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BREVE HISTORIA DE LA RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR

Bloch, Hansen y Packard, de Stanford (1), y Purcell, Torrey y Pound, de Harvard (2), informaron por
primera vez en 1946 sobre la RMN en materiales a granel. En 1952 se reconoció la importancia de
su descubrimiento cuando se concedió el Premio Nobel de Física a Bloch y Purcell. En los últimos
40 años, la espectroscopia de RMN se ha convertido en una importante herramienta de la química
analítica, un valioso método para estudiar fenómenos físicos que van desde la cinética hasta la
superconductividad, una técnica de biología estructural que rivaliza con la cristalografía de rayos X,
un procedimiento rutinario de obtención de imágenes en radiología de diagnóstico, una forma de
estudiar la función metabólica en humanos y animales, y un método en evolución en la ciencia de
los materiales. Las continuas mejoras en los instrumentos y técnicas de RMN están fomentando
nuevas e importantes aplicaciones. Un reconocimiento reciente de la importancia de los métodos
de RMN fue la elección de Richard Ernst como Premio Nobel de Química en 1991 por su trabajo en
el desarrollo de la espectroscopia de FT-NMR y sus derivados.

En este INFORME se analiza el desarrollo general de la RMN y algunos de los principales hitos de
su historia. En el limitado espacio disponible, no puedo ser exhaustivo en la presentación del tema
ni dar crédito a todos los investigadores que han sido pioneros en los avances de los métodos de
RMN y sus aplicaciones a la física, la química, la biología y otras ciencias. He incluido los nombres
de unos 40-50 individuos para personalizar la historia de la RMN, pero podrían haberse
seleccionado igualmente muchos otros nombres. Se dan algunas referencias a publicaciones
innovadoras, pero muchas de las citas bibliográficas se refieren a libros o artículos de revisión. (Se
ha previsto una historia mucho más completa como parte de la Enciclopedia de la RMN, que se
está preparando para su publicación en 1995 [3]). Aunque el desarrollo de la RMN es, por
supuesto, continuo, es útil dividir la historia en décadas, empezando por las primeras
publicaciones en 1946. Pero debemos empezar con un poco de información sobre los primeros
años.

La prehistoria: 1926-45

Los conceptos de espín y momento magnético del electrón se habían establecido firmemente a
principios de la década de 1920 mediante una serie de estudios, especialmente el experimento de
Stern-Gerlach, en el que se separaron haces de átomos en un campo magnético no homogéneo
según la orientación del momento magnético del electrón. A mediados de la década de 1920 se
hizo evidente que muchas características de los espectros atómicos sólo podían explicarse si
ciertos núcleos atómicos poseían igualmente un espín y un momento magnético. Los
perfeccionamientos del experimento de Stern-Gerlach verificaron este concepto en 1933.

En 1939, Rabi et al. (4) introdujeron una importante mejora en las técnicas de los haces al enviar
una corriente de moléculas de hidrógeno no sólo a través del campo magnético inhomogéneo
necesario para la desviación, sino también a través de un campo magnético homogéneo, en el que
fueron sometidas a energía electromagnética de radiofrecuencia (rf). Las moléculas absorbieron
energía a una frecuencia muy definida, y la absorción provocó una desviación pequeña pero
medible del haz. Esta fue la primera observación de la RMN, y Rabi recibió el Premio Nobel en
1944. Sin embargo, estos estudios se limitaban a los núcleos de las moléculas pequeñas bajo un
vacío muy alto en un haz molecular, cuya desviación servía para detectar la resonancia

La contribución de los momentos magnéticos nucleares a la susceptibilidad magnética de la masa

se había demostrado en 1937 para el hidrógeno a baja temperatura (alrededor de 2 K), pero este
enfoque tenía limitaciones (5). En 1936 Gorter intentó sin éxito observar la resonancia magnética
en el LiF sólido y otras sales inorgánicas detectando el calor producido cuando se absorbía la
energía de rf resonante. En 1942 volvió a intentarlo, esta vez buscando una dispersión anómala del
campo de rf (6). El fracaso de estos intentos se debió en gran medida a la desafortunada elección
del LiF, que tiene un largo tiempo de relajación, como muestra.

