Laboratorio de Biotecnología Ambiental

Nombres: Maverick Arévalo, Taylor Cadena, Alejandra Caragolla, Belén Carrión, Andrés
Galarraga, Jocelyne Morales Coronel, David Prado, Ronald Zapata

Curso: 8vo G1 Fecha: 2021-06-15

Buscar medios de cultivo para el aislamiento de microorganismos degradadores de

hidrocarburos, específicamente aceite residual automotriz.

1. Buscar artículos, tesis (4). Colocar el artículo en pdf y hacer un pequeño resumen

(Goveas et al., 2020)

Resumen: El aumento de la modernización y urbanización de los países en desarrollo ha dado

lugar a un enorme impulso en el uso de vehículos y automóviles. Por lo tanto, en el presente
estudio se aisló una colonia mucoide plana circular pigmentada de color amarillo de bacilos
Gram negativos, capaz de utilizar aceite de motor usado como única fuente de carbono del
suelo del garaje. El análisis de las condiciones de degradación, como las concentraciones de
aceite de motor usado, inóculo, glucosa, Tween 20 y el tiempo de degradación que afectan la
reducción del% de TPH en el suelo aumentado con aceite de motor usado, se realizó mediante
un enfoque de factor a tiempo. Los factores significativos se optimizaron para una reducción
máxima del% de TPH mediante un diseño compuesto central.

Link:
https://doi.org/10.1016/j.bcab.2020.101614
(Benguenab & Chibani, 2020)

Resumen: El presente estudio tiene como objetivo descubrir hongos filamentosos telúricos
eficientes para degradar los contaminantes de los hidrocarburos del petróleo. Se examinó la
capacidad de los hongos para degradar el petróleo crudo, el diesel y el aceite UE utilizando 2,6-
diclorofenol indofenol. Los hongos se probaron para determinar su tolerancia a diferentes
concentraciones de aceites de petróleo utilizando un ensayo de diámetro de crecimiento
radial. Se estudió la cinética de degradación del petróleo crudo en un intervalo de tiempo de
10 días. A. Ustusfue el hongo más tolerante a la alta concentración de aceites de petróleo en
medio sólido. En comparación con los controles, estos hongos acumularon una alta biomasa en
medio líquido con todos los aceites de petróleo. Asimismo, la tasa de remoción de petróleo
crudo constante y las vidas medias fueron 0,02 día -1, 34,66 días y 0,015 días -1 , 46,21 días
para P. lilacinium  y  A. ustus, respectivamente.  Los hongos seleccionados parecen interesantes
para la biodegradación de los aceites de petróleo y su aplicación para la biorremediación del
suelo requiere estudios a gran escala.

Link:
https://doi.org/10.1016/j.chnaes.2020.10.008
(Narváez-flórez & Gómez, 2011)

Resumen

Los microorganismos que se emplearon en el presente estudio hacen parte del Ceparo de
Bacterias Marinas (CBM) del INVEMAR y se aislaron de estaciones históricamente impactadas
con hidrocarburos de los departamentos de Bolívar, Magdalena, Sucre y Córdoba (Marín et al.,
2004; Figura 1). Se llevó a cabo la siguiente metodología: 50 g del sedimento recolectado con
una draga metálica Ekman de 0.05 m3, a una profundidad no mayor a los 15 cm, fueron
adicionados a 450 mL de agua de mar estéril, agitados por 15 minutos a 180 rpm a
temperatura ambiente. Un mL del sobrenadante se inoculó en 9 mL de caldo de
preenriquecimiento N y P (100 mg K2 HPO4 y 100 mg NH4 SO4) con crudo al 1% ó ACPM al 1%.
Los caldos de preenriquecimiento se incubaron a 35°C con agitación de 180 rpm durante siete
días. Transcurrido este tiempo, se transfirió 1 mL de los caldos de preenriquecimiento a 9 mL
de caldo MMS (Medio Mínimo de Sales) fresco que contenía: Ca(NO3 ) 2 (60 mg/L), NaHCO3
(125 mg/L), KNO3 (70 mg/L), NH4 Cl (70 mg/L), KH2 PO4 (100mg/L), FeSO4 x 7H2 O (10 mg/L),
MnCl2 x H2 O (7 mg/L), ZnSO4 (1.5 mg/L), crudo 1% v/v ó ACPM 1% v/v. Las sales empleadas
para la preparación del medio fueron grado analítico. Se realizaron tres pases sucesivos a
medio MMS fresco, cada siete días hasta completar un tiempo final de incubación de 21 días.
Finalizado el tiempo de incubación a partir de los tubos de caldo MMS se aislaron bacterias
tolerantes a crudo y ACPM en agar nutritivo. Las cepas aisladas se conservaron en el CBM del
INVEMAR (4o C y –80o C) y en el Centro de Investigaciones Microbiológicas de la Universidad
de los Andes - CIMIC (–80 oC) en medio MMS con glicerol. (Narváez-flórez & Gómez, 2011)

