41.

3 La genética inversa permite la síntesis de ácidos nucleicos a partir de una secuencia de la

proteína

En este punto, hemos purificado el receptor mediante el uso de anticuerpos monoclonales. ¿Cuál
es el próximo paso en la caracterización de los receptores? Hay muchas posibles respuestas a la
pregunta, pero una muy común es aislar el ADN que codifica para el receptor. Las secuencias de
DNA no son "bibliotecas" que puede buscar secuencias correspondientes al receptor. Por ejemplo,
un ADN complementario (ADNc) la colección es una colección de secuencias de ADN que
representa todos los ARNm expresadas por una célula. En esencia, el ADN complementario es una
copia del ARNm expresadas por la célula. La enzima transcriptasa inversa del mRNA utiliza como
plantilla para hacer un ADN complementario, o copiar. Si podemos aislar el cDNA para el receptor
de estrógeno, que puede insertar el ADN en bacterias, y las bacterias que producen el receptor de
estrógeno para nuestros experimentos. ¿Cómo podemos encontrar el receptor de estrógeno en la
biblioteca de cDNA? Podemos utilizar nuestro receptor de estrógeno purificada para generar una
sonda que nos permitirá identificar las secuencias de ADN en la biblioteca que corresponden a los
receptores de estrógenos.

La secuencia de la proteína es una Guía de Información del ácido nucleico

El capítulo 40 examina las técnicas utilizadas para secuenciar una proteína completa. Para buscar
en las bibliotecas de ADN, necesitamos una sonda -un producto químico de algún tipo que
reconoce secuencias de ADN que corresponden a los receptores de estrógenos. Para generar
sondas para buscar el gen del receptor de estrógeno en una biblioteca de ADNc, tenemos que
saber sólo una parte de la estructura primaria del receptor. El conocimiento de la estructura
primaria de una proteína permite el uso de la genética inversa - generación de secuencias de ADN
que corresponden a una parte de la secuencia de aminoácidos agregar sobre la base del código
genético. Estas secuencias de ADN se pueden utilizar como sondas para aislar el gen que codifica la
proteína o el cDNA correspondiente al ARNm.

Usando el receptor purificado como material de partida, podemos utilizar el procedimiento de la

degradación de Edman (p. 631) para determinar la secuencia de aminoácidos de una parte del
receptor. Con esta información y una copia del código genético (p. 589) en la mano, podemos
convertir la información de secuencia de proteínas en la información de ácido nucléicos de la
secuencia y luego en una sonda de ADN.

Las sondas de ADN pueden ser sintetizados por los métodos automatizados

Las cadenas de ADN pueden ser sintetizados por la adición secuencial de monómeros activados a
una cadena en crecimiento que está vinculado a un soporte insoluble. Los monómeros activados
son desoxirribonucleósidos 3 '-phosphoramidites protonados en los que todos menos uno de los
grupos reactivos de los nucleótidos están protegidos por la unión temporal de grupos reactivos.

En el paso 1, el átomo 3 '-fósforo de esta unidad de entrada se une a la cadena en crecimiento

para formar un triéster fosfito (Figura 41.11). En el paso 2, el triéster fosfito se oxida por el yodo
para estabilizar la relación nueva. En el paso 3, el grupo de protección en el 5 'del grupo-OH de la
cadena en crecimiento se elimina mediante la adición de ácido dicloroacético. La cadena de ADN
está alargado en una unidad y listo para otro ciclo de adición. Cada ciclo dura sólo unos minutos y
por lo general se alarga más de un 99% de las cadenas.
La capacidad de sintetizar con rapidez las cadenas de ADN de cualquier secuencia seleccionada
abre muchas vías de experimentación. Por ejemplo, un oligonucleótido sintetizado marcado en un
extremo con 32p o una etiqueta fluorescente se puede utilizar para buscar una secuencia
complementaria de una colección de secuencias de ADN. En nuestro experimento, vamos a hacer
una sonda de ADN radioactiva que corresponde a una parte de la estructura primaria del receptor
del estrógeno. Vamos a utilizar esta sonda para explorar las colecciones de secuencias de ADN que
codifican los receptores de estrógenos. Sin embargo, antes de hacerlo, debemos examinar las
características de la práctica del ADN que está buscando y, en el proceso, vamos a examinar
algunas de las herramientas de la tecnología del ADN recombinante.

Figura 41.11 La síntesis de una cadena de ADN por el método triéster fosfito. El monómero
activado añadido a la cadena en crecimiento es un desoxirribonucleósidos 3'-phosphoramidite que
contiene un dimetoxitritilo (DMT), grupo de protección de su átomo 5'-oxígeno, una β-cyanoethyl
(βCE) grupo de protección de su átomo de oxígeno 3'-fosforilo y un grupo protector en la base.