Década del descubrimiento: 1946-55

adoptó un enfoque diferente. Sabía que, aplicando energía de rf, la magnetización nuclear
macroscópica podía girar fuera de su posición de equilibrio paralela al campo magnético aplicado
(Figura 1). A partir de las leyes de la física, sabía que esta magnetización desplazada precesaría
alrededor del campo magnético a una frecuencia bien definida. Bloch pensó que esta
magnetización en precesión induciría una señal eléctrica en una bobina de cobre colocada
adecuadamente a esta frecuencia, que se encuentra en el rango de rf. Bloch, Hansen y Packard (1)
probaron el experimento con una muestra de agua. Funcionó, y nació la RMN (o inducción
nuclear, como la llamó Bloch). Mientras tanto, Purcell, Torrey y Pound habían sido capaces de
medir directamente la pequeña absorción de energía rf por los momentos magnéticos de los
protones en un bloque de parafina (2). Aunque su experimento era bastante diferente del de
Bloch, se trata de los mismos fenómenos y los dos enfoques funcionaron igualmente bien.
Curiosamente, Bloch y Purcell no se conocían en el momento en que aparecieron sus artículos, con
sólo unas semanas de diferencia. Los primeros días de la RMN debieron ser apasionantes: se
dilucidaron los principios básicos y se exploraron las aplicaciones del nuevo método. La
construcción de imanes lo suficientemente homogéneos y estables como para permitir la
observación de resonancias nucleares razonablemente estrechas en los líquidos fue una proeza.
Asimismo, se realizó un gran esfuerzo en el diseño y la construcción de circuitos electrónicos a
partir de los componentes primitivos entonces disponibles para detectar la débil señal de RMN en
presencia del inevitable ruido eléctrico generado por la temperatura. El rápido desarrollo de la
RMN debe mucho a la temprana decisión de Russell Varian de producir un sistema comercial
basado en un electroimán homogéneo. Los investigadores podían comprar un sistema básico y,
aunque tuvieran que modificarlo, no tenían que construir imanes y amplificadores desde cero. Los
primeros trabajos de Bloembergen, Purcell y Pound (7) explicaban los conceptos de relajación
nuclear y mostraban por qué las señales de RMN de los sólidos son órdenes de magnitud más
amplias que las de los líquidos, donde el rápido movimiento browniano molecular hace que las
interacciones magnéticas nucleares dipolo-dipolo se promedien hasta cero. A medida que
mejoraba la homogeneidad del imán, las líneas de resonancia de los líquidos se hacían cada vez
más estrechas, lo que permitía una medición más precisa de las frecuencias de resonancia.

La relación básica de RMN es

ω= ϕβnuclear
donde la frecuencia de resonancia ω depende de la relación magnetogénica γ (una propiedad del
núcleo) y del campo magnético aplicado al núcleo B" 3. Se preveía que un núcleo dado mostraría
la misma frecuencia a un valor fijo del campo magnético aplicado, independientemente del
compuesto químico en el que residiera el núcleo. Sin embargo, en 1949 y 1950, las observaciones
de las señales de 1 9F y 3 1P mostraron variaciones en la frecuencia que estaban más allá del error
experimental (todavía bastante grande). Así, se postuló que las propiedades magnéticas de los
electrones que rodean al núcleo proporcionan un apantallamiento σ del campo magnético
aplicado Bα

donde el valor de σ depende de la densidad y la configuración de los electrones. Este

desplazamiento de la frecuencia de resonancia con respecto a lo previsto se denominó
desplazamiento químico. Al principio fue una molestia para los físicos, que se dieron cuenta de
que los desplazamientos químicos limitaban la precisión de sus mediciones de las relaciones
magnetogénicas, pero resultó ser la piedra angular para aplicar la RMN a la química.

El desplazamiento químico para el 1H se demostró sólo después de nuevas mejoras en la

homogeneidad y la estabilidad de los campos magnéticos, porque -como sabemos ahora- el rango
de blindajes para los protones es órdenes de magnitud más pequeños que el rango de blindajes
para otros núcleos. En 1951, la espectacular demostración del desplazamiento químico del *H en
el etanol {8) (Figura 2) dejó claro a los químicos lo que la espectroscopia de RMN podía hacer
como método analítico.

Mientras tanto, nuevas mejoras en la resolución revelaron que incluso las resonancias desplazadas
químicamente eran, en muchos casos, colecciones de líneas de resonancia separadas. Cuando los
análisis de Gutowsky y McCall (9) indicaron que los espines de los núcleos vecinos eran los
responsables de estas líneas múltiples, hubo que construir un nuevo mecanismo, porque se sabía
que las interacciones magnéticas dipolares tienen un promedio de cero en las moléculas que giran
rápidamente. Así se concibió el concepto de acoplamiento indirecto espín-espín o acoplamiento
escalar (10). Poco después, se descubrió que algunos acoplamientos de espín (como en el grupo
OH del etanol) no producían los multipletes esperados y se desarrolló la idea del intercambio
químico.

El procedimiento estándar para observar una línea de resonancia consistía en variar la frecuencia
(o, más comúnmente, la intensidad del campo magnético) a través de la condición de resonancia,
mostrar la desviación en un osciloscopio y registrarla. Este método de onda continua (cw) siguió
siendo el estándar durante muchos años porque permite la observación secuencial de cada una de
las muchas líneas de resonancia de un espectro. Sin embargo, la representación fiel de la forma de
las líneas requiere un paso lento a través de la resonancia, por lo que se necesita una mayor
estabilidad del instrumento y varios minutos para completar una exploración.

Bloch sugirió un método alternativo de excitación utilizando un pulso corto de rf (11). En 1949
Hahn demostró que este procedimiento producía efectivamente una señal de precesión libre.
Además, demostró que las secuencias de pulsos podían utilizarse para generar información
adicional en forma de eco de espín (12). Los métodos de pulsos empezaron a utilizarse, en gran
parte por los físicos, para estudiar sistemas con una sola línea, como la línea ancha de una muestra
sólida. Sin embargo, durante muchos años el método fue poco útil para los químicos debido a la
complejidad de la señal de decaimiento por inducción libre (FID) obtenida tras el pulso de
excitación.

