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Transporte electrónico
1
La transferencia de electrones a través de estos complejos está asociada
con la traslocación de H+ de un lado a otro de la membrana. Esta membrana
corresponde a la membrana mitocondrial interna en los organismos
eucarióticos o a la membrana plasmática de las bacterias o arkeas. La
traslocación de H+ genera, entonces, un gradiente electroquímico entre los dos
lados de la membrana. Este gradiente es una fuente energética que puede ser
utilizada por las células para realizar trabajo o para convertirla en otras formas
de energía, como la que es almacenada en forma de enlace químico en el
enlace fosfato de alta energía del ATP.
Al proceso de conversión de la energía del gradiente de concentración de
+
H en ATP, se lo denomina fosforilación oxidativa y se produce a nivel de una
enzima de membrana denominada ATP sintasa.
El esquema básico que estamos describiendo fue explicado en los
comienzos de la década del 60 por Peter Mitchell quien postuló la así
denominada hipótesis quimiosmótica. Esta hipótesis, despreciada en el
momento de su formulación, implicaba que como producto del transporte de
electrones a través de los complejos transportadores en la membrana interna
mitocondrial, se producía un intermediario de alta energía. Lo inusual del
planteo de Mitchell, fue proponer que ese intermediario no era ninguna especie
química de alta energía, como la mayoría de los científicos del momento
esperaban encontrar, sino más bien estaba conformado por el gradiente de
potencial electroquímico generado por la traslocación de iones (en este caso
H+). Para que su teoría tuviera algún respaldo experimental Mitchell propuso
tres postulados que deberían cumplirse (y que podían ser falseados
experimentalmente) si su hipótesis fuera correcta. Los postulados implicaban lo
siguiente:
2
3. Deberían existir enzimas embebidas en el mismo sistema de
membranas cuya actividad se encuentre asociada a la utilización de la energía
aportada por el gradiente electroquímico. Para ello estas enzimas deberían
poseer un canal específico para lo iones que posibilite que estos sean
transportados a favor del gradiente generado. Además, asociado a este
transporte de iones, la enzima debería cambiar su conformación o la del
sustrato de forma de favorecer la reacción que está catalizando.
Cada uno de estos postulados fue ensayado en sistemas libres de
células.
Primero se utilizaron mitocondrias aisladas para demostrar que, en
presencia de un aceptor de electrones como el O2, estas preparaciones eran
capaces de cambiar el pH de la suspensión únicamente si se agregaba al
medio un dador de electrones, como el succinato. Alternativamente se
demostró que la cadena de transporte electrónico estaba funcionando cuando
se utilizó en lugar de un aceptor electrónico natural, como el O2, un aceptor
electrónico artificial, como el colorante azul de metileno. Este colorante es
capaz de recibir electrones aportados por el complejo III, y al reducirse se
transforma desde su forma coloreada a una incolora, lo que permite seguir la
cantidad de electrones transferidos. Por otra parte, si estas mitocondrias eran
tratadas con un detergente débil, el cambio de pH no se observaba en ninguna
condición. El detergente induce la formación de poros y roturas en la
membrana mitocondrial, de manera que este experimento demuestra el
requerimiento de la integridad del sistema de membranas.
Además, se demostró la impermeabilidad de la membrana mitocondrial a
+
los H , incubando las mitocondrias aisladas a pH= 9 hasta que el pH interno y
el externo se equilibren, y luego pasándolas a una solución de pH = 7. En esta
nueva solución se midieron los cambios de pH y se determinó que las
mitocondrias podían mantener el pH interno durante un tiempo suficientemente
largo.
Para ensayar el tercer postulado se utilizaron liposomas reconstituidos in
vitro en presencia de uno o varios de los componentes proteicos de la
membrana de transporte. En el experimento crucial, se armaron vesículas
lipídicas que solo contenían los dos componentes de la ATP sintasa (F0 y F1) y
una proteína extraída del microorganismo Halobacterium halobium. Esta
proteína es la bacteriorodopsina, que actúa como una bomba impulsora de H+
en presencia de luz.
Los investigadores pudieron demostrar que el ATP era sintetizado
únicamente cuando estas vesículas eran iluminadas, o sea únicamente cuando
se había generado un gradiente de H+ a través de la membrana.