41.4 La tecnología del ADN recombinante ha revolucionado AH Aspectos de la biología

Las técnicas del ADN recombinante, desarrolladas en la década de 1970, han tomado la biología de
una ciencia exclusivamente analítica a una sintética. Las nuevas combinaciones de genes no
relacionados pueden ser construidas en el laboratorio mediante la aplicación de técnicas de ADN
recombinante. Estas nuevas combinaciones se pueden clonar-amplificado muchas veces por su
introducción en las células adecuadas, donde se replican por la maquinaria de síntesis de ADN del
huésped. Los genes insertados son a menudo transcritos y traducidos en su nueva configuración,
la producción de proteínas que normalmente no se encuentra en la célula huésped.

La restricción de enzimas rompe el ADN en fragmentos específicos

Las enzimas de restricción son quizás las herramientas que hicieron posible el desarrollo de la
tecnología del ADN recombinante. Las enzimas de restricción, también llamadas endonucleasas de
restricción reconocen secuencias específicas de bases del ADN de doble hélice y rompen, en
lugares específicos, las dos hebras o dúplex. Para los bioquímicos, estos escalpelos exquisitamente
precisos son un regalo maravilloso de la naturaleza. Son indispensables para el análisis de la
estructura cromosómica, la secuenciación de las moléculas de ADN muy largo, para aislar los
genes, y la creación de nuevas moléculas de ADN que pueden ser clonados.

Las enzimas de restricción se encuentran en una amplia variedad de procariotas. Su función

biológica es romper, y por eso destruyen las moléculas de ADN de extranjeros, como el ADN de los
virus que atacan a las bacterias (bacteriófagos). El propio ADN de la célula no se degrada, porque
los sitios reconocidos por sus propias enzimas de restricción son metilados. Muchas enzimas de
restricción reconocen secuencias específicas de cuatro a ocho pares de bases) denominado sitios
de corte, e hidrolizan un enlace fosfodiéster en un lugar específico en cada sitio especifico de esta
región. Una característica llamativa de estos sitios de corte es que casi siempre poseen simetría
rotacional doble. En otras palabras, la secuencia reconocida es palindrómica, o una repetición
invertida, y los sitios de corte están colocados simétricamente. Por ejemplo, la secuencia
reconocida por una enzima de restricción de achromogenes Streptomyces es en cada capítulo, la
enzima que rompe el enlace fosfodiéster CG en el lado 3' del eje de simetría.

Cientos de enzimas de restricción han sido purificadas y caracterizadas. Sus nombres constan de
una abreviatura de tres letras para el organismo de acogida (por ejemplo, Eco de Escherichia coli,
Hin para Haemophilus influenzae, Hae para Haemophilus aegyptius), seguido por una designación
de la cepa (si es necesario) y un número romano (si más de una restricción enzima de la misma
cepa ha sido identificada). Las especificidades de varias de estas enzimas se muestran en la Figura
41.12. Las enzimas de restricción se utilizan para romper las moléculas de ADN en fragmentos
específicos que son más fáciles de analizar y manipular que la molécula entera.

Figura 41.12 specificidad de algunas endonucleasess de restricción. Las secuencias que son
reconocidas por estas enzimas contienen un doble eje de simetría sobre el punto verde. Los sitios
de corte se indican con flechas rojas. El nombre abreviado de cada enzima de restricción se da en
el derecho en la secuencia que reconoce. Tenga en cuenta que los cortes pueden ser escalonados
o paralelo.

Las enzimas de restricción y la ligasa de ADN son herramientas clave para la formación de
moléculas de ADN recombinante

Vamos a examinar cómo las moléculas de ADN nueva se puede construir en el laboratorio asi
como la preparación para la clonación del receptor de estrógeno. Nuestra meta inmediata es la
inserción del ADN que codifica el receptor en un trozo de ADN, llamado vector, que es fácilmente
absorbido y reproducido por las bacterias. Las bacterias que contiene el ADN extraño pueden
producir grandes cantidades de proteínas de los receptores con los que podemos realizar
experimentos.

¿Cómo se construye una molécula de ADN recombinante? Un fragmento de ADN de interés es

covalentemente unido a un vector de ADN. La característica esencial de un vector es que puede
replicarse de manera autónoma en un huésped apropiado. Los plásmidos (de origen natural
círculos de ADN que actúan como cromosomas accesorios en las bacterias) y el bacteriófago
lambda (fago λ.), un virus, que son comúnmente utilizados como vectores de clonación en E. coli.
El vector puede estar preparado para aceptar un nuevo fragmento de ADN mediante
fragmentación en un solo sitio específico con una enzima de restricción. El plásmido pSC1O1 fue
uno de los vectores desarrollado por primera vez. Esta molécula circular de 9,9 kd de ADN de
doble hélice se divide en un sitio único por la enzima de restricción EcoRI. Los cortes escalonados
realizados por esta enzima producen extremos complementarios de cadena simple, que tienen
afinidad específica por los demás y por lo tanto, son conocidos como extremos cohesivos o
pegajosos. Cualquier fragmento de ADN se puede insertar en este plásmido si el fragmento tiene
los mismos extremos cohesivos. Este fragmento puede ser preparado a partir de un pedazo más
grande de la DNA usando la misma enzima de restricción que se usó para abrir el ADN plásmido
(Figura 41.13).