Década de aplicaciones químicas: 1956-65

A mediados de la década de 1950, se habían dilucidado la física básica de la RMN y su valor

potencial en la química, y se disponía de instrumentos comerciales. Los instrumentos eran muy
primitivos en comparación con los estándares actuales. En 1956, la frecuencia de observación para
la espectroscopia de RMN de 1H era sólo de 40 MHz, fijada por un cristal a una frecuencia
específica. El campo del electroimán se estabilizaba independientemente de la rf mediante
grandes tubos de vacío que controlaban la corriente y mediante un bucle de retroalimentación del
recién inventado "superestabilizador". El imán tenía que ajustarse para conseguir una
homogeneidad óptima colocando finas cuñas metálicas detrás de las piezas polares y apretando el
conjunto con una enorme llave inglesa. (El término "calzas de campo" aún persiste y se entiende
como optimización de la homogeneidad. Sin embargo, hoy en día, la homogeneidad del imán se
ajusta variando las corrientes eléctricas en bobinas que se colocan junto al imán). La exploración
del campo magnético a través de la gama de resonancias de 1H solía durar entre 5 y 10 minutos,
tiempo suficiente para evitar graves distorsiones en la forma de las líneas. El escaneo no podía
durar más, porque la deriva aleatoria del campo magnético podría convertirse en un factor
dominante. De hecho, debido a la deriva del campo, cada espectro tenía que calibrarse por
separado y a menudo se utilizaba la media de varios escaneos para mejorar la precisión. La
obtención de espectros de RMN era un trabajo que requería mucho tiempo para un especialista en
instrumental. Pero la recompensa por obtener un buen espectro era grande. Los químicos
orgánicos pronto descubrieron que la espectroscopia de RMN era una técnica ideal para dilucidar
o verificar la estructura de moléculas de tamaño moderado. Casi todos los compuestos de la
estantería ofrecían datos nuevos e interesantes. Cada mes, Varian publicaba una serie de anuncios
llamados "NMR at Work" en el Journal of the American Chemical Society, en los que se mostraban
nuevas aplicaciones de la espectroscopia de RMN. Los químicos orgánicos y la nueva generación
de espectroscopistas de RMN esperaban estos anuncios con la misma ilusión que los artículos de
investigación. El clásico artículo de Shoolery y Rogers (13) en 1958 demostró la utilidad de la
espectroscopia de RMN en el estudio de los esteroides. Incluso a 40 MHz, los espectros de RMN de
1H mostraron que los desplazamientos químicos de los grupos metilo angulares tienen valor
diagnóstico. Otros trabajos realizados más o menos en la misma época mostraron la riqueza de
información que podía obtenerse de los espectros de RMN de alcaloides, azúcares, porfirinas y
otros compuestos. Pronto Karplus (14) demostró que los acoplamientos escalares de tres enlaces
vicinales dependen de los ángulos de enlace, y los estudios de conformación -especialmente en los
azúcares- se hicieron populares. El libro de Jackman (15), de 1959, resumió una gran cantidad de
material sobre las correlaciones entre los espectros de RMN y las características estructurales de
una molécula, y el libro de Roberts (16) proporcionó una descripción sencilla de los principios
básicos que podían ser fácilmente comprendidos por la mayoría de los químicos. También durante
este periodo se hicieron grandes avances en la comprensión del origen de los complejos espectros
que se observaban cada vez más, en los que no son válidas las simples consideraciones de espines
múltiples que interactúan para dar multipletes no complicados. Los tratamientos cuánticos de las
interacciones de espín y las consideraciones de simetría mostraron claramente lo que debíamos
esperar, y se desarrollaron programas informáticos para ayudar en el análisis de los espectros
complejos. El tratado de Pople, Schneider y Bernstein (17) reunió este material, junto con muchos
antecedentes teóricos escritos desde la perspectiva de los químicos. Durante esta década, las
mejoras en el diseño y la construcción de los imanes permitieron aumentar la intensidad del
campo, de modo que la frecuencia de la RMN XH pasó de 40 MHz a 60 MHz y a 100 MHz. Junto
con los avances en la electrónica, el aumento de la intensidad del campo magnético dio lugar a
una mayor sensibilidad y a espectros que, en algunos casos, eran más fáciles de interpretar. Sin
embargo, el mayor avance en la instrumentación fue el espectrómetro Varian A-60. Este
instrumento incorporaba un medio sencillo y práctico para que la señal de RMN mantuviera una
relación constante entre el campo magnético y la rf aplicada a la muestra estudiada. De este
modo, se compensaba la siempre presente deriva aleatoria del campo magnético, y cada espectro
podía obtenerse a una velocidad de barrido conocida. De repente, ¡las cartas de RMN preimpresas
se convirtieron en algo factible! Además, gracias a las mejoras en el diseño, el imán, su fuente de
alimentación y la unidad de agua de refrigeración se redujeron en tamaño: ahora el instrumento
podía caber en un laboratorio de química ordinario, y el coste se redujo. El espectrómetro A-60
realmente llevó la espectroscopia de RMN a las masas (de químicos); se vendieron más de 1.000
instrumentos en todo el mundo antes de que el mercado diera paso a finales de la década de 1960
a instrumentos basados en la electrónica de estado sólido. Hay otros dos avances especialmente
significativos en la metodología de la RMN que merecen ser mencionados. Uno de ellos es la doble
resonancia, en la que se aplican simultáneamente dos campos de RF de frecuencias diferentes:
uno para observar una señal mientras el otro perturba el sistema de espín. El concepto de doble
resonancia se conocía desde hacía muchos años, pero no fue hasta los años 60 cuando se elaboró
la teoría en detalle, principalmente por Baldeschwieler (entonces en Harvard) y por Freeman y
Anderson (entonces en Varian). Se desarrollaron accesorios que permitieron realizar estudios de
doble resonancia con instrumentos comerciales. Se llevaron a cabo numerosas aplicaciones, desde
el simple desacoplamiento de los multipletes de espín hasta las investigaciones detalladas de los
niveles de energía mediante el cosquilleo de espín y los estudios de la conformación molecular
mediante el efecto nuclear Overhauser (NOE), introducido por primera vez en la estereoquímica
orgánica en 1965 (18).