Además este experimento permitió mostrar que la síntesis de ATP no
requería en forma directa de la cadena de transporte electrónico, pero si de la
presencia de un gradiente de H+, no importa como fuera este generado.
3
Sin embargo, en las mitocondrias intactas los procesos de transporte
electrónico y de fosforilación oxidativa se encuentran íntimamente acoplados.
De hecho si uno de los dos es detenido por la presencia de un inhibidor
específico, el otro también se frena.
4H +
2 Cit c
(red)
+ (Fe-S)n (Fe-S)3
H QH2
QH2 Q
FMN H+ H+ H+
+ + FADH. 2 H+
NADH + H 4H + 2 H+
QH . 2H ½ H 2O
FMNH. +
H
H+ FAD
NAD
+
FMNH2 Q FADH2
Succinato
H+ H+
Complejo I
Este complejo esta formado por un core 14 subunidades conservadas en
procariotas y eucariotas, pero su estructura terciara aun no has sido dilucidada.
Sin embargo este complejo adopta una forma de L invertida, en donde se
distinguen dos módulo, uno hidrofóbico asociado a la membrana con capacidad
de translocación de protones y otro hidrofílico que se extiende hacia el espacio
matriz mitocondrial y que presenta actividad NADH oxireductasa.
4
En el complejo I los electrones del NADH son transferidos a una proteína
integral del complejo, la NADH oxidoreductasa, que tiene un grupo de FMN
fuertemente unido. El FMN recibe un par de electrones del NADH, su H+ y toma
un H+ de la matriz mitocondrial para convertirse en FMNH2. Los nucleótidos de
flavina (FMN o FAD) así como la coenzima Q que veremos más adelante, son
capaces de intervenir en transferencias electrónicas de a dos electrones al
mismo tiempo o de sólo un electrón por vez. En este último caso se genera un
intermediario (que incluso puede tener una carga negativa como en el caso de
la CoQ) que contiene un electrón desapareado. Estos intermediarios del FAD,
FMN o de la CoQ, son semiquinonas que, a diferencia de las formas totalmente
oxidadas o totalmente reducidas de las coenzimas, son normalmente
incapaces de moverse libremente a través de la membrana. Generalmente,
estas semiquinonas tienen sitios de anclaje a una proteína, perteneciente a
alguno de los complejos donde actúan, siempre en un sitio adyacente a una de
las soluciones acuosas en contacto con la membrana, ya sea la matriz o el
espacio intermembrana.
El FMNH2, cede un electrón a una proteína de Fe-S, la cual convierte un
Fe+3 en Fe+2, reduciéndose en el proceso. En forma concomitante un H+
proveniente del FMNH2 es liberado a la matriz mitocondrial y se genera el
.
intermediario radicalario FMNH .
Para que el proceso continúe, la proteína de Fe-S transfiere su electrón
hacia adelante, convirtiendo su Fe+2 en Fe+3, oxidándose, y preparándose para
.
recibir el otro electrón que queda en el intermediario FMNH .
A O
B H
+
H3C N C
5 C NH e-
C 1 C
O H3C N N O
H3C N C
5 C NH R
C
Flavoquinona
C 1 O
H3C N N O (FMN o FAD)
H
H3C N C
CH2 5 C NH
H
HC OH C 1 C
+ H3C N N O
HC OH H
HC OH NH2 R
Flavosemiquinona
CH2
N
N (FMN. o FAD.)
O O HC
CH O
-O P O P O CH2 N N
O H
H3C N C
O O C H H C 5 C NH
H H C 1 C +
H3C N N O H
OH OH H
e-
R
FMN (en negro) o FAD (en negro y azul)
Flavohidroquinona
los átomos reactivos están en rojo (FMNH2 o FADH2)
5
electrones son trasportados a una coenzima Q oxidada la que se transforma en
.
el intermediario de semiquinona, Q , proceso que ocurre en este brazo
hidrofílico.
.