Los extremos de cadena sencilla en el fragmento a continuación son complementarios a las del
plásmido cortado. El fragmento de ADN y el plásmido de corte pueden ser reconocidos y luego se
unidos por la DNA ligasa.

Figura 41.13 La unión de moléculas de ADN mediante el método de cohesión de extremos. Dos
moléculas de ADN, escindidas por una enzima de restricción comun como EcoRI, se pueden ligar
para formar moléculas recombinantes.

41.5 Los genes eucariotas se pueden manipular con considerable precisión.

Los genes eucariotas se pueden introducir en las bacterias mediante el uso de las técnicas de la
tecnología del ADN recombinante como hasta ahora se han discutido. Las bacterias pueden
entonces ser utilizados como fábricas para producir un producto de la proteína deseada. La
producción de esta fábrica molecular será nuestro plan de ataque para el receptor de estrógeno.
En primer lugar, sin embargo, debemos generar el ADN que codifica el receptor de estrógeno.

El DNA complementario preparado a partir de mRNA se puede expresar en células huésped

¿Cómo puede ser ADN de los mamíferos clonados y expresados por E. coli? Recordemos que la
mayoría de los genes de mamíferos son mosaicos de intrones y exones (p. 577). Estos genes
interrumpidos no pueden ser expresado por las bacterias, que carecen de la maquinaria de
empalme de los intrones de la transcripción primaria. Sin embargo, esta dificultad puede ser
evitada por las bacterias al tomar el ADN recombinante, que es complementario al mRNA maduro,
llamado DNAc. Por ejemplo, la proinsulina, precursora de la insulina, es sintetizada por las
bacterias que albergan plásmidos que contienen ADN complementario al ARNm de la proinsulina
(Figura 41.14). De hecho, las bacterias producen gran parte de la insulina utilizada hoy en día por
millones de diabéticos.

La clave para la formación complementaria de ADN es la enzima transcriptasa inversa, una ADN
polimerasa dirigida por RNA aislado de los retrovirus. La transcriptasa inversa sintetiza una cadena
complementaria de ADN en una plantilla de ARN, si la transcriptasa está provista de una cartilla de
ADN que es la base-emparejado con el ARN y contiene un libre 3' del grupo-OH. Podemos utilizar
una simple secuencia de residuos de timidina vinculada [oligo (T)] como primer. Este oligo (T) se
aparea con la secuencia de poli (A) en el extremo 3 'de las moléculas de mRNA de la mayoría de
eucariotas (p. 577), como se muestra en la Figura 41.15. La transcriptasa inversa sintetiza a
continuación, el resto de la cadena de DNA en presencia de los cuatro desoxirribonucleósidos
trifosfato. La cadena de ARN de este híbrido ARN-ADN es posteriormente hidrolizada por la
elevación del pH. A diferencia del ARN, el ADN es resistente a la hidrólisis alcalina. El ADN de
cadena sencilla se convierte en ADN de doble cadena mediante la creación de otro sitio primario.
La enzima transferasa terminal añade nucleótidos -por ejemplo, los residuos de varios de DG-al
extremo 3' del ADN de cadena sencilla a este anuncio como una plataforma para el primer. El oligo
(dC) se puede unir a los residuos dG y cebar la síntesis de la cadena del segundo ADN. La segunda
cadena de ADN se sintetiza como sería en la naturaleza, con la polimerasa de ADN y dNTPs. Las
uniones sintéticas, segmentos de ADN sintetizados para contener varios sitios de restricción, se
pueden añadir a este ADN de doble hélice para la ligadura de un vector adecuado. El DNA
complementario para todos los mRNA que una célula contiene se pueden hacer, insertados en
dichos vectores, y, a continuación se inserta en las bacterias. Por lo tanto, cada bacteria contendrá
un vector con una pieza insertada de ADN, así como sus cromosomas circulares propios. Tal
colección de vectores comprende una biblioteca de cDNA.

Figura 41.14 La síntesis de proinsulina por bacterias. La proinsulina, precursora de la insulina,

pueden ser sintetizada por clones transformados (alterados genéticamente) de E. coli. Los clones
contienen el gen de la proinsulina mamífera.

Figura 41.15 La formación de un duplex de cDNA. Un dúplex de ADN complementario (DNAc) se

crea a partir de mRNA utilizando la transcriptasa inversa para sintetizar una hebra de cDNA –
Primero, a lo largo de la plantilla de ARNm y, a continuación, después de la digestión del mRNA, a
lo largo de la misma cadena de nueva síntesis del cDNA.