El otro gran avance fue la espectroscopia de RMN de 13C. Debido a su baja sensibilidad inherente
en relación con el Ή y el 1 9F y a la abundancia natural del 13C de sólo el 1,1%, el primer estudio
de la RMN del 13C en una serie de compuestos orgánicos no apareció hasta el clásico artículo de
Lauterbur (19) en 1957. Demostró que los desplazamientos químicos del 13C abarcan un amplio
rango y proporcionan información potencialmente útil. Incluso entonces, poco se pudo hacer de
forma práctica hasta que se aplicaron métodos de doble resonancia para colapsar los multipletes
de espín e introducir mejoras de NOE, que en conjunto aumentaron las intensidades de las señales
hasta el punto de que la observación práctica era factible. El trabajo más extenso en el desarrollo
de la sistemática de la espectroscopia de RMN del 13C y su aplicación a los problemas orgánicos
provino de los laboratorios de Strothers (Universidad de Western Ontario), Roberts (Instituto
Tecnológico de California) y Grant (Universidad de Utah), que obtuvieron instrumentos
especializados optimizados para el estudio de este núcleo "menos receptivo". Wenkert (ahora en
la Universidad de California-San Diego) fue pionero en la espectroscopia de RMN de 13C para la
determinación de la estructura en moléculas más complejas.
Década de la tecnología: 1966-75

Imanes superconductores. Con el desarrollo de los instrumentos de 100 MHz, la tecnología de los
electroimanes con núcleo de hierro se había llevado al límite, ya que el hierro se saturaba cerca de
la intensidad de campo de 2,35 T. Sólo se podía aumentar la intensidad de campo con solenoides
superconductores de baja temperatura. Aunque la tecnología de los materiales superconductores
era bien conocida, se necesitaron grandes esfuerzos para producir un imán de alta intensidad de
campo que fuera capaz de funcionar constantemente con poca o ninguna deriva, que tuviera una
magnífica homogeneidad, que tuviera un volumen lo suficientemente grande para los tubos de
muestra y que estuviera alojado en un Dewar capaz de retener helio líquido y nitrógeno líquido
durante períodos adecuados. Se construyeron varios imanes de este tipo en laboratorios
individuales, pero el primer imán comercial exitoso fue la base del Varian HR-220 en 1966.

Desde entonces, un flujo constante de mejoras en la tecnología de los imanes, encabezado en gran
medida por Richards (Universidad de Oxford) en colaboración con Oxford Instruments y Bruker
Instruments, permitió aumentar la frecuencia de la RMN de Ή a 270 MHz, 360 MHz y 400 MHz.
Hacia 1978 se introdujo un instrumento de 500 MHz. En 1978 se desarrolló en la Universidad
Carnegie Mellon un instrumento de 600 MHz con un imán no persistente y, en 1987, se introdujo
un instrumento comercial de 600 MHz con un imán persistente. En la actualidad, se están
desarrollando sistemas comerciales de 750 MHz. Los imanes superconductores permitieron a los
investigadores dispersar el espectro expresado en unidades de frecuencia y distinguir los
desplazamientos químicos en moléculas grandes que podrían ser casi coincidentes en campos
magnéticos más bajos, facilitando así la interpretación de los espectros de compuestos orgánicos
complejos. Esta mayor dispersión de los desplazamientos químicos, junto con el aumento continuo
de la sensibilidad instrumental, permitió atacar seriamente a los péptidos, oligonucleótidos y otras
moléculas bioquímicas. Ciertamente, moléculas como los aminoácidos y los nucleótidos habían
sido estudiadas a baja intensidad de campo por Jardetzk y (Stanford), Cohn (Universidad de
Pensilvania) y otros en la década de 1950. El primer espectro de RMN de una proteína (un
espectro de 40 MHz que sólo mostraba una amplia envoltura de las más de 800 resonancias
protónicas esperadas) fue comunicado por Saunders, Wishnia y Kirkwood en 1957 (20). Aunque
los espectros de las proteínas desnaturalizadas mostraban líneas nítidas, se podía obtener poca
información estructural útil. Por ello, la mayor parte de los primeros trabajos sobre sistemas
bioquímicos se dirigieron a obtener los parámetros de RMN necesarios para aminoácidos,
péptidos pequeños, mononucleótidos y azúcares simples. Los primeros espectros de proteínas
obtenidos a una intensidad de campo magnético de un muslo utilizando un imán superconductor
fueron comunicados en 1967 por McDonald y Phillips (21). Demostraron que se podía obtener una
mejor resolución utilizando una mayor intensidad de campo, lo que significaba que se podía
obtener información mucho más detallada de dichos espectros. Se descubrió que los cambios de
desplazamiento químico estaban asociados a los cambios de conformación de las proteínas y a la
ionización de los protones al variar el pH. Sin embargo, muchos de estos estudios se limitaron
principalmente al examen de las resonancias de histidina, ya que están muy desprotegidas y se
encuentran en una región espectral relativamente libre. Para seguir avanzando en la
espectroscopia de RMN biológica habría que esperar a dos mejoras tecnológicas.

