UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

"Año del Bicentenario del Perú: 200 años de Independencia"

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

2020

PRACTICA N° 1: HISTOTECNOLOGIA

Asignatura: Patología General

Docente: Med. Ángel Rosado Caro
Alumno: Helbert Francis Campos Condori
Código: 2019-123002
Año de estudios: 3ER AÑO

TACNA-PERÚ
2021
 UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA DE MEDICINA HUMANA

PRACTICA N° 1: HISTOTECNOLOGIA
1. INTRODUCCION:
Antes del estudio de los tejidos y órganos del cuerpo, el estudiante de la salud ha
de estar capacitados para elaborar cortes finos de los tejidos o estructuras que se
proponen estudiar con el uso del microscopio. Por ello, el estudiante debe tener en
cuenta que existe muchos procedimientos para analizar diferentes tejidos según el
objetivo. por lo general en este informe se presentará el método con tinción de
hematoxilina y eosina, que son los más comunes y usados en la histología y la
medicina diagnóstica.
2. MARCO TEORICO
La Histotecnología es la parte principal de la Patología, que da el soporte técnico
operativo y científico de todo material biológico humano, animal y vegetal con fines
diagnósticos, de investigación y docencia. Ahora bien, es importante hablar de la
técnica histológica la cual comenzó con el inicio de la histología y anatomía
patológica a fines del siglo XIX y principios del siglo XX cuando llegó a su apogeo
la llamada era de la histología del micrótomo iniciada por el alemán Mayer quien
implementó formalmente la palabra histología, que posteriormente indujo a la
aparición de diversidad de técnicas, instrumentos y equipos que servirían para el
estudio anatomopatológico.

En otro orden de ideas, es oportuno hablar del proceso habitual consiste en realizar
estudios macroscópicos precisos y sistematizados de tejidos, haciéndolos
analizables, mediante procesos como la fijación, un método empleado para lograr
la preservación morfológica y la composición química de las células y tejidos;
además, se emplea la eliminación de las sales de calcio presentes en los tejidos
tras haber realizado su fijación técnica mejor conocida como decalcificación.
Seguidamente, se procede a aplicar la deshidratación, debido a que una gran parte
del tejido está constituida por agua, esto se hace mediante la aplicación de una
serie de soluciones de menor a mayor concentración de agente deshidratante. Para
posteriormente, realizar la desalcoholización, que consiste en sumergir el material
histológico a una solución que es miscible tanto con el agente aclarante como con
el medio de inclusión a utilizar, la sustancia comúnmente utilizada es el xileno o
xilol.

Es preciso mencionar, que se procede a realizar el proceso de infiltración que se

basa en la impregnación del tejido en parafina líquida para otorgarle una
determinada consistencia; seguidamente procedemos a la confección de bloques
de parafina, proceso denominado también inclusión. Posteriormente, se procede a
la realización del corte para obtener secciones de los tejidos a estudiar, que pueden

PATOLOGÍA GENERAL | 2
UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA DE MEDICINA HUMANA
ir desde el grosor de unos cuantos nanómetros hasta centenares de micras. Tras
la obtención del corte, se necesita la visualización de las estructuras histológicas
que, por ser incoloras necesitan adquirir color mediante la tinción, a partir de
sustancias que interactúan con los tejidos de manera química, física- química,
haciendo posible reflejar un determinado color y de igual manera producir el
contraste y diferenciación de las estructuras titulares para su seguido estudio. En
relación a lo expresado con anterioridad, el uso de este método se puede realizar
de dos formas una de manera manual y otra con el uso de equipos modernos.

Se define la técnica histológica al conjunto de procedimientos aplicados a un

material biológico (animal o vegetal) con la finalidad de prepararlo y conferirle las
condiciones óptimas para poder observar, examinar y analizar sus componentes
morfológicos a través de los microscopios de luz y electrónicos. Otra definición
indica que, esta consiste en realizar estudios macroscópicos precisos y
sistematizados de tejidos, haciéndolos analizables, mediante procesos como la
fijación, un método empleado para lograr la preservación morfológica y la
composición química de las células y tejidos; además, se emplea la eliminación de
las sales de calcio presentes en los tejidos tras haber realizado su fijación técnica
mejor conocida como descalcificación.