Link: http://boletin.invemar.org.co:8085/ojs/index.php/boletin/article/view/182

(Morante Carriel, 2018)

Resumen: Se evaluó la biodegradación de petróleo por cepas aisladas de suelos contaminados

con petróleo, mediante un aislamiento realizado por enriquecimiento secuencial utilizando
petróleo Mesa 30/Puerto escondido (80:20) como única fuente de carbono y energía.
Monitoreo: las muestras fueron tomadas de suelos contaminados con petróleo en los
alrededores del reservorio del sistema de tratamiento de residuos en la Refinería del Petróleo
“Hermanos Díaz” en Santiago de Cuba, las cuales fueron conservadas en frascos ámbar
estériles y procesados dentro de las 24 h de su colecta. Metodología: se aislaron 9 cepas
bacterianas, cinco Gram negativas y cuatro Gram positivas, que fueron identificadas. Las
pruebas bioquímicas evaluadas confirmaron que las cepas aisladas AT14, AT15, AT16, AT17 y
AT18 corresponden a Pseudomonas aeruginosa. Resultados: se seleccionó la cepa
Pseudomonas aeruginosa AT18, por mostrar mayor crecimiento sobre petróleo como única
fuente de carbono y energía al obtenerse 1,83 g/L de biomasa celular, lo que representa un 57
% de biodegradación de petróleo. (Morante Carriel, 2018)

Realizó la incubación por el método de enriquecimiento secuencial, empleando como fuente

de carbono y energía crudo de petróleo. El procedimiento se describe a continuación: El
enriquecimiento se realizó empleando medio King B líquido selectivo [(g/L): peptona, 20.0;
glicerol, 15 mL; K2HPO4, 1.5; MgSO4 x 7H2O, 1.5; agar, 15; agua destilada (pH 7.2)], por 48 h
(King et al., 1954). ▪ Se adicionó un volumen de hidrocarburo de (1 a 1) al medio de cultivo
como fuente de carbono. ▪ Los componentes del medio se esterilizaron en autoclave a 120 ºC
durante 20 min. ▪ El 50 mL de este medio, se preparó el pre-inóculo de 24 h de incubación.
(Morante Carriel, 2018)

Link http://repositorio.uteq.edu.ec/handle/43000/5029

 Agar de cloranfenicol glucosa extracto de levadura

El extracto de levadura es la porción soluble en agua de levadura hidrolizada y es una
fuente de vitaminas, particularmente del grupo B, y de otros nutrientes de crecimiento
que estimulan el desarrollo de hongos y levaduras. La glucosa es el hidrato de carbono
fermentable que proporciona carbono y energía. El cloranfenicol es un antibiótico que
ayuda a aislar hongos patógenos de material altamente contaminado, ya que inhibe la
mayoría de las bacterias contaminantes. Es un antibiótico recomendado para su uso con
diferentes medios debido a su estabilidad térmica y amplio espectro bacteriano. El agar
bacteriológico es el agente solidificante (Condalab, 2019).
En nuestro caso para determinar microorganismos degradadores de aceite residual
podemos remplazar la fuente de carbono glucosa por el aceite y así tendríamos nuestro
medio para estudiarlo.
Extracto de levadura: es un extracto soluble en agua de un autolisado de células de
levaduras seleccionadas. Este producto es rico en vitaminas especialmente del complejo
B, aminoácidos y otros factores de crecimiento.
Cloranfenicol: es un antibiótico que es principalmente bacteriostático. Se une a la
subunidad 50S del ribosoma e inhibe así la síntesis de proteínas bacterianas.
Agar-agar: es un gelificante natural que procede de algas rojas.
Aceite residual automotriz: es el producto del uso de aceites en la lubricación y
refrigeración en vehículos automotores, el ARA es una mezcla compleja de
hidrocarburos alifáticos, aromáticos.
Medio YGC
Extracto de levadura 5g
Cloranfenicol 0,1 g
Agar-agar 15 g
 Aceite residual automotriz (ARA) 20 mL/L