Espectroscopia FT-NMR.
La sensibilidad adecuada siempre ha sido un problema en la espectroscopia de RMN. A medida
que los investigadores han estudiado muestras diluidas o de cantidad limitada, y que han ampliado
la espectroscopia de RMN a núcleos menos sensibles (como el 13C y el 15N), la relación
señal/ruido se convierte a menudo en el factor limitante para determinar lo que se puede
estudiar. A principios de la década de 1960 se aplicó el promedio temporal coherente a la
espectroscopia de RMN. Dado que Ν escaneos consecutivos grabados en la memoria digital y
sumados coherentemente producen una señal que es Ν veces mayor que un solo escaneo,
mientras que el ruido aleatorio es sólo N1 ' 2 veces mayor, la relación señal/ruido puede
mejorarse gastando más tiempo.

El problema es que los métodos cw requieren un barrido secuencial de frecuencias a una

velocidad lo suficientemente lenta como para evitar la distorsión de las líneas espectrales. Se trata
de un proceso ineficaz, ya que sólo se estudia una estrecha región del espectro a la vez.
Especialmente con el aumento de la dispersión de frecuencias que acompaña a los campos
magnéticos más altos y la extensión de los métodos de RMN a núcleos como el 13C con un gran
rango de desplazamiento químico, podrían ser necesarios muchos minutos para obtener un
espectro. Aunque es aceptable para un solo escaneo, no es factible hacer 10.000 escaneos de este
tipo para mejorar la relación señal/ruido por un factor de 100. Claramente, se necesitaba un
método para excitar todo el espectro simultáneamente. En la espectroscopia óptica e IR, la
excitación y la ventaja multiplex resultante (de Felgett) se obtuvieron utilizando un interferómetro
y la posterior transformación de Fourier de la respuesta temporal. Para la espectroscopia de RMN,
la excitación correspondiente se encontró en un pulso corto de rf. Lowe y Norberg (22)
demostraron en 1957 que el FID que sigue a un pulso de rf podía, en principio, transformarse en el
espectro que se habría obtenido mediante un barrido lento. Pero no fue hasta la publicación del
artículo seminal de Ernst y Anderson (23) en 1966 que el proceso pudo funcionar en la práctica.
Sus estudios iniciales implicaban un largo procesamiento de datos, en el que los FID se sumaban
de forma coherente y luego se convertían mediante cinta de papel, cinta magnética y tarjetas
perforadas en una forma que pudiera procesarse en un gran ordenador digital en un lugar remoto.
Afortunadamente, se estaban desarrollando miniordenadores que podían conectarse
directamente al espectrómetro. El progreso de la espectroscopia FT-NMR debe mucho a estos
ordenadores y a un software bastante fácil de usar. El desarrollo de los métodos de FT-NMR ha
revolucionado realmente este campo. No sólo se pudo mejorar la sensibilidad mediante el
promediado de tiempo de forma práctica, sino que la velocidad del método de FT de pulsos se
pudo explotar de forma alternativa para estudiar procesos rápidos como las reacciones químicas y
los fenómenos de RMN dependientes del tiempo (por ejemplo, la relajación). Las secuencias de
pulsos, como la del eco de espín que se había utilizado sólo para sistemas de una sola línea,
podrían aplicarse ahora a moléculas químicamente interesantes con muchas resonancias. El
estudio de los núcleos menos receptivos, como el 13C, se convirtió en algo habitual.

Además de los avances en la espectroscopia de RMN de los líquidos, los nuevos avances en la
comprensión de las interacciones en los sólidos, especialmente por parte de Waugh (MIT) y Pines
(Universidad de California-Berkeley), permitieron el desarrollo de nuevos métodos de pulso para
estrechar artificialmente las líneas inherentemente amplias de los sólidos. Los métodos de FT
permitieron el estudio de sólidos con líneas desplazadas químicamente. La hilatura de ángulo
mágico, descubierta en 1959, podía utilizarse ahora junto con nuevas técnicas que transferían la
magnetización de una especie nuclear a otra (polarización cruzada) para obtener espectros de alta
resolución del 13C y otros núcleos en sólidos.

Espectroscopia de RMN 2D.

Durante los últimos años de la década, la nueva área más emocionante fue la espectroscopia de
RMN en 2D, en la que se permite que las magnetizaciones nucleares precesen durante un periodo
de tiempo inicial, se aplican varias secuencias de pulsos y se registra un FID. La transformación
bidimensional de Fourier de los dos dominios temporales independientes da lugar a un espectro
que puede visualizarse en dos dimensiones de frecuencia ortogonales. Jeener (Universidad Libre
de Bruselas) originó la idea de la espectroscopia de RMN en 2D en 1971, pero Ernst fue la figura
clave para desarrollarla hasta convertirla en un método práctico y útil a mediados de la década de
1970 (24). A lo largo de los años, se han ideado literalmente cientos de métodos 2D diferentes y
mejoras de los métodos anteriores, cada uno de ellos destinado a correlacionar resonancias a
diferentes frecuencias sobre la base de alguna interacción entre los núcleos responsables de las
resonancias. La espectroscopia de RMN bidimensional es un método muy potente para" asignar
líneas en espectros complejos y para estudiar interacciones mediadas por relajación cruzada,
intercambio químico u otros factores físicos (25).