El siguiente electrón es entonces transferido desde el FMNH hacia la
primer proteína de Fe-S, que vuelve a convertir su Fe+3 en Fe+2, de esta a la
siguiente proteína de Fe-S y así sucesivamente hacia la semiquinona de la
coenzima Q. Esta última se transforma en coenzima Q totalmente reducida,
capta 2 H+ de la matriz y se libera hacia la membrana donde es soluble
pasando a formar parte de todo el conjunto de coenzimas Q reducidas (también
denominadas dihidroquinonas) que existe en la membrana mitocondrial interna.
Complejo II
Se denomina complejo II a una familia de complejos diferentes que son
capaces de extraer una par de átomos de H de una variedad de sustratos
diferentes. Todos estos complejos se diferencian en la enzima que comienza el
sistema de captura de los átomos de H, y son idénticos en el resto de los
componentes que transfieren estos átomos a la coenzima Q. En estos
complejos no hay mecanismos asociados de translocación de H+. El más
conocido de estos complejos es el que contiene como primer enzima a la
succinato deshidrogenasa. En este complejo los electrones del succinato son
transferidos a la enzima succinato deshidrogenasa, una proteína integral del
complejo, que tiene un grupo FAD fuertemente unido. El FAD recibe un par de
6
electrones del succinato, juntamente con su par de H+ para convertirse en
FADH2. El FADH2, cede sus electrones, de a uno a la vez, a una proteína de
Fe-S, la cual convierte un Fe+3 en Fe+2, reduciéndose en el proceso. En forma
concomitante, los 2 H+ provenientes del FADH2 son liberados a la matriz
mitocondria. Los electrones son transportados, de a uno a la vez, a través de
tres centros Fe-S en el interior del complejo. El aceptor final de estos
electrones, es la coenzima Q oxidada que se transforma en QH2 tomando dos
H+ de la matriz mitocondrial. Este complejo no genera una translocación neta
de protones.
La ecuación global de este complejo se muestra aquí:
Complejo III
Los electrones transportados por la QH2 son cedidos de uno a la vez
hacia el citocromo C para producir dos moléculas de citocromo C reducidas. De
esta manera las quinonas son las coenzimas solubles que hacen de nexo entre
dos complejos. Uno de ellos, el dador de electrones, puede ser el complejo I o
el II y el otro, el aceptor de electrones, es, en este caso, el complejo III.
En el esquema mostrado más abajo se indica cómo es la ruta de
transferencia electrónica y de translocación de H+ en el complejo III. Como se
ve, el complejo puede dividirse en dos partes, una conformada por las
proteínas de Fe-S y los citocromos de tipo C, que se encuentra anclada a la
membrana adyacente al exterior de la célula o al espacio intermembranal, y la
otra, conformada por los citocromos de tipo b, que es un complejo proteico
integral a la membrana que tiene dos sitios de unión a la Coenzima Q, cada
uno situado en un sitio de la membrana adyacente a una solución acuosa y
ubicados en puntos opuestos de la misma.
O O
H3C O CH3 H3C
CH3 CH3
H H
CH2C C CH2 H H3C CH2C C CH2 H
H3C O
6-10 6-10
O O
Ubiquinona
(Coenzima Q) Plastoquinona
O O OH
H3C O e- H3C O e- 2 H+
CH3 CH3 H3C O CH3
R R R
H3C O H3C O H3C O
e- 2 H+ e-
O O OH
7
El sistema implica una ruta de reoxidación de la dihidroquinona en forma
cíclica que se denomina ciclo Q y que es análogo a uno que se encuentra en la
cadena de transporte de la membrana tilacoidal de los organismos
fotosintéticos.