PROCEDIMIENTO MUESTRAS HISTOLÓGICAS MANUAL

Para obtener una correcta muestra histológica, se debe realizarse los
siguientes pasos.
• Obtención de la muestra:

Para la obtención de material humano, hay diferentes métodos como

lo son las necropsias o autopsias, biopsias, o piezas operadas.

• Fijación de la muestra:

Una vez obtenida la muestra a analizar, fijación comprende el

tratamiento del tejido con sustancias químicas, esto nos ayudara a la
conservación del tejido, eliminar bacterias y gérmenes, interrumpir los
procesos celulares que ocurren en la célula.

Tipos de fijadores:

PATOLOGÍA GENERAL | 3
UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA DE MEDICINA HUMANA
FIJADORES Simples Formol al 10%
QUIMICOS Alcohol etilico al 96%
Alcohol metílico
Compuestos Liquido de Fleming
Liquido de zenker
Liquido de Helly
Liquido de Bouin
FIJADORES DESECACION
QUIMICOS CALOR SECO
CALOR HUMEDO
FRIO
CONGELACION Y
DESCECACION

• Deshidratación:

Se aplica una serie gradual de soluciones acuosas de menor a mayor

de agente deshidratante. Pueden se Alcohol de 50%, 60%, 70%,80%,
90%, 96%, 100% etílico u acetona.

• Aclaramiento o diafanizacion:

Se utiliza xileno o xilol, benzol o cloroformo en tejido se muestra claro

en el xileno, el alcohol y el xileno disuelven los lípidos de la célula se
deja reposando entre 1h 30” y 3h.

• Inclusión de parafina.

Las sustancias para este fin son: resina y parafina, tener un objeto para
su manejo y corte, la muestra de tejido en un recipiente y se le agrega
la parafina fundida a 60°C, colocando la muestra en una estufa de 30
minutos a 6 horas manteniendo la temperatura a 6 horas manteniendo
la temperatura a 60°C. La pieza se coloca dentro de un molde que
contiene parafina fundida se deja solidificar a temperatura ambiente
formando un taco.

• Obtención de cortes.

PATOLOGÍA GENERAL | 4
UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA DE MEDICINA HUMANA
Los cortes se realizan con el microtomo tienen un espesor aproximado
de 3 a 10 micrómetros. Después colocar el corte en un baño de
flotación, para poner en el porta objetos.

• Coloración:

Tinción de hematoxilina eosina: Una de las técnicas más utilizadas

en la histología animal es la tinción de hematoxilina y eosina. Las
características de los compuestos que la componen hacen posible
observar al microscopio óptico las células individualizadas y sus
núcleos, que se tiñen de forma diferenciada. Gracias a esta técnica se
han podido observar gran cantidad de tejidos animales. Se han
descrito, bajo esta tinción, la gran mayoría de tejidos musculares y
glandulares del cuerpo. Aportando con ella la morfología de las células
que forman el tejido y la posición relativa y la forma del núcleo dentro
de ellas.

Hematoxilina: Este compuesto se extrae de Haematoxylum

campechianum, una planta leguminosa originaria de la península de
Yucatán, Méjico. Como curiosidad, el nombre de esta planta significa
madera que sangra. De la planta se obtiene una sustancia que al
oxidarse adquiere un color morado. Para aumentar su capacidad
colorante se combina con iones metálicos de hierro o aluminio,
consiguiéndose así la hematoxilina. La hematoxilina se une
intensamente a las cargas negativas (aniones), como los ácidos. Es
por esto que se une fuertemente al ADN (ácido desoxirribonucleico).
La tinción con hematoxilina tiñe de color azul los núcleos.

Eosina: las diferencias prácticas en el uso de la eosina amarilla o azul

son mínimas, siendo más utilizada la eosina Y. Ambos compuestos se
obtienen de la interacción del bromo con la fluoresceína. Las cargas
negativas del compuesto hacen que se una a compuestos con cargas
positivas, es decir, básicos, como el citoplasma. Sin embargo, ésta
misma carga es la que impide que penetre dentro de células vivas,
puesto que la membrana celular las expulsa.

Eosina: las diferencias prácticas en el uso de la eosina amarilla o azul

son mínimas, siendo más utilizada la eosina Y. Ambos compuestos se
obtienen de la interacción del bromo con la fluoresceína. Las cargas

PATOLOGÍA GENERAL | 5
UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA DE MEDICINA HUMANA
negativas del compuesto hacen que se una a compuestos con cargas
positivas, es decir, básicos, como el citoplasma. Sin embargo, ésta
misma carga es la que impide que penetre dentro de células vivas,
puesto que la membrana celular las expulsa.