Los retrovirus contienen un genoma de ARN, pero se replican a través de un ADN intermediario.
La conversión de la información del ARN en la información del ADN está catalizada por la
transcriptasa inversa. El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), causante del SIDA, es un
retrovirus.

El receptor de estrógenos de DNAc puede ser identificado por la investigación de una biblioteca de
cDNA

 Con estas técnicas a nuestra disposición, volvamos a nuestros experimentos con el receptor de
estrógeno. Usaremos el ensayo que sintetizamos antes de la investigación de una biblioteca de
cDNA generada a partir de un tejido sensible a estrógeno, tales como el útero de la rata. Para
nuestros experimentos, vamos a utilizar una biblioteca de DNAc fago λ.
Una suspensión diluida de los fagos recombinantes es la primera plateado en un césped de
bacterias (Figura 41.l6). Cuando cada partícula del fago ha aterrizado y ha infectado una bacteria,
una placa que contiene los fagos idénticos se desarrolla en el plato. Una réplica de esta placa
principal entonces se hace mediante la aplicación de una hoja de nitrocelulosa. Las bacterias
infectadas y el ADN del fago liberada por las células lisadas se adhieren a la hoja en un patrón de
puntos correspondientes a las placas. Las bacterias intactas en esta hoja se lisan con NaOH, que
también sirve para desnaturalizar el ADN para que sea accesible para la hibridación con una sonda
marcada-32P. La sonda sólo se unirá a la codificación de la secuencia de ADN del cDNA del
receptor de estrógeno. Una película de rayos X se coloca sobre la réplica. La radiactividad de la
sonda se expondra (oscuro) en la película de rayos X. Este proceso, denominado autorradiografía,
a continuación, revela las posiciones de los puntos de acogida de ADN recombinante. Las placas
correspondientes son recogidas de la placa principal intactas y en crecimiento. Un solo
investigador puede fácilmente hacer la prieba de un millón de copias en un día.
El vector que contiene el cDNA para el receptor de estrógeno pueden ser aislados y transcrito. El
RNAm resultante puede ser traducido in vitro para producir receptores para los experimentos.

Las bibliotecas de ADN complementario se pueden elaborar para una proteína sintetizada
 Los vectores discutidos hasta ahora sólo llevan el ADN incorporado y permiten la transcripción del
ADN insertado. Sin embargo, con el uso de un vector preparado especialmente, las bacterias que
son en realidad la expresión de la proteína del receptor de estrógeno pueden ser aisladas. Las
moléculas complementarias de ADN se pueden insertar en vectores especialmente diseñados que
favorecen la expresión eficiente de estas moléculas en coleuas huésped tales como la E.colli. Estos
plásmidos o fagos son llamados vectores de expresión. Estos vectores maximizan la transcripción
del ADN insertado mediante el uso de un promotor de gran alcance. Los vectores de expresión
también contienen un segmento de ADN que codifica un sitio de unión al ribosoma en el mRNA
que se transcribe a partir del DNA insertado. Por lo tanto, las moléculas de cDNA que se insertan
en estos vectores no sólo son transcritas sino que también son traducidas. Los clones que
contienen el cDNA pueden ser aplicados con base de su capacidad para dirigir la síntesis de una
proteína extraña en las bacterias. Las manchas de bacterias en una placa de réplica se lisan para
liberar las proteínas, que se unen a un filtro de nitrocelulosa aplicado. Con el uso de técnicas
inmunológicas similares a las mencionadas anteriormente, el anticuerpo monoclonal para el
receptor de estrógeno puede ser utilizados para identificar las colonias de bacterias que albergan
el vector cDNA correspondiente (figura 41.17).

Teniendo un cDNA para el receptor de estrógenos nos permite realizar una serie de experimentos
para determinar las propiedades bioquímicas de la proteína. Por ejemplo, nos aprendimos mas
temprano que el receptor de estrógeno es un factor de transcripción que funciona mediante la
unión al ADN de los genes de selección (p. 568). Usando el receptor clonado, podemos realizar
experimentos para determinar la secuencia de ADN a la que el receptor se une más firmemente.
Se podría investigar si el receptor reacciona con otras proteínas que se unen al DNA. De hecho, el
conocimiento que se obtendrá sólo está limitado por nuestra imaginación y habilidad
experimental. Sin embargo, el tener el cDNA para el receptor nos dice poco sobre el gen que
codifica el receptor del mismo. ¿Contiene intrones? ¿Qué secuencias reguladoras controlan esta
expresión? Para responder a estas preguntas y otras similares, se debe aislar el gen que codifica el
receptor. Para ello, volvemos a una biblioteca, pero esta vez a una biblioteca genómica.

Figura 41.16 Proyección de una biblioteca de cDNA de un gen específico Aquí, una placa es la
prueba de placas que contiene cDNA para el receptor de estrógeno.

