09/11/2014

Sumario
Tema 1. Introducción a los métodos cromatográficos.
• Generalidades.
• Clasificación de los métodos cromatográficos.
• Técnicas especiales.
• Pasos a seguir en cualquier análisis cromatográfico.
Objetivos: Analizar los aspectos generales de los métodos
cromatográficos instrumentales mediante el estudio de su
fundamento, características y mecanismos por los que operan,
para poder comprender los diferentes métodos que serán vistos
Docente: Mercedes Campo Fernández (PhD) posteriormente.
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Etapas generales para llegar a la caracterización

de un compuesto en una mezcla
Métodos de separación

• Obtener una muestra representativa del objeto de

estudio. Métodos químicos Métodos físicos

• Separar o aislar cada una de las sustancias

componentes de la mezcla para su posterior análisis. Los métodos químicos llevan
consigo cambios químicos. Una
• Identificación de cada uno de los componentes de vez que se establece la
dicha muestra. separación, la simple reunión
de los componentes no
reproduce la sustancia original.
Los métodos físicos incluyen
una serie de operaciones en
las cuales no se produce
ninguna alteración en la
naturaleza de las sustancias.

Métodos de separación CROMATOGRAFÍA

Schonbein y
Métodos químicos Métodos físicos 1890 Runge Cromatografía de papel

• Tamizado 1906 MiKhail Tswett Cromatografía de columna CROMATOGRAFÍA

• Electrólisis
• Precipitación Kuhn y
• Gravimetrías 1930-1940 colaboradores PREMIO NOVEL DE QUÍMICA
• Decantación
• Descomposición térmica • Cristalización Hesse y Surge la cromatografía Desarrollada por Cremer,
1941 colaboradores gaseosa Martín y James
• Sublimación Flodin y Separación de macromoléculas
1950 a 1960 Porath por filtración
• Filtración
• Destilación 2da mitad de Se introdujo de manera comercial la CLAE o HPLC
los años 60
• Centrifugación
• Cromatografía 5

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Técnica analítica de gran versatilidad Técnica analítica de alta sensibilidad

• Se cuenta con sensibles métodos de detección que pueden ser

aplicados a todos los tipos de cromatografía.
• Pueden ser separadas, identificadas y analizadas cuantitativamente
pequeñas cantidades de muestras (microgramos y nanogramos).
• Separaciones usualmente rápidas.
• Relativa simplicidad y fácil operación, comparado con otras técnicas
analíticas instrumentales.
• Puede lograrse buena exactitud y precisión, sí el proceso
establecido está bien controlado y el equipo se presenta en buenas
condiciones.
• Estudio de la contaminación del agua y de la atmósfera.
• En el campo de las ciencias forenses, para determinar
residuos de drogas en sangre y orina, materiales tóxicos y
potenciales venenos.
• En la industria farmacéutica, bioquímica y biotecnológica,
para el control de calidad.
• Separaciones quirales.

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DEFINICIÓN

“La cromatografía es el método físico usado,

principalmente, para la separación de los componentes Separar
de una muestra en la cual estos se distribuyen entre dos
fases, una de ellas estacionaria mientras que la otra se
mueve. La fase estacionaria puede ser un sólido o un
gel. La fase estacionaria puede estar empacada en una
columna, esparcida en forma de capa o distribuida como
Identificar
una película. La fase móvil puede ser un gas o un
líquido”.

Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC)

Cuantificar
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CONCEPTOS CONCEPTOS

• Fase estacionaria: Es una de las dos fases que forman
un sistema cromatográfico. Puede ser un sólido, un gel
o un líquido. Si es un líquido, puede estar distribuido
en un sólido, el cual puede o no contribuir al proceso
de separación.
• Eluir: Proceso en el que la fase móvil se desplaza a lo largo de la
fase estacionaria transportando los componentes a separar. En
cromatografía planar se utiliza de manera similar el término
“desarrollar“.
• Muestra: Mezcla consistente en cierto número de componentes,
cuya separación se realizará en el lecho cromatográfico al ser
arrastrados o eluidos por la fase móvil.