Xilol: El xileno, xilol o dimetilbenceno, C6H4(CH3)2 es el que se

obtiene a partir del Benceno. Según la posición relativa de los grupos
metilo en el anillo bencénico, se diferencia entre orto-, meta-, o para-
xileno (o con sus nombres sistemáticos 1,2-; 1,3-; y 1,4-
dimetilbenceno). Se trata de líquidos incoloros e inflamables con un
característico olor parecido al tolueno. Los xilenos son buenos
disolventes y se usan como tales. Además, forman parte de muchas
formulaciones de combustibles de gasolina donde destacan por su
elevado índice octano. En química orgánica son importantes productos
de partida en la obtención de los ácidos ftálicos que se sintetizan por
oxidación catalítica. Un inconveniente es la dificultad de separación de
los isómeros que tienen puntos de ebullición casi idénticos (o-xileno:
144 °C; m-xileno: 139 °C; p-xileno: 138 °C). En histología se emplea
en los últimos pasos de tinciones de muestras, para verlas al
microscopio, como fijador y excluyente del agua. La parafina es una
sustancia de aspecto ceroso que está formada por mezclas de
hidrocarburos saturados. A temperatura ambiente es sólida y su punto
de fusión puede variar entre 40 °C y 70 °C según la composición de la
mezcla de hidrocarburos. Así, parafinas más duras a temperatura
ambiente tienen un punto de fusión mayor, mientras que las más
blandas uno menor. Es recomendable una dureza mayor para incluir
muestras más duras. Las parafinas más usadas tienen un punto de
fusión en torno a los 60 °C. Podemos también modificar las
características de las parafinas añadiendo sustancias para variar su
dureza, viscosidad, fragilidad, etcétera. La parafina no es miscible con
agua, mientras que todos los tejidos están formados principalmente
por agua. Además, la mayoría de los fijadores son soluciones acuosas.
Esto implica que para que la parafina líquida pueda penetrar
completamente en el tejido ha de sustituirse el agua por un solvente
orgánico. Esto se consigue mediante la deshidratación del tejido en
alcoholes, normalmente etanol, de gradación creciente hasta alcohol
de 100°. La deshidratación debe ser completa porque de no ser así
afectará a la infiltración posterior de la parafina. Posteriormente se
transfiere el tejido a un líquido que es miscible tanto con el alcohol de

PATOLOGÍA GENERAL | 6
UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA DE MEDICINA HUMANA
100° como con la parafina, denominado sustancia intermediaria, como
es el benceno, xileno, tolueno o el óxido de propileno, entre otros.

El micrótomo: es un equipo mecánico de precisión que se utiliza para

realizar cortes en tejidos que han sido objeto de inclusión en parafina,
siendo las secciones conseguidas de espesor micrométrico lo
suficientemente delgadas para permitir su examen por el microscopio.
Existen diversos tipos de micrótomos (de mano, de balanceo, de
rotación, de deslizamiento, criostato, ultramicrótomo, etc.) Siendo el
más empleado el de rotación por las ventajas que aporta: gran
precisión y la posibilidad de producir secciones en serie muy finas,
gracias a la desmultiplicación que produce el cambio de un movimiento
de rotación a otro de traslación.

PROCEDIMIENTO
Técnica histológica para preparados de parafina:
La muestra de portaobjetos debe ser cortada para que entre en un
portaobjetos
Primero la muestra debe estar fijada bajo un solvente que nos permita
preservarlo durante años. Por ejemplo, el formol.
Como la muestra esta hidratada, el primer paso es deshidratarlo con unas
secuencias de alcohol de menor grado a mayor grado.

PATOLOGÍA GENERAL | 7
UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA DE MEDICINA HUMANA
Deshidratación
Luego de la fijación hay que quitar el agua del fijador por deshidratación En
un infusor de té se coloca la muestra dentro de los frascos del Alcohol primero
en un frasco de alcohol de 70°-I por tres horas, segundo se coloca la muestra
en un frasco de alcohol de 70°-II unas dos horas. Luego con alcohol 96° unas
dos horas, nuevamente se coloca en un frasco de alcohol 96° unas dos horas
hasta llegar al frasco de alcohol de 100°.