Los genes específicos pueden ser clonados a partir de compendios de ADN genómico

Vamos a ver cómo podemos clonar un gen que está presente sólo de vez en el genóma, como el
gen que codifica el receptor de estrógeno. El enfoque consiste en preparar una gran colección (o
biblioteca) de fragmentos de ADN genómico y luego identificar a los miembros de la colección que
tiene el gen de interés.

Una muestra que contiene muchas copias del ADN genómico total -en nuestro caso, el ADN de
rata es la primera esquila mecánica o parcialmente digeridos por enzimas de restricción en
fragmentos grandes. Este proceso permite obtener una población casi al azar de fragmentos de
ADN que se superponen. Estos fragmentos se separan por eIectroforesis en gel para aislar el
conjunto de todos los fragmentos que son alrededor de 15 kd de largo, porque este tamaño es
conveniente para la inserción en los vectores. La electroforesis en gel de ácidos nucleic es similar,
en principio, gel de electroforesis de proteínas (p. 627). En el trabajo con ácidos nucleicos, sin
embargo, la muestra no se desnaturaliza y el gel se hace a menudo de agarosa en vez de
poliacrilamida. La conectores sintéticos se unen a los extremos de estos fragmentos, se forman
extremos cohesivos, y los fragmentos se insertan en un vector, como por ejemplo), el ADN del
fago, preparados con los mismos extremo de cohesión (Figure41.18). En bacterias como
Escherichia resultan luego infectados por estos fagos recombinantes. Estos fagos se replican y, a
continuación destruyen a su bacteria anfitriona. La lisis resultante contiene fragmentos de ADN de
rata encuentrados en un número suficientemente grande de partículas de virus para asegurar que
casi todo el genoma está representado. Estos fagos constituyen una biblioteca genómica. Esta
biblioteca genómica entonces se defienden de una manera similar a una biblioteca de ADNc.

El gen de interés es improbable que se encuentran en una sola pieza de ADN, porque los genes son
por lo general más de 15 KB, el tamaño de los fragmentos utilizados para hacer la biblioteca
genómica. En consecuencia, varios clones de la biblioteca genómica de diferentes partes del
puerto 'del gen del receptor de estrógeno. Estos clones deben ser aislados y secuenciados para
determinar la secuencia de un gen entero.

Figura 41.17 vectores expres510n detección fer la presencia de receptores de estrógenos. Un

método de detección de clones de ADNc es identificar los productos de proteína expresada
mediante la tinción con anticuerpos específicos.

La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas. Cuando se calienta en agua, la agarosa se

disuelve, al enfriarse, forma un gel que se utiliza como soporte para ectrophoresis el.

Puede secuenciar el ADN por la terminación controlada de la replicación

El análisis de la estructura del ADN y su papel en la expresión de genes también han sido
notablemente facilitado por el desarrollo de técnicas de gran alcance para la secuenciación de las
moléculas de ADN. La clave para la secuenciación del ADN es la generación de fragmentos de ADN,
cuya longitud depende de la última base de la secuencia. Las colecciones de tales fragmentos se
pueden generar a través de la replicación [o terminación controlada (método didesoxi de Sanger),
un método deve10ped por Frederick Sanger y sus colaboradores. El mismo procedimiento se
realiza en cuatro mezclas de reacción, al mismo tiempo. En todas estas mezclas, una polimerasa de
ADN se utiliza para hacer el complemento de una corta secuencia dentro de una molécula de ADN
de cadena sencilla que está siendo secuenciado. La síntesis es preparado por un fragmento de
síntesis química que es complementario a una parte de la secuencia conocida de otros estudios.
Además de los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato (marcado radiactivamente), cada mezcla
de reacción que contiene una pequeña cantidad de la 2 ', 3'-análogo didesoxi de uno de los
nucleótidos, un nucleótido diferente para cada mezcla de reacción.
La incorporación de este crecimiento bloques analógicos más de la nueva cadena analógica porque
la didesoxi carece de la terminal 3 '-hidroxi necesaria para formar el enlace fosfodiéster siguiente.
La concentración de la analógica es lo suficientemente baja que la terminación de la cadena se
llevará a cabo de forma esporádica. La polimerasa insertará el nucleótido correcto a veces y el
didesoxi veces analógico otros, detener la reacción. Por ejemplo, si el análogo didesoxi del dATP
está presente, fragmentos de diferentes longitudes son producidos, pero todo será terminado por
el análogo didesoxi (Figura 41.19). Es importante destacar que este análogo didesoxi del dATP se
insertará únicamente cuando un T se encuentra en el ADN es secuenciado. Así, los fragmentos de
diferente longitud que corresponden a las posiciones de T. Cuatro juegos como de la cadena de
fragmentos de terminado (una para cada análogo didesoxi) y luego sometidos a electroforesis y la
secuencia de bases del ADN nuevo se lee en la autorradiografía de los cuatro carriles.
detección de fluorescencia es una alternativa muy eficaz para autorradiografía. Una etiqueta
fluorescente se incorpora en cada uno análogo didesoxi-una forma diferente de color rojo para
cada uno de los cuatro terminadores de la cadena (por ejemplo, un emisor de azul para la
terminación en A y uno rojo para la terminación en C). Con el uso de una mezcla de terminaciones,
una sola reacción puede llevarse a cabo y los fragmentos resultantes se sometieron a
electroforesis. Las bandas separadas de ADN son detectadas por su fluorescencia a medida que
surjan con posterioridad a la electroforesis, la secuencia de sus colores da directamente la
secuencia de bases (figura 41.20). detección de fluorescencia es atractiva porque elimina el uso de
reactivos radiactivos y puede ser fácilmente automatizado. En efecto, los instrumentos modernos
de secuenciación de ADN puede millones secuencia de bases por día, con la utilización de este
método.