1ª Etapa cred
Espacio intermembrana
2H+ o exterior celular
c
Q Q.-
e- e- Fe-S -
e- c1 e
b566
QH2
e-
Membrana mitocondrial interna
o membrana plasmática
b560
e-
Q Q.-
Matriz mitocondrial
o citosol
cred
2ª Etapa 2H+ Espacio intermembrana
o exterior celular c
Q Q.-
e- e- Fe-S c1 e-
e-
b566
QH2
e-
Membrana mitocondrial interna
o membrana plasmática
b560
e-
Q.- QH2
Matriz mitocondrial
2H+ o citosol
2x cred
Reacción global 4H+ Espacio intermembrana
o exterior celular c
Q 2Q 2 Q.-
2x 1e- 2x 1e- Fe-S c1 2x 1e-
2x 1e-
b566
QH2+ QH2
2x 1e-
Membrana mitocondrial interna
o membrana plasmática
b560
e-
e-
Q Q.- QH2
Matriz mitocondrial
2H+ o citosol
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Fe-S y esta al citocromo C1, que termina reduciendo al citocromo C. Cómo dos
electrones son transportados en este sistema, dos moléculas de citocromo C
terminan reducidas (de Fe+3 a Fe+2), pueden liberarse de la membrana y
transportar los electrones hacia el siguiente complejo. El citocromo C es una
molécula soluble en solución acuosa que se une débilmente a la membrana
plasmática y de esta manera está ubicado estratégicamente para transferir
electrones entre los complejos III y IV.
Este complejo toma 2 H+ de la matriz mitocondrial y libera 4 H+ al espacio
intermembrana por cada par de electrones transportados hacia el aceptor final.
Complejo IV
este proceso otros cuatro protones son translocados desde la matriz al espacio
intermembrana, mediante un mecanismo no conocido.
9
+ +
2 cyt C ox + 1/2 O2 + 4 H N => 2 cyt C red + H2O + 2 H P
Ecuación global
Finalmente de acuerdo a lo expresado anteriormente la ecuación global
para el transporte de dos electrones a través de la cadena de transporte en una
mitocondria eucariota es la siguiente:
+ + +
NADH + 1/2 O2 + 11 H N => NAD + H2O + 10 H P
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Las ATP sintasas conocidas, constan de al menos dos componentes. Uno
de ellos es el que forma el canal de transporte de H+ a través de la membrana y
se denomina FO debido a que el transporte mencionado puede ser bloqueado
por el inhibidor oligomicina. El otro componente, está débilmente unido a la
Matriz Membrana Espacio
Mitocondrial Interna Intermembranal Citosol
+
+ H
H
+
ADP + Pi H + +
H H
+
ATP H
+ H
ATP sintasa
+ + + + +
H H H H H
F1 Fo
+
+ H
H
+
+ H
H +
H
+
+ H +
H H
ATP ATP
ADP ADP Metabolismo
+
+ H Celular
H
Transportadores +
H
+ +
H H +
H
Pi Pi
+
H +
H
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reacción que posee un ΔG muy positivo en esta enzima no es la síntesis de
ATP 1 sino la liberación del mismo.
Si intentamos calcular el rendimiento de ATP sintetizado por cada una de
las moléculas de sustrato que fueron oxidadas en un organismo determinado,
hay que tomar en cuenta las características peculiares de su metabolismo. En
general, en la literatura vamos a encontrar diferentes estequiometrías con
respecto al rendimiento energético del metabolismo aeróbico de la glucosa.
Esto se debe a que distintos autores realizan diferentes consideraciones y
aproximaciones 2 para acercarse a la resolución del tema.
Para responder correctamente a esta cuestión hay que tener en cuenta
que el número de moléculas de ATP que se producirán durante la degradación
oxidativa completa de un sustrato, hasta CO2 + H2O, dependerá de una serie
de consideraciones, entre ellas:
i. El rendimiento en moléculas de ATP (u otras que contengan enlaces de alta
energía) en reacciones de fosforilación a nivel de sustrato.
1
por medidas realizadas en los últimos años se estima que la reacción entre el ADP y el Pi para dar ATP
se encuentra prácticamente en el equilibrio en el seno de esta enzima.
2
generalmente no enunciadas en forma explícita
12
El rendimiento en coenzimas reducidas producidas por cada molécula de
glucosa que fue oxidada, es de 2 moléculas de NADH en la glucólisis hasta
piruvato, 2 moléculas de NADH en la conversión de 2 moléculas de piruvato en
2 de Acetil-CoA y, finalmente, 6 moléculas de NADH y 2 de coenzima QH2 por
cada par de moléculas de Acetil-CoA degradadas hasta 4 CO2.
Además, existe la convicción que se requiere del pasaje de 3 H+ a través
del canal de la ATP sintasa, para la síntesis de una molécula de ATP.