Cuando se llega a alcohol 100° no es recomendable tenerlo por bastante

tiempo ya que puede endurecer la muestra. Se coloca en el frasco de alcohol
de 100| unas dos horas, lo saco, coloco en otro frasco de 100° otras dos
horas.

Diafanización en Xilol
para incluir una muestra en un bloque de parafina, primero es Necesario
quitarle el alcohol, ya que este no es soluble en parafina. Por ello, utilizamos
un componente intermedio el Xilol, que es soluble tanto en alcohol como
parafina.

PATOLOGÍA GENERAL | 8
UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA DE MEDICINA HUMANA
Para este paso, se utiliza dos frascos de xilol. En cada uno se sumerge la
muestra dos horas. Además de extraer el alcohol, se sumerge en alcohol con
el fin de diafanizar la muestra, de tal modo que nos permita ver a través del
tejido

Inclusión en parafina
una vez retirado del xilol, la muestra se incluye en parafina líquida en un
recipiente. Paso siguiente el recipiente se deja en la estufa a 59°C durante
una noche, para que durante ese tiempo el xilol se evaporé y quede
reemplazado por una capa de parafina. Retiro el recipiente de la estufa,
entonces oriento la muestra dentro de la parafina. Paso siguiente se deja la
parafina a temperatura ambiente o si se quiere acelerar el proceso, en una
refrigeradora. Finalmente, se le incluye en un taco.

PATOLOGÍA GENERAL | 9
UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA DE MEDICINA HUMANA

Sección y corte
En esta parte se realiza el corte en pequeñas capas la muestra con ayuda del
microtomo. El microtomo va realizar cortes histológicos, cuando se obtiene
las capas. Montaje de portaobjetos de cada uno de los cortes con los cortes
obtenidos, vamos a realizar un baño de agua caliente para que se extienda
un poco las laminillas de corte (quitar los pliegues que salieron con los cortes).
Separamos los cortes y lo sumergimos en el baño de agua caliente.
Sumergimos el portaobjetos y lo incrustamos a la laminilla.

Montaje de portaobjetos de cada uno de los cortes con los cortes

Obtenidos, vamos a realizar un baño de agua caliente para que se extienda
un poco las laminillas de corte (quitar los pliegues que salieron con los cortes).
Separamos los cortes y lo sumergimos en el baño de agua caliente.
Sumergimos el portaobjetos y lo incrustamos a la laminilla.

PATOLOGÍA GENERAL | 10
UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA DE MEDICINA HUMANA

Tinción o coloración
La coloración con hemoxicilina de meyer y eosina se hacen en solución
acuosa. Pero el corte esta con una capa de parafina que no va permitir
combinarse con la hemoxicilina. Por lo cual se volverá a sumergir en Xilol en
dos frascos sucesivos cada uno 5 minutos. Después para quitar el xilol se
sumerge en frascos de alcohol de 100°,96°,72° y finalmente en agua
destilada. entonces, el corte, ya esta hidratado por ende se sumerge en
hemoxicilina por unos 10 minutos De la hemoxicilina vamos a la eosina, pero
antes lo sumergimos en aguia de canilla. Entonces colocamos el portaobjetos
en la eosina (esta se prepara en una solución de alcohol a 96°) que lo va
deshidratar. Para llevar de nuevo la deshidratación lo llevamos a alcohol 96°
y 100°. El corte estará totalmente deshidratado, pero para que podamos verlo
a través del microscopio necesitamos diafanizarlo. Para ello y como último
paso volvemos a pasar sobre el xilol.
Finalmente, ya diafanizado se coloca una gota de bálsamo y sobre ellos se
coloca el cubreobjeto. El trabajo ha finalizado

PATOLOGÍA GENERAL | 11
UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA DE MEDICINA HUMANA

CONCLUSIONES:

• Cada paso que se llevó con el método de tinción de tejidos con

hematoxilina y eosina, tiene su argumento bajo las propiedades
físicoquímicas de los objetos utilizados. Es muy necesario que los
profesionales manejen estos conceptos para la elaboración de
muestras de tejidos.
• La hematoxilina que por ser estructura catiónica o base tiñe estructuras
ácidas en tono azul y purpura como los núcleos celulares.
• La eosina tiene carácter ácido, por lo cual tiñe sustancias básicas como
el citoplasma
• Existen métodos más sofisticados y complejos que se utilizan con
finesespecíficos

PATOLOGÍA GENERAL | 12