Figura 41.18 creación de una biblioteca genómica. Una biblioteca genómica puede ser creado a
partir de un resumen de un genoma complejo.
La aplicación de estas herramientas de secuenciación para la investigación del gen del receptor de
estrógeno revela que el gen es más de 140 kb de longitud y consta de 8 exones. Además de las
cajas TATA y CCAAT (p. 565), la región río arriba del gen contiene un promotor P1 que es activado
por el AP2λ factor de transcripción. Curiosamente, ciertos tipos de cáncer de mama depende de la
presencia del receptor de estrógenos para el crecimiento maligno, y AP2λ puede jugar un papel
crítico en la regulación del gen del receptor de estrógeno en las células cancerosas.

La selección de secuencias de ADN pueden ser grandemente amplificados por la Reacción en

Cadena de la Polimerasa

Vamos a resumir los logros de nuestra investigación hasta la fecha. Hemos purificado el receptor
de estrógeno por el uso del anticuerpo monoclonal que se generaron. Usando la genética inversa,
se han sintetizado una sonda de ADN que nos ha permitido aislar el ADNc del receptor, así como el
gen para el receptor. Por último, hemos deducido la secuencia de ADN del gen. Aunque hay
muchos experimentos posibles para llevar a cabo sobre la base de lo que hemos logrado hasta
ahora, vamos a iniciar un nuevo proyecto de investigación que nos introducirá en una de las
técnicas más poderosas en la bioquímica experimental. Nuestro sistema experimental hasta el
momento ha sido con el útero de la rata. Podemos preguntarnos si el gen del receptor se
transcribe en otros tejidos, como el cerebro y el hígado.
Podríamos, de hecho, las bibliotecas de cDNA de pantalla de estos tejidos, la búsqueda de un
hecho que contiene el cDNA del receptor como lo descrito hasta ahora. Sin embargo, ganamos de
utilizar un sistema mucho más rápido de detección. Vamos a estudiar cDNA preparado a partir de
los tejidos del cerebro y el hígado, así como otros tejidos y determinará, con el uso de la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR), ya sea de cDNA (y, por implicación, el ARNm) para el receptor
está presente.
Considere la posibilidad de un dúplex de ADN consiste en una secuencia de la blanco rodeado de
ADN no-objetivo. En nuestro ejemplo, el objetivo sería el cDNA del receptor putativo en el
cerebro, el hígado o los músculos. Si el DNA de la blanco está presente, podemos detectar si en
primer lugar ampliar la cantidad de ADN presente. Millones de copias de las secuencias de destino
puede ser fácilmente obtenido por PCR, si las secuencias de acompañamiento de la meta se
conocen, y sabemos lo que son las secuencias que flanquean porque tenemos la secuencia de ADN
del receptor. PCR se lleva a cabo mediante la adición de los siguientes componentes para una
solución que contiene la secuencia de destino: (l) un par de cebadores que hibridan con las
secuencias complementarias de la meta, (2) los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTPs), y
(3) ADN polimerasa termoestable. Un ciclo de PCR consiste o tres pasos (figu.re 41,21).
1. Separación Strand. Las dos hebras de la molécula de ADN los padres están separados por
calentar la solución a 95 ° C durante 15 S.
2. La hibridación de cebadores. La solución se enfría bruscamente hasta los 54 ° C para permitir
que cada cebador para hibridar con una cadena de ADN. Una cartilla que se hibrida con el extremo
3 'del objetivo de una cadena, y la otra base híbrida con el extremo 3' en la línea de meta
complementaria. Padres dúplex de ADN no se forman, ya que las cartillas están presentes en gran
exceso. Los iniciadores son normalmente 20 a 30 nucleótidos de largo.
3. La síntesis de ADN. La solución se calienta a 72 ° C, la temperatura óptima para la Taq DNA
polimerasa. Esta polimerasa termoestable procede de Thermus aquaticus, una bacteria termófila
que vive en aguas termales. La polimerasa elonga los cebadores en la dirección de la secuencia de
destino porque el ADN