Hasta aquí todos de acuerdo, con la pequeña salvedad que algunos
consideran al FADH2 en lugar de la coenzima QH2 como producto del ciclo de
Krebs, lo que a los efectos prácticos del cálculo estequiométrico es indistinto.
La reacción catalizada por la enzima succinato deshidrogenasa provoca la
eliminación de un par de H de un par adyacente de átomos de carbono internos
de la molécula de succinato para generar un doble enlace entre esos carbonos
en la molécula de fumarato. Es verdad que el primer aceptor de los electrones
puestos en juego en esta reacción es el FADH2. Sin embargo, la molécula de
FADH2 se encuentra firmemente unida al centro activo de la enzima succinato
deshidrogenasa y en la práctica es parte de ella. Por lo mismo el FADH2 en
esta reacción no puede ser considerado la coenzima producto de la misma
porque para que la enzima vuelva a ser útil y cumplir otro ciclo catalítico el
FADH2 debe ser reoxidado a FAD cediendo los electrones a la coenzima Q
para producir la coenzima Q reducida (QH2). El FADH2 es en realidad un grupo
prostético en esta reacción. Esta reacción ocurre en el seno de la membrana
(plasmática en el caso de los microorganismos o mitocondrial interna en el
caso de los eucariotes) y el producto, Coenzima Q, es capaz de moverse
dentro de la misma para transportar los electrones de un sitio catalítico hasta
otro, la misma función que el NADH realiza en solución. En definitiva,
considerar al FADH2 el producto de la succinato deshidrogenasa, es lo mismo
que considerar al FMNH2 como producto de la piruvato deshidrogenasa.
De aquí en adelante hay distintas interpretaciones acerca del rendimiento
global. En principio la mayoría de los libros de texto consideran solamente la
situación de las mitocondrias eucariotas. En realidad, el número de
transportadores electrónicos con capacidad de translocar H+ es variable y
depende de la conformación de la cadena de transporte particular de un
organismo determinado. En las mitocondrias eucariotas se encuentran cuatro
complejos de transporte, tres de los cuales pueden translocar protones. En
otros organismos 3 el número puede variar entre 1 y 4.
Algunos libros de texto, no consideran exactamente el número total de H+
que se translocan por cada par de electrones transportados a través de cada
uno de los complejos. En la bibliografía más moderna se reconoce que por
cada molécula de NADH que transfiere sus electrones al O2 por medio de la
cadena de transporte de electrones se translocan, de un lado al otro de la
membrana, un total de 10 H+ para generar el gradiente electroquímico, y que
3
u organelas como el hidrogenosoma de algunos protistas.
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por cada molécula de QH2 (o FADH2) que hace lo mismo se translocan un total
de 6 H+.
De esta manera el cálculo estequiométrico daría 3,3 (y no 3) moléculas de
ATP por cada NADH que cede sus electrones al O2 y 2 moléculas de ATP por
cada QH2 que hace lo mismo.
Este cálculo es real solamente para las bacterias y las arkeas que
contienen una cadena de transporte formada por 4 complejos equivalentes a
los mitocondriales. En estos organismos entonces una molécula de glucosa
rinde 4 ATP por fosforilación a nivel de sustrato, 10 NADH y 2 QH2 a través de
su oxidación completa hasta CO2 y H2O, lo que resulta equivalente a un total de
41 moléculas de ATP sintetizadas por cada molécula de glucosa oxidada.
En los eucariotes hay que hacer otras consideraciones. Principalmente, la
síntesis del ATP se realiza en la matriz mitocondrial mientras que su utilización
mayoritaria es en el citosol celular. Además ni el ATP ni el NADH son capaces
de atravesar la membrana mitocondrial interna sin gasto energético.
Por ello, las moléculas de NADH generadas por glucólisis (en el citosol)
deben ser incorporadas en la mitocondria. Esto no ocurre nunca en la realidad.