Década de aplicaciones biológicas: 1976-85

En los primeros 30 años de la RMN se desarrolló un amplio arsenal de equipos y técnicas. Junto
con potentes espectrómetros que utilizaban imanes de alto campo, equipos y programas
informáticos adaptados a las aplicaciones, técnicas de FT bien desarrolladas y métodos en
evolución para la RMN 2D y el estrechamiento de líneas en los sólidos, la espectroscopia de RMN
se utilizó durante esta década para resolver problemas en muchas áreas de la ciencia

Las estructuras de moléculas orgánicas complejas que sólo se habían dilucidado con la tediosa
aplicación de los métodos de doble resonancia podían ahora determinarse de forma sistemática y
eficaz mediante métodos 2D. Los problemas de la química y la física del estado sólido que hasta
entonces no se habían podido resolver con la espectroscopia de RMN ahora se podían resolver con
combinaciones de métodos de estrechamiento de líneas y 2D. Sin embargo, los avances más
importantes se produjeron en las aplicaciones a diversos sistemas biológicos. No sólo se pudieron
realizar estudios de alta resolución de biopolímeros en solución de forma mucho más eficaz que
antes, sino que los avances en las técnicas permitieron la investigación de la RMN en sistemas
vivos.

Estructura macromolecular.

Los estudios de los biopolímeros recibieron un importante impulso con la introducción de imanes
de alto campo que permitieron separar las líneas espectrales causadas por núcleos químicamente
distintos. Sin embargo, los espectros presentaban una gran riqueza, ya que su interpretación
dependía en gran medida de la asignación de cada una de los cientos de líneas al núcleo
responsable de esa resonancia. En las moléculas más pequeñas, los métodos de doble resonancia
desempeñaron un papel importante en la elaboración de esquemas de enlace químico a través de
conectividades de acoplamiento de espín que podían investigarse mediante el desacoplamiento
selectivo de espín; en casos favorables, las mediciones de NOE proporcionaron información valiosa
sobre las distancias internucleares.
Estos métodos se aplicaron a las proteínas y otros biopolímeros, pero con un éxito limitado.
Fueron necesarios cientos de experimentos separados y tediosos, y la interpretación de los
resultados no siempre fue sencilla. Probablemente el mayor éxito se produjo con las
hemoproteínas, donde los grandes desplazamientos causados por los iones paramagnéticos y las
corrientes de los anillos aromáticos simplificaron considerablemente la interpretación de gran
parte de los espectros. El verdadero avance se produjo cuando Nagayama, Wiithrich, Bachmann y
Ernst demostraron que los métodos de RMN 2D podían aplicarse a los biopolímeros (26). La
espectroscopia correlacionada (COSY) y sus derivaciones permitieron establecer conectividades de
acoplamiento de espín para facilitar las asignaciones espectrales, y la espectroscopia de realce
nuclear Over Hauser (NOESY) permitió utilizar los efectos de relajación para estimar las distancias
internucleares. La NOESY ayudó a realizar asignaciones espectrales, pero lo que es más
importante, proporcionó una forma de estimar las distancias entre protones no enlazados, dando
a la espectroscopia de RMN un método general para determinar un gran número de distancias
internucleares en el espacio 3D.

En principio, la información obtenida de los experimentos COSY y NOESY podría haberse extraído
de un gran número de mediciones secuenciales de desacoplamiento de espín ID y NOE. Sin
embargo, el enfoque 2D permite realizar mediciones simultáneas en todo el espectro,
proporcionando el mismo tipo de mejora general en la eficiencia que la espectroscopia FTNMR
había dado a la adquisición espectral de ID. La interpretación de esta amplia gama de datos en
términos de una conformación molecular 3D requirió el desarrollo de sofisticados métodos de
análisis de datos y la coordinación con programas de dinámica molecular que evalúan las energías
relativas de varias conformaciones. Al igual que en los primeros desarrollos de la espectroscopia
FT-NMR, en esta época se produjeron importantes avances en la velocidad y capacidad de los
ordenadores, así como en los programas sofisticados, que resultaron esenciales para la aplicación
de los métodos de RMN (27).

En 1980, tres años después de que se obtuvieran los primeros espectros 2D de una proteína, los
métodos de supresión de la señal del disolvente se habían desarrollado hasta el punto de que se
podían registrar los espectros de las proteínas en agua, lo que permitía incluir las resonancias del
NH del péptido en las vías de acoplamiento de espín y NOE. Con esta información adicional crucial,
fue posible determinar las estructuras tridimensionales completas de pequeñas proteínas, y en
1985 se publicó la estructura de una proteína de 57 residuos (28). El tamaño de las moléculas que
podían estudiarse era todavía muy pequeño para los estándares de las proteínas, pero la
espectroscopia de RMN se estableció como una alternativa a la cristalografía de rayos X para los
biopolímeros.

Espectroscopia de RMN in vivo .

Mientras los métodos tradicionales de RMN de alta resolución se perfeccionaban y se aplicaban a

moléculas individuales cada vez más grandes y complejas y bien definidas, algunos investigadores
aprovechaban la velocidad y la sensibilidad de los métodos de RMN-FT para observar la compleja
mezcla de pequeñas moléculas en las células vivas, los organismos y, con el tiempo, los animales
enteros y los seres humanos. En cierto modo, estos estudios no eran nuevos. Bloch comentó en
broma que había realizado el primer experimento de RMN in vivo en 1946, cuando introdujo su
dedo en la sonda y obtuvo una señal del agua. A lo largo de los años se realizaron estudios de RMN
con el agua de las células sanguíneas, el sodio de los músculos y las células sanguíneas y el agua de
un ratón. La mayoría de las investigaciones se limitaron a sustancias abundantes que dan grandes
señales, principalmente el agua, y sólo se pudo obtener una cantidad limitada de información.

