Agrociencia

ISSN: 1405-3195
agrocien@colpos.mx
Colegio de Postgraduados
México

Valles de la Mora, Braulio; Cadisch, Georg; Aluja Schunemann, Andrés

Comparación de metodologías de isótopos para evaluar fijación de n atmosférico y su destino en
suelos y plantas
Agrociencia, vol. 37, núm. 2, marzo-abril, 2003, pp. 117-128
Colegio de Postgraduados
Texcoco, México

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=30237202

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 COMPARACIÓN DE METODOLOGÍAS DE ISÓTOPOS PARA EVALUAR FIJACIÓN
DE N ATMOSFÉRICO Y SU DESTINO EN SUELOS Y PLANTAS

COMPARISON OF ISOTOPE METHODOLOGIES TO ASSESS N2 FIXATION AND ITS

FATE IN PLANTS AND SOILS

Braulio Valles-de la Mora1, Georg Cadisch2 y Andrés Aluja-Schunemann3

1
Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Ganadería Tropical (CEIEGT). FMVZ-UNAM,
Martínez de la Torre, Veracruz, 93600 México. (braulio_36@hotmail.com). 2Imperial College at
Wye, University of London., Wye, Ashford, Kent, England. (g.cadisch@ic.ac.uk). 3ANUIES, Re-
gión Sur-sureste, Mérida, Yucatán (anuiesur@tunku.uady.mx)

RESUMEN
El uso del isótopo estable 15N es considerado una herramienta
indispensable para investigar la fijación de N2 atmosférico por
leguminosas y para trazar el destino de fertilizantes nitrogenados
en sistemas suelo y planta. En este trabajo se describen los méto-
dos más comúnmente usados para determinar el proceso de fija-
ción de nitrógeno por leguminosas forrajeras y se destacan las
diferencias más importantes entre ellos. A fin de entender las
técnicas isotópicas disponibles, la revisión describe detallada-
mente los métodos de abundancia natural de 15N, la dilución
isotópica de 15N, la técnica de diferencia de N, la determinación
de reducción de acetileno y el método de ureidos. Aunque se acep-
ta que no existe un método perfecto para evaluar la fijación de
N2, se considera útil una descripción detallada de las técnicas
disponibles, que facilite la selección del método más conveniente
según las condiciones específicas del experimento. Se mencio-
nan las ventajas y desventajas y se discute la aplicación de los
métodos. Se destaca que una cuidadosa elección del método dará
resultados más precisos y confiables, lo que a su vez disminuirá
la probabilidad de errores.
ABSTRACT
The use of the stable isotope 15
N is considered an indispensable
tool to study N2 fixation by plant legumes and trace the path of
nitrogen fertilizer in soil and plant systems. This paper describes
the most common methods used to assess the N2 fixation process
by forage legumes and highlights the most important differences
among them. A revision of the natural 15N abundance, 15N isotope
dilution, N-difference technique, the acetylene reduction assay
(ARA) and ureides methods is reviewed here in order to understand
the different available techniques. Although there is no absolute
method by which the N2 fixation can be tested, a detailed
description of the available methods is necessary in order to select
the most convenient according to specific experimental conditions.
Advantages and drawbacks of the different methods are discussed,
as well as their applicability. A careful choice of the method will
give more reliable and accurate results, and guidelines are given
for each one of the mentioned methods in order to diminish
potential errors.
Key words: N2 fixation, stable isotopes, plant/soil systems.

Palabras clave: Fijación de N2, isótopos estables, sistemas suelo/

INTRODUCTION
planta.

N
itrogen is the most abundant component of a
INTRODUCCIÓN great number of essential compounds that take
part in the functioning of multiple biological

E
l nitrógeno es el constituyente más abundante de
organisms, and the deficiency of this element in the plants
un gran número de compuestos esenciales que
limits its primary productivity. Nevertheless, the inert
intervienen en el funcionamiento de múltiples or-
molecule of N2 (atmospheric nitrogen) is not usable by
ganismos biológicos, y la deficiencia de este elemento
most of the biological systems, since these only can use
en las plantas limita su productividad primaria. Sin em-
the combined nitrogen, that is already associate with other
bargo, la molécula inerte de N2 (nitrógeno atmosférico)
elements to form ions such as the ammonium (NH4+) or
no es utilizable por la mayor parte de los sistemas bioló-
nitrate (NO−3 ). Therefore, the plants depend on the present
gicos, ya que éstos sólo pueden usar el “nitrógeno com-
N in more reactive combinations. This biologically usable
binado”, es decir aquél que está ya asociado con otros
N includes only a small fraction of the total N present in
elementos para formar iones tales como el amonio (NH+4 )
the earth. Here the N2 fixation process acquires
o nitrato (NO3−). Así pues, las plantas dependen del N
importance, because it is involved in the transformation
Recibido: Julio, 2002. Aprobado: Diciembre, 2002. of the greatest volume of atmospheric N2 to forms
Publicado como ENSAYO en Agrociencia 37: 117-128. 2003. usable by the plants. It has been calculated that around

