Coloración GRAM

 Juego de soluciones para la coloración diferencial de GRAM para microscopía

PRINCIPIO PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS

La coloración de Gram ha constituido, desde los albores de la
Bacteriología, un elemento fundamental para la taxonomia e identificación.
Luego del descubrimiento casual realizado por el investigador danés
Christian Gram, pasaron muchos años durante los cuales se efectuaron
las más variadas especulaciones sobre el mecanismo de esta coloración.
Resultaba indudable, sin embargo, su practicidad a los fines de la
identificación. El conocimiento de las estructuras de las membranas
bacterianas, tanto en el aspecto físico como en su composición molecular
que fueron logrados a partir de la década del sesenta, demostraron que la
coloración de Gram distingue dos grupos de bacterias totalmente
diferentes. Las bacterias Gram positivas que presentan una gruesa capa
de peptidoglicano como estructura fundamental por sobre la membrana
citoplasmática, y las Gram negativas, que encima de ésta, presentan una
delgada capa de peptidoglicano, a la que se superpone una capa de
lipopolisacáridos-lipoproteína, denominada membrana externa. La
presencia de esta membrana diferencia actualmente dos divisiones en
sistemática bacteriana: las que no lo poseen, Firmicutes (Gram +) y las
que sí, Gracilicutes (Gram -). La diferencia entre ambos grupos es pues
de enorme importancia taxonómica. El comportamiento como patógenos y
en la sensibilidad antibacteriana difieren sustancialmente; de ahí que la
realización rápida de una coloración de Gram, reviste enorme importancia
en Bacteriología Clínica.
Esta coloración permite la clasificación de las bacterias en GRAM
POSITIVAS Y GRAM NEGATIVAS SEGÚN LA COMPOSICION DE SU
PARED CELULAR.
Por esto el complejo de color formado con la pared de las bacterias gram
positivas no puede ser removido con el agente decolorante que es el
alcohol acetona.
La célula permanece de color azul violeta, en cambio las bacterias gram
negativas, al decolorarse con el alcohol acetona, se dejan colorear con la
fuscina ó safranina, quedando de color rosado.
• La solución R1 Violeta Cristal (Violeta de Genciana) y la solución R4
Fuscina básica o Safranina son irritantes en contacto con piel, ojos y
mucosas.
• La solución R3 Alcohol acetona y la solución R4 Fuscina básica o
safranina son inflamables, por lo tanto se deben tomar los cuidados
requeridos para el manejo de productos inflamables en el laboratorio.
• Observe la simbología en los rótulos de las soluciones.
• Las soluciones usadas y las caducadas deben eliminarse como
desechos especiales, debiendo cumplir las regulaciones locales para
el desecho de compuestos peligrosos.
MATERIALES ADICIONALES REQUERIDOS NO SUMINISTRADOS
• Microscopio • Frasco lavador
• Portaobjetos • Agua
• Cubreobjetos • Mechero Bunsen o alcohol
• Cubeta de tinción • Cronometro y/o timer
MUESTRAS
El material a examinar, como líquidos corporales, exudados, pus, material
de colonias líquido o sólido, se aplica con el asa que ha estado al rojo
sobre un portaobjetos exento de grasa. Luego se mezcla directamente o
con 1 ó 2 gotas de solución fisiológica de cloruro sódico y se extiende.
Después de secar al aire se procede a la fijación por calor, para lo que se
pasa 3 veces, lentamente, el lado inferior del portaobjetos (la parte del
frotis queda arriba) por la parte superior de la llama de un mechero
Bunsen. Luego se deja enfriar y se tiñe.

CONTENIDOS Toda muestra biológica debe se considerada como

potencialmente infecciosa.
VIOLETA CRISTAL (VIOLETA DE GENCIANA) para GRAM
–Listo para su uso
Violeta cristal (Genciana) R.A. 2g
Amonio Oxalato R.A. 1g PROCEDIMIENTO
Agua desmineralizada tipo II 100ml
1. Cubrir la preparación (Placa) fijada con
LUGOL (Solución Yodo/Yoduro) para GRAM VIOLETA CRISTAL (Violeta de Genciana) para GRAM
–Listo para su uso por un (1) minuto.
Yodo metalico R.A. 0.4 g
Potasio yoduro R.A. 0.6 g
Agua desmineralizada tipo II 100 ml 2. Lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua.

ALCOHOL ACETONA Decolorante para GRAM 3. Cubrir la preparación (Placa) con

–Listo para su uso LUGOL (Solución Yodo/Yoduro) para GRAM
Alcohol Etílico al 96% 80% por un (1) minuto.
Acetona R.A. 20%

4. Lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua.

FUSCINA BASICA
–Listo para su uso 5. Decolorar la placa con
Fuscina básica R.A. 0.3 g
Fenol al 5% 90 ml ALCOHOL ACETONA Solución decolorante para GRAM
Alcohol etilico al 96% 10 ml Por 15 - 30 segundos hasta que la placa decolore totalmente.
Alternativa 6. Lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua.
SAFRANINA GRAM
–Listo para su uso 7. Cubrir la preparación (Placa) con
Safranina O R.A. 2g
Alcohol etilico al 96% 100 ml FUSCINA BASICA o SAFRANINA para GRAM
por un (1) minuto

CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD 8. Lavar con agua corriente. Eliminar el exceso de agua. Dejar secar al
• Las soluciones deben almacenarse entre 15°C y 30°C y protegidos aire.
de la luz. Después de abierto el contenido almacenado entre 15°C y
30°C y protegidos de la luz es estable hasta la fec ha de caducidad 9. Examinar al microscopio con lente de inmersión de 100X.
indicada en la etiqueta.
• Temperaturas inferiores a 15°C puede precipitar co lorantes de las
soluciones colorantes.
• Los frascos deben mantenerse siempre bien cerrados.

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RESULTADO

Microorganismos Gram Positivos Azul-Violeta

Microorganismos Gram Negativos Rosa-Rojo

CONTROL DE CALIDAD
Los controles puedes realizarse con bacterias Gram Positivas
(estafilococos) y bacterias Gram Negativas (Escherichia Coli). Para ello
deben utilizarse cultivos procedentes de medios de cultivo incubados
durante 18-24 horas.

NOTAS SOBRE EL EMPLEO

• La técnica descrita anteriormente puede modificarse de acuerdo con
las preferencias del operador para lograr mayor o menor intensidad de
coloración, lo cual implica variaciones en los tiempos de tinción,
decoloración, lavado,...
• Se ha encontrado que el mal uso del ALCOHOL ACETONA Solución
decolorante para GRAM en la fase de decoloración puede llegar a
decolorar los gérmenes GRAM POSITIVOS.
• Cultivos y preparaciones viejas pueden dar resultados atípicos. Es por
ello que se recomienda utilizar cultivos de 18-24 h como máximo o
extensiones recientes.
• Asimismo, es importante controlar la fijación por el calor (dos-tres
pasos de un segundo por llama suave); un exceso del mismo puede
dar coloraciones erróneas.
• Agua altamente clorada puede debilitar la coloración de contraste.

BIBLIOGRAFÍA
1.Gurr,E., Syntethic dyes in Biology, Medicine and Chemistry. Academic Press, London, New York. (1971).
2.Splengler, M.S., Rodeheaver, G.T., Richter, L., Edgerton, Edlich, R.F.. The Gram stain – The most important
diagnostic test of infection. J.Am. College Emergency Physicians 7, 434-438. (1978).
th
3. Clark, George, Stains and staining (Microscopy), 4 edition, Williams & Wilkins, (1981).

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