• Fase móvil: Fluido que se filtra a través o a lo largo del
lecho estacionario, en una dirección definida. Puede
ser un líquido (CL), un gas (CG) o un fluido supercrítico
(CFS).
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• Componentes de la muestra: Los constituyentes químicamente
puros de la muestra. Se aceptan también los términos eluito y
analito para un componente de la muestra.
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Cromatograma
CONCEPTOS

• Zona o banda: Región del lecho cromatográfico donde se

localizan uno o más componentes de la muestra.
• Cromatógrafo: El instrumento empleado para realizar una
separación cromatográfica.
HPTLC
• Cromatograma: Una gráfica u otro tipo de presentación de la
respuesta de un detector, frente al volumen de efluente o al Cromatograma
tiempo. En la cromatografía plana, "cromatograma" puede de CLAR o HPLC
referirse al papel o capa con las zonas separadas.

13 Cromatograma gaseoso 14

POR LA NATURALEZA DE LAS DOS FASES

Por el
mecanismo
de separación
Cromatografía de • Técnica de separación en la que la fase móvil
Gases es un gas. Se lleva siempre a cabo en columna.
(CG)

Por la Clasificación de Por la

naturaleza de los métodos tecnología Cromatografía • Técnica de separación en la que la fase móvil
las dos fases cromatográficos utilizada Líquida es un líquido. Puede desarrollarse en una
columna o sobre un plano.
(CL)

Cromatografía con • Técnica de separación en la que la fase móvil

Según el fluido supercrítico es un fluido por encima y relativamente cerca
objetivo de sus temperatura y presión críticas.
(CFS)
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Cromatografía de adsorción

• La separación se basa principalmente en la diferente afinidad, en

Cromatografía de adsorción
Cromatografía de reparto
Por el mecanismo de
separación
Cromatografía de exclusión
términos de adsorción, de los componentes de la muestra sobre
la superficie de un sólido activo.
• La fase estacionaria está constituida por un sólido de gran
desarrollo superficial y la fase móvil es un líquido o un gas.
• Los adsorbentes pueden ser polares en orden decreciente de
actividad: óxido de aluminio (alúmina), trisilicato de magnesio, gel
de sílice, óxido de calcio.

Cromatografía de intercambio
iónico

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Cromatografía de reparto Cromatografía de exclusión

• La separación se basa principalmente en efectos de exclusión, tales

• La separación se basa, principalmente, en la diferente
solubilidad de los componentes en las fases móvil y
estacionaria.
• La FM puede ser líquida o gaseosa y la fase estacionaria
siempre será un líquido.
• La cromatografía de reparto se utiliza para la separación de
mezclas de compuestos de polaridad media y alta.
como las diferencias de tamaño molecular o de forma.
• Se puede usar también el término cromatografía de exclusión por
tamaños, filtración en gel y cromatografía de permeación en gel
(GPC).
• En esta cromatografía se eluyen primero las macromoléculas
mayores, y en segundo lugar las menores.
• Tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna
y el volumen de la misma.
• El método permite que se realicen recuperaciones de solutos altas.
• Las matrices más comúnmente utilizadas son dextanos con enlaces
reticulados o agarosa (Sephadex/Sepharose), cuentas de
poliacrilamida (Bio-Gel) y derivados de dextrano.

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Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de intercambio iónico

La interacción de este tipo de cromatografía tiene lugar entre los iones de una
solución y los ácidos, bases o las sales insolubles usados como fases estacionarias, Para una resina catiónica el proceso se representa por la siguiente
las cuales reciben el nombre de intercambiadores iónicos. ecuación:
+ +
Grupos sulfónico o carboxilo,
M + RH H + RM
dispuestos sobre una matriz
Orgánica
Intercambiadores orgánica de poliestireno o
catiónicos poliacrílica M+: catión monovalente
(ácidos o sales
RH: resina catiónica en forma ácida
insolubles) RM: representa al catión fijado a la resina
Inorgánica Permutita y las Zeolitas

Intercambiadores Aminas terciarias o grupos amonio

aniónicos cuaternario, unidos a una matriz
(bases insolubles ) orgánica de poliestireno

Por la tecnología utilizada

En función de los objetivos

Cromatografía planar (CP, CCD)

Cromatografía Cromatografía
analítica preparativa

Separa Proceso de
Cromatografía en columna Identifica purificación para
(CC, CG, CLAE, etc.) Cuantifica continuar con otros
estudios

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Técnicas especiales Cromatografía de fase normal

¿Quiénes serán más fuertemente adsorbidos?