Figura 41.20 detección de fluorescencia de los fragmentos de oligonucleótidos producido por el

metanol didesoxi. Una reacción de secuenciación se realiza con cuatro cadenas de terminación de
nucleótidos didesoxi, cada uno marcado con una etiqueta que presenta fluorescencia en una
longitud de onda diferente (por ejemplo, rojo para 1). Cada uno de los cuatro colores representa
una base diferente en una cromatografía de seguimiento producido por las medidas de
fluorescencia en cuatro longitudes de onda.
Figura 41.21 El primer ciclo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Un ciclo consta de tres
pasos: línea de separación, la hibridación de los cebadores y la extensión de los cebadores de la
síntesis de ADN.
Síntesis se encuentra en el 5 'a 3'. la síntesis de ADN se lleva a cabo en ambas cadenas sino que se
extiende más allá de la secuencia diana.
Estas tres etapas de separación de cadena, la hibridación de los cebadores y síntesis de ADN-
constituyen un ciclo de amplificación por PCR y se puede realizar repetidamente con sólo cambiar
la temperatura de la mezcla de reacción. La termoestabilidad de la polimerasa hace que sea
factible llevar a cabo la polimerización en cadena en un recipiente de dosificación, sin reactivos se
añaden después del primer ciclo. El dúplex se calientan para iniciar el segundo ciclo, que produce
cuatro dúplex, y luego el tercer ciclo se inicia (figura .41.22). Al final del tercer ciclo, dos hebras
cortas parece que sólo representan la secuencia de destino-incluyendo la secuencia, delimitada
por los primers. los ciclos posteriores se amplifica la secuencia de destino de forma exponencial. El
mayor incremento en el número de hebras aritméticamente y servir como fuente para la síntesis
de más cadenas cortas. Lo ideal sería que, después de ciclos n, la secuencia deseada se amplifica
2n veces. La amplificación es un pliegue después de 20 ciclos millones y millones de veces después
de 30 ciclos, que pueden ser llevadas a cabo en menos de una hora.

Varias características de este método destaca por amplificación del ADN son dignos de mención.
En primer lugar, la secuencia de la meta no es necesario conocer. Todo lo que se requiere es el
conocimiento de las secuencias complementarias. En segundo lugar, el objetivo puede ser mucho
mayor que los cebadores. Objetivos de más de 10 kb se han amplificado por PCR. En tercer lugar,
los cebos no tiene que estar perfectamente adaptado a las secuencias complementarias para
ampliar los objetivos. Con el uso de cebadores derivados de un gen de secuencia conocida, es
posible buscar las variaciones sobre el tema. De esta manera, las familias de genes se han
descubierto con el uso de la Cuarta PCR, PCR es muy específica, debido a la rigurosidad de la
hibridación a temperatura relativamente alta. Rigor es la cercanía necesaria del partido entre el
primer y el objetivo, que puede ser controlado por la temperatura y la sal. A altas temperaturas, el
ADN único que se amplifica es el situado entre los cebadores. Un gen que intervengan en menos
de una millonésima del ADN total de un organismo superior es accesible por PCR. En quinto lugar,
la PCR es sumamente sensible. Una sola molécula de ADN puede ser amplificada y posteriormente
visualizadas en la electroforesis en gel de hecho, el ADN amplificado puede ser aislado del gel y se
inserta en un vector y se puso, si así lo desea.

El examen de PCR para detectar la presencia de receptores de estrógenos en las bibliotecas de

cDNA de distintos tejidos revela que las cantidades significativas de ARNm del receptor están
presentes en el hueso pituitario, el hígado y las células musculares, así como los tejidos
reproductivos, incluyendo la glándula del ovario, mama y útero.

Clínica lnsight

PCR es una técnica eficaz en el diagnóstico médico, forense y estudios de la evolución molecular

PCR puede proporcionar una valiosa información de diagnóstico en medicina. Las bacterias y los
virus pueden ser fácilmente detectados con el uso de cebadores específicos. Por ejemplo, la PCR
puede revelar la presencia del virus de la inmunodeficiencia humana en las personas que no han
desarrollado una respuesta inmune a este patógeno y por lo tanto se puede perder con un análisis
de anticuerpos. Encontrar bacilo Mycobacterium tuberculosis en muestras de tejido es lento y
laborioso. Con la PCR, tan sólo 10 bacilos de la tuberculosis por cada millón de células humanas
pueden ser fácilmente detectado. La PCR es un método prometedor para la detección temprana
de ciertos tipos de cáncer. Esta técnica se puede identificar mutaciones de ciertos genes controlan
el crecimiento, tales como los genes ras (p. 184). La capacidad para amplificar ciertas regiones del
ADN también puede ser muy informativa en la vigilancia de la quimioterapia del cáncer. Pruebas
de PCR pueden detectar cuando las células cancerosas se han eliminado y el tratamiento puede
ser detenido, sino que también puede detectar una recaída y la necesidad de reanudar de
inmediato el tratamiento. PCR es ideal para la detección de leucemia causada por cambios
cromosómicos.

