittle y cols., 1995), lo que sugiere que este fenómeno probablemente se
produce en la naturaleza.

El ciclo de vida de un fago que infecta la biopelícula sigue las mismas tres etapas
descritas anteriormente: (1) adsorción a las bacterianas embebidas en la matriz, (2) la
producción de la progenie del fago, y (3) la liberación o difusión, de los fagos recién
liberados desde el foco de infección hasta otro sitio de la biopelícula. Desde el punto de
vista del fago, la diferencia más importante entre la infección de un cultivo de vida libre o
planctónico y el ambiente al interior de la biopelícula o bentónico, sería el número de
células que potencialmente pueden encontrarse en sus inmediaciones. Dependiendo de
las especies bacterianas y los sustratos disponibles se ha demostrado que la densidad
bacteriana varía desde 105 a 108 UFC/cm 2 , con un rango de espesor de decenas a cientos
de micras (Gallet y cols., 2009; Jackson y cols., 2001; Stoodley y cols., 2001). Mediante la
conversión en base a la unidad volumétrica, se ha establecido que la densidad celular al
interior de la biopelícula, en la mayoría de los casos, excede las 10 9 UFC/mL, una
concentración mayor a lo que comúnmente se encuentra en un cultivo líquido (Gallet y
cols., 2009). Esta característica permitiría que los fagos encuentren con mayor
probabilidad a su bacteria blanco al interior de la biopelícula y explicaría el hecho que en
todos los casos los fagos utilizados en este Tesis fueron capaces de replicarse al interior
de la biopelícula.

Además muchos fagos producen enzimas capaces de degradar polisacáridos. Estos

polisacáridos de superficie son a menudo el primer contacto entre el fago y la bacteria
hospedera y pueden actuar como una barrera física que impida que el fago tenga acceso
al receptor de membrana con ello previniendo la infección (Bernheimer y Tiraby, 1976;
Forde y Fitzgerald, 2003). Si bien los fagos Aab~01, Fnp~02-14 y Fnp~11 no evidenciaron
una actividad exopolisacaridasa esto estaría relacionado con que la mayoría de los fagos
capaces de degradar polisacáridos corresponden a fagos líticos y tienen una morfología
consistente con la familia Podoviridae (Adams y Park, 1956).

Para muchas bacterias la formación de una biopelícula es un factor importante en la

patogénesis de la misma, particularmente en aquellas bacterias involucradas en
infecciones persistentes como Pseudomonas aeruginosa. Fu y cols. demostraron que la

78
 DISCUSIÓN

aplicación de un "coctel" de fagos sobre la superficie de implementos médicos disminuye

la formación de biopelícula por parte de esta bacteria (Fu y cols., 201 O). Otro estudio
realizado por Smith y Huggins demostró que la aplicación de fagos con actividad endo-N-
acetilneuraminidasa contra cepas K1 de E. colí fueron capaces de eliminar la infección en
ratones y fueron más efectivos que la aplicación de 8 dosis de tetraciclina, ampicilina o
trimetopina más sulfafurazol (Kwiatkowski y cols., 1982; Smith y Huggins, 1982). Estos
hallazgos indican que el uso de bacteriófagos es una herramienta útil para el tratamiento
de enfermedades que involucran bacterias con capacidad de sintetizar exopolisacáridos.
Este hecho fue corroborado al evaluar la capacidad antimicrobiana de Aab<jl01 y Aab<jl01-1
en una biopelícula simple de A. actinomycetemcomitans, observándose que ambos fagos
son capaces de eliminar a la bacteria por lo que la biopelícula no fue un obstáculo para
que los fagos alcanzaran su objetivo. Al realizar el mismo análisis con F. nuc/eatum se
observó que el fago Fnp<jl11 fue capaz de eliminar completamente a la bacteria al interior
de la biopelícula indicando que estos fagos serían útiles en un eventual uso terapéutico.