En 1973 Moon y Richards (29) observaron señales separadas de RMN 3 1P de los constituyentes
intracelulares de los reticulocitos, y en 1974 Hoult et al. (30) demostraron que los cambios
metabólicos en un músculo vivo y extirpado podían seguirse mediante la observación de las
señales del trifosfato de adenosina, así como del fosfato de creatina, el fosfato inorgánico y otros
fosfatos.

Durante la década de 1976-85, muchos grupos hicieron incursiones en los estudios metabólicos
por espectroscopia de RMN. Se inventaron métodos para mantener las células vivas y cultivarlas
en tubos de RMN para permitir estudios en sistemas celulares (31). Se perfundieron órganos
extirpados con soluciones nutritivas en tubos de RMN y se siguió su metabolismo. Se desarrollaron
bobinas de superficie para obtener señales de volúmenes localizados cerca de la piel de los
animales de experimentación. Se diseñaron pulsos de profundidad para adaptar la excitación de rf
y definir con mayor precisión el volumen de interés, y se implantaron bobinas de rf en los animales
para examinar los órganos internos.

Radda (Universidad de Oxford) y Shulman (Yale) fueron pioneros en el estudio no invasivo por
RMN del metabolismo en humanos con grandes imanes superconductores. La mayoría de estos
estudios se basaron en la espectroscopia de RMN 3 1P, pero las muestras enriquecidas con 13C
añadieron una dimensión al estudio del metabolismo. Se utilizó en parte la espectroscopia de
RMN de 1H, pero la gran señal de agua interfería seriamente con los estudios de metabolitos a
niveles milimolares.

Imágenes de RMN. Otra línea de desarrollo que tendría profundos efectos en la espectroscopia de
RMN in vivo comenzó en 1973, cuando Lauterbur (32) demostró que se podían obtener imágenes
2D imponiendo gradientes de campo magnético a través de una muestra. Con dicho gradiente, la
ecuación de Larmor se modifica y se convierte en

donde G es el gradiente en la dirección r. Así, la frecuencia de RMN se convierte en una medida de

la posición a lo largo del gradiente. Repitiendo la medición con gradientes en diferentes
direcciones, es posible reconstruir una imagen 2D. En 1975, Kumar, Welti y Ernst (33) demostraron
que la entonces nueva técnica de RMN en 2D proporcionaba una forma más eficiente de obtener
una imagen y, con algunas modificaciones adicionales, se convirtió rápidamente en el método de
elección para la obtención de imágenes en 2D (y posteriormente en 3D).

Enseguida se vio que las imágenes de RMN tenían un gran potencial para investigar la anatomía
humana y animal. Debido a las diferencias en el contenido de agua y los tiempos de relajación, los
tejidos biológicos pueden distinguirse con secuencias de pulsos de RMN adecuadas, y se pueden
obtener fácilmente imágenes con una exquisita discriminación entre tejidos normales y
patológicos. El desarrollo comercial de la imagen de RMN, abreviada como imagen de resonancia
magnética (IRM), comenzó a finales de la década de 1970. A principios de la década de 1980
comenzaron a aparecer instrumentos de diagnóstico prácticos en los departamentos de radiología,
y el mercado de la RMN creció exponencialmente. Los métodos de imagen de RMN también
proporcionan el método más general para localizar un volumen de interés para la espectroscopia.
En 1985 ya se estaban desarrollando técnicas para integrar la imagen y la espectroscopia en
animales vivos y seres humanos.

Década actual: medicina, biología estructural y ciencia de los materiales: 1986-95

A falta de un tercio de la década actual, es demasiado pronto para caracterizar lo que, en última
instancia, pueden ser los principales impulsos de la RMN. Sin embargo, es seguro destacar tres
áreas diferentes en las que los avances han sido tan rápidos y profundos que se situarán en la
vanguardia de los desarrollos contemporáneos de la RMN.

Diagnóstico médico. En 1987, la IRM se había extendido lo suficiente como para que se celebrara
una Conferencia de Consenso en los Institutos Nacionales de la Salud para abordar las cuestiones
relativas a su seguridad y eficacia como herramienta de diagnóstico para una amplia gama de
enfermedades. En muchos aspectos, se determinó que la RM era significativamente superior a
otras modalidades de imagen como la tomografía axial computarizada (TAC) y, en otros muchos,
estaba a punto de sobresalir. Hoy en día, es difícil encontrar un gran hospital en Estados Unidos en
el que no se disponga de RM. Está claro que, a un precio de entre 2 y 3 millones de dólares por
instrumento, la RMN se ha convertido en la cola que mueve al perro de la RMN.

En el ámbito de la investigación biomédica, la RMN está experimentando nuevos avances. La

imagen ecoplanar (EPI) proporciona un método alternativo para obtener imágenes de RMN en una
fracción del tiempo que se necesita actualmente (50 ms frente a ~ 5 min) (34). Aunque sólo ahora
se está desarrollando comercialmente, la EPI procede de un método de obtención de imágenes
introducido por Mansfield (Universidad de Nottingham) poco después de la invención de
Lauterbur. La EPI permite eliminar los artefactos de movimiento y mejorar la resolución de
muchos órganos internos.