• Cromatografía con Fase Normal
Procedimiento de elución en el que la fase estacionaria es
más polar que la fase móvil.
• Cromatografía de fase reversa o invertida
Procedimiento de elución empleado en cromatografía
líquida en el cual la fase móvil es, significativamente, más
polar que la estacionaria.
Los compuestos que contienen grupos como ácidos
carboxílicos, aminas o amidas serán más fuertemente
adsorbidos que los compuestos no polares

Técnicas especiales
Sílica modificada

• Análisis Isocrático: Procedimiento en el que la composición

de la fase móvil permanece constante a lo largo del proceso
de elución.
Si CH2(CH2)6CH3 Si CH2(CH2)16CH3 Si CH2(CH2)3
RP-8 C8 ODS C18 Fenil
• Elución con Gradiente: Procedimiento en el que la
composición de la fase móvil cambia, de forma continua o en
etapas, a lo largo del proceso de elución.
OH

Si CH2(CH2)2NH2 Si CH2CH2OCH2CHCH2 Si CH2CH2CH2CN

Amino Diol OH Ciano

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Pasos a seguir en cualquier análisis cromatográfico
• Tomar una muestra representativa.
• Transporte de la muestra al laboratorio.
• Almacenamiento de la muestra hasta su análisis.
• Preparación de la muestra para el análisis.
• Desarrollo del análisis cromatográfico.
• Procesamiento de los datos analíticos.
• Reporte de los resultados.
Pasos a seguir en cualquier análisis cromatográfico
Preparación de la muestra para el análisis
• La preparación de la muestra dependerá del estado físico de la
muestra, si se presenta en forma de gas, líquido o sólido.
• Las técnicas clásicas incluyen una extracción selectiva,
filtración, precipitación, centrifugación y cromatografía sencilla
en columna abierta.
• Partición por disolventes, previo al análisis cromatográfico.
Análisis cromatográfico
La selección de la técnica cromatográfica más apropiada,
pudiera estar determinado por:
La naturaleza de la muestra
La complejidad de la muestra
La cantidad del compuesto de interés en la muestra
El costo del análisis y la seguridad requerida
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Pasos a seguir en cualquier análisis cromatográfico
Transporte y almacenamiento
de la muestra al laboratorio.
• Sustancias termolábiles, de origen biológico o susceptible a
desnaturalizarse y al daño por microorganismos, deben ser refrigerada
hasta su preparación.
• Muestra susceptible a la oxidación atmosférica y que debe ser
almacenada por un tiempo hasta su preparación, se mantendrán bajo
atmósfera de nitrógeno o helio.
• Si la sustancia solo se presenta en cantidades de trazas, el material del
envase no debe adsorber dicha sustancia.
Pasos a seguir en cualquier análisis cromatográfico
Desarrollo del análisis cromatográfico
• Los materiales volátiles son usualmente separados por CG.
• Si el compuesto se encuentra en cantidades muy pequeñas o la
cantidad de muestra es muy limitada, se podría utilizar,
preferiblemente, la CG, aprovechando la alta sensibilidad de sus
detectores.
• Si los componentes de la muestra son relativamente no volátiles y
termolábiles, la cromatografía líquida pudiera ser la mejor
elección.
• La CCD, es una técnica poso costosa y muchas separaciones
realizadas por CL pueden ser muy bien resueltas por CCD.
Pasos a seguir en cualquier análisis cromatográfico
Procesamiento y reporte de los datos analíticos
• Procesamiento manual o computarizado.
• El reporte analítico puede ser simple o extenso.
• El informe debe ser conciso y seguro.
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Bibliografía
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Posgrado e investigación.
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