Del mismo modo que una terapia antibiótica puede llevar a la generación de bacterias
resistentes, el uso de otras terapias antimicrobianas, incluyendo a los fagos, puede
conducir a la selección de bacterias resistentes a dichas terapias. Es por esta razón que
uno de los principios de la fagoterapia es incluir es sus preparados un "pool" de fagos con
el fin de disminuir la probabilidad de aparición de mutantes (Fu y cols., 201 0). Esto radica
en que la probabilidad de que se den dos mutaciones a la vez en una misma bacteria es
menor a que se den los mismos eventos por separado. Tomando como ejemplo los fagos
Fnp<jl11 y Fnp<jl02-14, los cuales tienen tasas de reversión de 2,56 x1 o-s y 1,96 x1 o-s
(datos del laboratorio no publicados), respectivamente, la probabilidad de encontrar a una
bacteria que sea espontáneamente resistente a la acción conjunta de estos fagos sería de
1 por cada 1,99 x10 15 bacterias. Tomando en cuenta que la densidad bacteriana al interior
de una biopelícula bordea las 10 9 - 10 10 UFC/ml (Gallet y cols., 2009) la posibilidad de
encontrar una bacteria resistente a ambos fagos es prácticamente nula.

Uno de los principales problemas al intentar reproducir la placa dental in vitro es que
muchas de las bacterias pertenecientes a esta placa dental no son cultivables.
Recientemente, Tian y cols. desarrollaron diferentes medios de cultivo en los cuales
inocularon saliva y luego de la incubación analizaron la microflora presente a través de
denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE, Tian y cols., 2010). En base a este trabajo
y los componentes de los medios de cultivos allí diseñados, se realizó una modificación

79
 DISCUSIÓN

para crear el medio CMT el cual presenta como característica tener una mezcla de los
componentes de los medios ahí reportados. De esta manera se puede obtener una
biopelícula dental lo más cercana a la realidad. El sólo análisis macro y microscópico da
cuenta de alrededor de 1O especies distintas, sin embargo un análisis que incluya
metagenómica es necesario para determinar la naturaleza de todas las especies
presentes, incluyendo las no cultivables. Al observar la infección de la biopelícula
compleja generada en este medio, con las diferentes mezclas de fagos se pudo observar
que los fagos son menos efectivos que en biopelículas simples, ya que en conjunto los
fagos Fnp~02-14 y Fnp~ 11 con un MOl de 1:1 O eliminan aproximadamente el 85% de F.
nuc/eatum al interior de la biopelícula, mientras que en una biopelícula simple en una
misma concentración Fnp~11 eliminaba completamente el cultivo bacteriano y Fnp~02-14
eliminaba a más del 95% de las bacterias presentes. De igual forma el fago Aab~01-1,

sólo eliminó al 45% de A. actinomycetemcomitans al interior de la biopelícula mixta,

mientras que en una biopelícula simple eliminaba a más del 99% de las bacterias. Esta
disminución en la efectividad podría ser explicada por dos factores: (i) la existencia de un
intrincada red de distintos exopolisacáridos sintetizados y secretados por la comunidad
bacteria, retardarían el acceso de los fagos a sus bacterias hospederas y (ii) la existencia
de bacterias facultativas (principalmente cocáceas Gram positivo) con un menor tiempo
generacional disminuirían la velocidad de crecimiento de las bacterias en estudio,
disminuyendo con ello su metabolismo, la densidad de su población y afectando a la
proliferación de los fagos.

En resumen estos resultados sugieren que a pesar de que los fagos Aab~01 y
Aab~01-1 son capaces de eliminar a su hospedero desde la biopelícula es necesario
generar una partícula viral lítica de forma de no generar un lisógeno que tenga una mayor
virulencia. Por otra parte tanto el fago Fnp~11 como Fnp~02-14 son capaces de eliminar a
F. nucleatum desde la biopelícula y presentan dos características que los hacen buenos
candidato para ser utilizados como agentes antimicrobianos: corresponden a fagos líticos
y tiene un espectro de acción reducido sólo a las subespecies de F. nucleatum.

Los resultados expuestos en esta Tesis indican que la utilización de fagos contra
bacterias pertenecientes a la placa dental como A. actinomycetemcomitans y F.
nucleatum, es posible y su utilización in vivo debe ser probada con el fin de establecer
una terapia complementaria a las terapias convencionales.