 Medio MCHP6
Según (Ramírez - & Ángel Piragauta Aguilar, 2017) realizaron un medio de cultivo
específico para evaluar microorganismos degradadores de aceite residual automotriz y
está compuesto por:
Nitrato de calcio tetrahidrato (Ca (NO3)2*4H2O): Es una sal incolora que absorbe la
humedad del aire y se encuentra comúnmente como tetrahidratado. Se utiliza
principalmente como componente de fertilizantes.
Fosfato dipotásico (K2HPO4): sal altamente soluble en agua que se utiliza a menudo
como fertilizante, aditivo alimentario y agente tampón. Es una fuente común de fósforo
y potasio.
Fosfato mono potásico (KH2PO4): también llamado hidrógeno-ortofosfato dipotásico
o hidrógeno-fosfato de potasio es una sal altamente soluble en agua que se utiliza a
menudo como fertilizante, aditivo alimentario y agente tampón. Es una fuente común de
fósforo y potasio.
Nitrato de sodio (NaNO3): es un agente preventivo de la enfermedad conocida como
botulismo También es conocido como salitre. sustancia incolora,
ligeramente higroscópica y altamente oxidante. Mezclado con sustancias orgánicas
puede provocar explosiones.
Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4* 7H2O): sal inglesa o sal de higuera,
es un compuesto químico cuya fórmula es Mg SO₄·7H₂O. Es una fuente de magnesio.
El sulfato de magnesio sin hidratar MgSO₄ es muy poco frecuente y se emplea en la
industria como agente secante.
Cloruro de amonio (NH4Cl): sal de amonio cuya fórmula química es NH4Cl. Es una
sal cristalina blanca que es altamente soluble en agua. Las disoluciones de cloruro de
amonio son ligeramente ácidas.
Cloruro de potasio (KCl):  medicamento del tipo llamado electrolito. Los electrolitos
ayudan a mantener en equilibrio correcto los niveles de agua de las distintas partes de su
cuerpo. El cloruro de potasio actúa reemplazando a una sustancia llamada potasio
que su organismo ha perdido.
Vitamina B12: vitamina hidrosoluble esencial para el funcionamiento normal del
cerebro, del sistema nervioso, y para la formación de la sangre y de varias proteínas. Es
una de las ocho vitaminas del grupo B
Biotina: también llamada vitamina H, vitamina B₇ y vitamina B₈, es una vitamina
estable al calor, soluble en agua y alcohol, y susceptible a la oxidación que interviene en
el metabolismo de los hidratos de carbono, grasas, aminoácidos y purinas.
 Medio MCHP6
Ca (NO3)2*4H2O 0,059 g/L
KH2PO4 0,04375 g/L
K2HPO4 0,09875 g/L
NaNO3 0,3 g/L
MgSO4* 7H2O 0,02 g/L
NH4Cl 0,0135 g/L
KCl 0,025 g/L
Vitamina B12 1 mL/L
Biotina 1 mL/L
Aceite residual automotriz (ARA) 5 mL/L
 Agar de cloranfenicol glucosa extracto de levadura

En placa térmica
o en microondas

Añadir 20mL/L de aceite Calentar, agitando,

Disolver 40,1 gramos de
residual automotriz (ARA). hasta ebullición, para la
medio en 1 litro de agua Dispensar en tubos,
total homogeneización.
destilada. frascos o cajas Petri.

Autoclavar a 121
ºC durante 15
NOTA: El color final del medio es crema. minutos, o a 116
Evitar todo sobrecalentamiento que pueda ºC durante 10
caramelizar la glucosa.
minutos.
 MEDIO MCHP6

Colocar 250 mL de Agitador Orbital

MCHP6 caldo de MCHP6

500 mL
Única fuente de C

Suplementar el medio liquido con 1% Aplicar agitación continua Dispensar en tubos de

de aceite de recambio de automóvil (180 rpm) ensayo o frascos
 Enfriar

Se observan cambios en
los índices de opacidad. Esteriliza en autoclave a:
Distribuir en Cajas Petri Baño María a 45°C
T=121°C en un t=20 min
Infografía

Referencias:

Benguenab, A., & Chibani, A. (2020). Biodegradation of petroleum hydrocarbons by

filamentous fungi (Aspergillus ustus and Purpureocillium lilacinum) isolated from used
engine oil contaminated soil. Acta Ecologica Sinica, xxxx.
https://doi.org/10.1016/j.chnaes.2020.10.008
Condalab. (2019). Agar Glucosa Cloranfenicol Medio selectivo para el aislamiento y
enumeración de levaduras y hongos en leche y productos lácteos Test
microbiológico. 1-2.
Goveas, L. C., Menezes, J., Salian, A., Krishna, A., Alva, M., Basavapattan, B., & Sajankila, S. P.
(2020). Petroleum hydrocarbon degradation in soil augmented with used engine oil by
novel Pantoea wallisii SS2: Optimisation by response surface methodology. Biocatalysis
and Agricultural Biotechnology, 25(February), 101614.
https://doi.org/10.1016/j.bcab.2020.101614
Morante Carriel, L. (2018). Portada universidad técnica estatal de quevedo unidad de
posgrado.
Narváez-flórez, S., & Gómez, M. L. (2011). SELECCIÓN DE BACTERIAS CON CAPACIDAD
DEGRADADORA DE HIDROCARBUROS AISLADAS A PARTIR. 37(1006), 63–77.

Ramírez -, M., & Ángel Piragauta Aguilar, M. (2017). ENSAYO PRELIMINAR PARA
LA RECUPERACIÓN MICROORGANISMOS BIOTRANSFORMADORES DE
ACEITE USADO DE AUTOMÓVIL Autores: Miguel Cifuentes-PROYECTO
CURRICULAR INGENIERÍA SANITARIA SEMILLERO K Docente tutor:
ARTÍCULO CIENTÍFICO. 11(2), 2463-0691