Sin embargo si es posible transportar los electrones del NADH desde el exterior
hasta el interior de la mitocondria. En algunos organismos, esto se realiza por
mecanismos denominados de lanzaderas en los que están involucrados
reacciones redox en ambos lados de la membrana mitocondrial interna, junto
con una enzima ubicada en el interior de dicha membrana. Hay dos tipos de
lanzaderas conocidas. En uno de ellos el producto es NADH en el interior de la
mitocondria mientras que en el otro el producto es coenzima QH2, en la
membrana mitocondrial. En este último caso habría que realizar una corrección
estequiométrica cuando se considera el rendimiento en ATP a partir de los
electrones del NADH citosólico.
Sin embargo, la corrección más importante y que pocos realizan,
corresponde al gasto asociado al transporte del ATP de la mitocondria al citosol
y a la incorporación concomitante del ADP y el fosfato desde el citosol a la
matriz mitocondrial.
Como está ilustrado en la figura más arriba, debido al funcionamiento de
la cadena de transporte electrónico a través de la membrana interna, los H+ son
acumulados en el espacio intermembranal de la mitocondria.
Como mencionamos antes, se requiere del pasaje de 3 de estos protones
de nuevo hacia la matriz mitocondrial a través del poro de la subunidad Fo de
la ATP sintasa anclada en la membrana interna, para que se sintetice una
molécula de ATP. Esta reacción ocurre en el sitio específico dentro de la
subunidad F1 de la ATP sintasa que utiliza al ADP y al Pi como sustratos. La
síntesis de ATP consume los sustratos de la ATP sintasa, el ADP y el Pi.
Como la síntesis de ATP y el transporte electrónico están acoplados, para
que el transporte continúe, el ATP debe ser consumido, para regenerar el ADP
y el Pi. El ATP es consumido mayoritariamente en el citosol por el metabolismo
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celular, generando como productos ADP y Pi. Por lo mismo, para que el
transporte electrónico (y el metabolismo celular asociado) continúe
funcionando, el ATP debe ser exportado de la mitocondria y el ADP y el Pi
deben ser importados desde el citosol.
Esto ocurre a través de proteínas transportadoras específicas de la
membrana mitocondrial interna. Una de estas proteínas es un intercambiador
de ATP por ADP. El ATP sale de la mitocondria y el ADP entra en ella, ambos a
favor de un gradiente de concentración por lo que el transporte en este caso
parece pasivo. Sin embargo, el transporte consume energía del gradiente
electroquímico ya que la carga neta del ATP es aproximadamente una unidad
más negativa que la del ADP. Por lo mismo, este transporte implica la entrada
de una carga negativa hacia el sitio donde más concentradas están estas
cargas. Por otro lado, el Pi es incorporado a la mitocondria cotransoportado con
un ion H+. Este segundo transportador utiliza la parte química del gradiente
electroquímico de H+, para incorporar a la mitocondria un Pi necesario para la
síntesis del ATP.
De esta manera por cada molécula de ATP que es sintetizada en una
célula eucariota y transportada hacia el citosol se consumen un total de 4 iones
H+ (3 en la síntesis y 1 en el transporte).
Como habíamos dicho antes, por cada molécula de NADH que transfiere
sus electrones al O2 por medio de la cadena de transporte de electrones se
translocan, de un lado al otro de la membrana, un total de 10 H+ para generar
el gradiente electroquímico, y que por cada molécula de QH2 (o FADH2) que
hace lo mismo se translocan, de un lado al otro de la membrana, un total de 6
H+. Cómo en este caso, se requieren del pasaje de 4 H+ para la síntesis de una
molécula de ATP, el cálculo estequiométrico daría 2,5 (y no 3) moléculas de
ATP por cada NADH que cede sus electrones al O2 y 1,5 moléculas de ATP por
cada QH2 que cede sus electrones al O2.
En los eucariotes, entonces una molécula de glucosa rinde 4 ATP por
fosforilación a nivel de sustrato, 10 NADH (2 en el citosol y 8 en la mitocondria)
y 2 QH2 a través de su oxidación completa hasta CO2 y H2O. En definitiva, este
cálculo es equivalente a un total de 32 moléculas de ATP por cada molécula de
glucosa si se utiliza la lanzadera que rinde NADH en el interior mitocondrial y
30 moléculas de ATP por cada molécula de glucosa si se utiliza la lanzadera
que rinde QH2 en el interior mitocondrial.
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