80
 CONCLUSIONES

5. C ONCLUSIONES

- Se aisló y caracterizó un nuevo bacteriófago específico para Aggregatibacter

actinomycetemcomitans serotipo b, denominado Aab<j>01.

- Aab<j>01 es un fago temperado, presenta una simetría binaria y un material genético de DNA

doble hebra de 30 Kpb.

- Aab<j>01 es un fago perteneciente al orden Caudoviral y a la familia Siphoviridae.

- Se aisló y caracterizó un nuevo bacteriófago específico para Fusobacterium nucleatum,

denominado Fnp<j>11.

- Fnp<j>11 es un fago virulento, presenta una simetría binaria y un material genético de DNA

doble hebra de 130 Kpb.

- Fnp<j>11 pertenece al orden Caudoviral y a la familia Podoviridae.

- La partícula viral mutante Aab<j>01-1 es más eficiente en el proceso de infección que Aab<j>01

- Aab<j>01-1 elimina al 99% de Aggegatibacter actinomycetemcomitans cuando éste se

encuentra formando una biopelícula simple.

- Aab<j>01-1 elimina al 50% de Aggegatibacter actinomycetemcomitans cuando éste se

encuentra al interior de una biopelícula mixta.

- Fnp<j>11 elimina completamente a Fusobacterium nuc/eatum al interior de una biopelícula

simple.

- El uso conjunto de los fagos Fnp<j>1 1 y Fnp<j>02-14 eliminan al 90% de Fusobacterium

nucleatum al interior de una biopelícula mixta.

81
 BIBLIOGRAFÍA

6. BIBLIOGRAFÍA

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actinomycetemcomitans serotypes to periodontal condition: prevalence and
proportions in subgingival plaque. Eur J Oral Sci 2005; 113: 28-33.

93
 ANEXO

Caracterización del bacteriófago Aab~01 de Aggregatibacter actinomycetemcomitans

Castillo-Ruiz M, Machuca P, irarrazávai J, Mujica Tmncoso C, Biti:ner M, XXXIII Congreso
Chileno de Microbiología, 29-02 de Diciembre, 2011, Oimué, Chile

isoiation and Characterization of a Novel Bacteriophage for Aggregatibater

actinomycetemcomitans. C®$~~~~©-~lUIÜ&:: IMII, Montt C, Bittner M. XXIII Reunión anual IADR,
División Chi!e, 7-9 Octubre 2010, Valdivia, ChHe.

Novel lytic bacteriophage eiiminate peridontopathogen Fusobacterium nucleatum

forming biofilms. Machuca P, C©1$~~i~©-~lUIÜ&: !!\fU, Bittner M. XXm Reunión anual IADR, División
Chile, 7-9 Octubre 2010, Vaidivia, Chile.

Aislamiento y caracterización de un bacteriófago para Aggregatibacter

actinomycetemcomitans, un periodontopátogeno asociado a la periodontitis agresiva.
Machuca P, C<iil~t~~~©-~lUIÜ&:: ~ y Bittner M. XXX Congreso Chileno Microbiología X! Congreso
Chileno de Inmunología, 4-6 de Diciembre, 2008. Concepción, Chile.

Ca$tm©-~lUiü&: ~. Vinés ED, Montt C, Fernández J, Oeigado JM, Hormazábal JC,

Bittner M (2011) . lsoiation of a Novel Bacteriophage for Aggregatibacter
actinomycetemcomitans serotype b capabie to iyse bacteria within a biofilm. Appl. Environ.
Microbio!. 77(9):3157-9 (iSi).

Mujica Troncoso C, C@l$~~~~©-~lUIÜ&: WU, Dame LK, Fuenievilla lA, Bittner M (201 0). Co-
detección de patógenos peridontaies en pacientes chilenos con periodontitis crónica Rev.
Clin. Periodoncia Implanto!. Rehabil. Oral VoL 3(3) :1 18-22 (SciELO).

94