Figura 41.22 ciclos múltiples de la reacción en cadena de la polimerasa. Los dos capítulos cortos
producidos al final del tercer ciclo (junto con el ya no está demostrado) representan la secuencia
de destino. los ciclos posteriores se amplifica la secuencia de destino de manera exponencial y la
secuencia de los padres aritméticamente.

PCR también está teniendo un efecto en la ciencia forense y medicina legal. Un perfil de ADN
individuales un elevado carácter distintivo debido a que muchos loci genéticos son muy variables
dentro de una población. Por ejemplo, una variación en uno específico de estos lugares determina
el tipo de HLA de una persona (humana del antígeno del leucocito tipo), los trasplantes de órganos
son rechazados cuando los tipos de HLA del donante y el receptor no son lo suficientemente
compatible. Amplificación por PCR de genes múltiples se utiliza para establecer la paternidad
biológica de la paternidad en disputa y casos de inmigración. Los análisis de manchas de sangre y
muestras de semen por PCR han implicado a la culpabilidad o inocencia en el asalto y numerosos
casos de violación. La raíz de un pelo encontrado en un cobertizo scel1e crimen contiene suficiente
D ~ A para la tipificación por PCR (figura 4j 0,23).

Los niveles de expresión génica puede ser examinado exhaustivamente

Veamos ahora en una técnica final, que nos permite ver cómo las señales del medio ambiente,
tales como la presencia de hormonas, o estados patológicos, como el cáncer, afectan a la
expresión de un conjunto de genes de un tejido. La mayoría de los genes están presentes en la
misma cantidad en cada célula, es decir, una copia por célula haploide o dos copias por célula
diploide. Sin embargo, el nivel en el que se expresa un gen, según lo indicado por las cantidades de
ARNm, puede variar ampliamente, que van desde la ausencia de expresión de cientos de copias
del mRNA por célula. patrones de expresión génica varían de un tipo de célula a célula de tipo,
distinguiendo, por ejemplo, una célula muscular a partir de una célula nerviosa. Incluso dentro de
la misma célula, los niveles de expresión de los genes-puede variar la célula responde a cambios
en las circunstancias fisiológicas. Tenga en cuenta que los niveles de mRNA en ocasiones se
correlacionan con los niveles de proteínas que se expresan, pero esta correlación no se cumple
siempre. Por lo tanto, se debe tener cuidado al interpretar los resultados de los niveles de ARNm
solo.

Usando nuestro conocimiento de la secuencia completa del genoma, podemos analizar el patrón y
el nivel de iones expresa de todos los genes en una célula o tejido en particular. Uno de los
métodos más poderosos desarrollado hasta la fecha que va de este objetivo se basa en la
hibridación. arrays de alta densidad de oligonucleótidos, llamados microarrays de ADN o chips
genéticos, se puede construir por diversos medios, como mediante la colocación de puntos muy
pequeños de oligonucleótidos o ADNc en un soporte sólido, como un portaobjetos de
microscopio. ADNc marcado con fluorescencia se hibrida con el chip para revelar el nivel de
expresión de cada gen, identificable por su ubicación conocida en el chip. La intensidad de la
mancha fluorescente en el chip revela el alcance de la transcripción de un gen en particular. La
figura 41.24 muestra el patrón de genes que son inducidos o reprimidos en
la figura 41.23 y las técnicas forenses de ADN. ADN aislado de manchas de sangre en los
pantalones y la camisa de un acusado fue amplificado por PCR y se compararon con el ADN de la
víctima, así como la parte demandada mediante electroforesis en gel y autorradiografía. ADN de
las manchas de sangre en la ropa del acusado coincidía con el patrón de la víctima, pero no el de la
demandada. La frecuencia de un encuentro casual del patrón de ADN en la ropa y la víctima es de
aproximadamente 1 en 33 millones de dólares. carriles λ, 1 kb y TS se refieren al control de
manchas de sangre en los pantalones del acusado y la camisa (dos cantidades diferentes
analizadas); V representa la muestra de ADN de la sangre de la víctima.
Figura 41.24 análisis de expresión génica con microarrays. Los niveles de expresión de miles de
genes pueden ser analizados al mismo tiempo mediante el uso de microarrays de DNA (chips de
genes). Aquí, el análisis de 1.733 genes en 84 muestras de tumor de mama revela que los tumores
pueden ser clasificados en distintas clases en función de sus patrones de expresión génica. Rojo
corresponde a la inducción de genes y el verde corresponde a la represión de genes.
Varios tumores del cáncer de mama y la figura 41.25 muestra las diferentes condiciones.

Un análisis de las piscinas del mRNA con el uso de estos chips revelado., Por ejemplo, que
aproximadamente el 50% de los a11 genes de la levadura se expresan a nivel de estado
estacionario de la copia del ARNm 0,1 a 1,0 por celda. Este método de detectar fácilmente las
variaciones en los niveles de expresión que aparecen por genes específicos bajo diferentes
condiciones de crecimiento.