Las imágenes funcionales, en las que se hace hincapié en algún tipo de función y no sólo en la
anatomía, son cada vez más útiles en la investigación y el diagnóstico (35). Los estudios del flujo
sanguíneo y la difusión del agua y los metabolitos en los tejidos utilizan métodos de eco de espín
que se conocen y aplican desde hace tiempo en la espectroscopia de RMN de alta resolución. Los
efectos de susceptibilidad magnética de la desoxihemoglobina paramagnética permiten estudiar la
función cerebral localizada en las regiones donde se consume el oxígeno. Con el desarrollo de
excelentes técnicas para suprimir la señal de agua y localizar un pequeño volumen de interés, la
espectroscopia de RMN XH está empezando a proporcionar información valiosa sobre la función
metabólica en varios órganos, incluido el cerebro.

Biología estructural. Recientemente se han producido avances espectaculares en la aplicación de

la espectroscopia de RMN de alta resolución a la determinación de la estructura tridimensional de
los biopolímeros, especialmente de las proteínas. Los estudios anteriores se habían limitado a las
proteínas de peso molecular entre 5000 y 10.000 Da, porque la complejidad de los espectros 2D y
los anchos de línea aumentan rápidamente con el tamaño molecular.

La ampliación a proteínas más grandes requirió el desarrollo de nuevos e ingeniosos métodos que
dependen de la disponibilidad de proteínas uniformemente enriquecidas en 13C y/o 15N, que a
menudo pueden prepararse de forma económica mediante técnicas de ADN recombinante.
Estos nuevos métodos transfieren la magnetización ]H a través del enlace peptídico de un residuo
de aminoácido a otro y permiten realizar asignaciones de secuencias mediante métodos de RMN
3D y 4D (36). Estos últimos son extensiones lógicas de las técnicas 2D comúnmente utilizadas, pero
requieren grandes cantidades de tiempo de adquisición de datos y capacidades computacionales
intensivas. Se han comunicado estructuras completas de proteínas de pesos moleculares cercanos
a los 20.000 Da, y los métodos actuales parecen ser aplicables hasta unos 30.000 Da. La precisión
de los métodos de RMN es ahora aproximadamente tan buena como la de la cristalografía de
rayos X, y la espectroscopia de RMN tiene la ventaja de determinar la estructura en solución,
donde se pueden examinar procesos dinámicos importantes para el funcionamiento de las
proteínas (37). Las estructuras de los complejos proteicos y de los ácidos nucleicos también se
están determinando mediante espectroscopia de RMN. Por supuesto, el enfoque de la RMN tiene
algunas limitaciones en el sentido de que ciertas proteínas muestran una dispersión de
desplazamiento químico inadecuada, y los anchos de línea de las proteínas más grandes impiden
su análisis con los métodos actuales. Además, el método de RMN sigue siendo muy laborioso para
analizar los espectros multidimensionales.

Ciencia de los materiales . Hasta que se desarrollaron los métodos de estrechamiento de líneas, la
espectroscopia de RMN sólo proporcionaba información limitada sobre los materiales sólidos.
Ahora, no sólo se pueden obtener espectros de relativamente alta resolución en sólidos, sino que
los métodos de obtención de imágenes -desarrollados principalmente para aplicaciones
biomédicas- pueden combinarse con técnicas de estrechamiento de líneas para obtener imágenes
de sólidos. Así, la espectroscopia de RMN ofrece un nuevo enfoque para la investigación de la
estructura detallada en materiales heterogéneos, como las cerámicas poliméricas y sus
compuestos (38). Otros avances en las técnicas de hilado de muestras han permitido obtener
líneas estrechas para los núcleos cuadrupolares, abriendo así los estudios de RMN de alta
resolución en muchos sólidos inorgánicos. Se han desarrollado nuevos métodos para estudiar la
estructura de los sólidos con gases sonda, como el xenón. Así, la espectroscopia de RMN está
empezando a tener un impacto real en el campo de la química del estado sólido, que se está
desarrollando rápidamente.

Otros aspectos

En esta breve historia, no he podido ni siquiera mencionar otras áreas en las que la RMN ha
desempeñado un papel importante. La RMN se ha utilizado en la física del estado sólido desde sus
inicios para investigar una amplia gama de fenómenos en metales, semiconductores y otros
materiales. Los geólogos utilizan magnetómetros de RMN; los exploradores de petróleo emplean
la RMN en la perforación de pozos (la sonda de RMN cabe dentro de la muestra). La industria
alimentaria la utiliza para medir el contenido de humedad, y los estudios agrícolas se han centrado
en la naturaleza no invasiva de la RMN para observar semillas y plantas. Estas y otras aplicaciones
de la RMN siguen ampliándose. Se calcula que, en total, hay unos 15.000 instrumentos de RMN de
uno u otro tipo en todo el mundo. De ellos, unos 5.000 están en el campo de la medicina y
representan una gran parte del dinero que se gasta en instrumentación de RMN. Sin embargo,
incluso con todos los desarrollos en otras áreas, el mayor número de espectrómetros de RMN (del
orden de 8000) se sigue dedicando a la aplicación que comenzó hace casi 40 años: La química
analítica y los estudios estructurales de las moléculas orgánicas.