117
118 AGROCIENCIA VOLUMEN 37, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL 2003
presente en combinaciones más reactivas. Este N bioló-
gicamente utilizable comprende sólo una pequeña frac-
ción del N total presente en la tierra. Aquí el proceso de
fijación de N2 adquiere su importancia al ser responsable
de la transformación del mayor volumen de N2 atmosfé-
rico a formas utilizables por las plantas. Se ha calculado
que alrededor de 100 millones t de N combinado están
disponibles para la biosfera cada año por este proceso
(Lewis, 1986).
Métodos para determinar la fijación
de N2 atmosférico
Isótopos estables de nitrógeno
El isótopo más común del N tiene un peso atómico
de 14, aunque existe un isótopo más pesado (15N), que
contiene un neutrón más que el núcleo de la forma abun-
dante (14N). Aunque las características químicas de los
átomos en 15N y 14N son idénticas, existen pequeñas di-
ferencias cuantitativas debido a sus diferentes masas y
diferentes energías de activación. La concentración de
15
N en el aire es muy estable y constituye 0.3663%
(Mariotti, 1983); ese valor tiene una variación de
±0.0004% (Axmann y Zapata, 1990). A esta concentra-
ción se le denomina abundancia natural.
Aunque la existencia del 15N fue demostrada en 1929
(Middelboe y Johansen, 1990), su aplicación ha sido más
intensa en las últimas tres décadas mediante
metodologías que utilizan la espectrometría de masas
de flujo de isótopos. Ya que los fertilizantes nitrogenados
han contribuido al incremento de la producción agríco-
la, el empleo del isótopo estable de 15N ayuda a detec-
tar, medir y rastrear el destino del fertilizante y el N de
los residuos en plantas y suelo. La rápida expansión del
uso de isótopos estables ha originado un mejoramiento
en los equipos de detección y en las técnicas analíticas.
Los isótopos estables tienen la ventaja de estar presen-
tes en forma natural, y los cambios en su distribución y
abundancia natural en plantas y suelos ofrecen informa-
ción relevante relacionada con el funcionamiento de los
ecosistemas.
La evaluación precisa del N simbióticamente fijado
por leguminosas es esencial para determinar la función
de estas especies en el mejoramiento de agroecosistemas
o en el mantenimiento de los niveles de N en el suelo. El
problema central en la cuantificación del N simbiótica-
mente fijado es la selección del método apropiado. Nin-
gún método puede determinar la cantidad de N sin in-
troducir algún error inherente al método (Hauser, 1992).
Chalk y Ladha (1999) mencionan que la principal difi-
cultad es la elección de la planta de referencia no fijadora
de N que debe emplearse en este proceso. Bergersen
(1980) resumió las dificultades para evaluar el contenido
100 million t of combined N is available for the biosphere
every year by this process. (Lewis, 1986).
Methods to assess atmospheric N2 fixation
Stable nitrogen isotopes
The most common isotope of the N has an atomic
weight of 14, although a heavier isotope exists (15N),
which contains a neutron more than the nucleus of the
abundant form (14N). Although the chemical
characteristics of atoms in 15N and 14N are identical, there
are small quantitative differences due to its different
masses and different activation energies. The
concentration of 15N in the air is very stable (Mariotti,
1983) and constitutes the 0.3663%; this value has a
variation of ±0.0004% (Axmand and Zapata, 1990). This
concentration is named natural abundance.
Although the existence of 15N was proven in 1929
(Middelboe and Johansen, 1990), its application has been
more intense in the last three decades with the
development of new methodologies that use the flow-
isotope mass spectrometry. Since the nitrogen fertilizers
have contributed to the increase of the agricultural
production, the use of the stable isotope of 15N aid to
detect, to measure and to track the fate of the N fertilizer
and the residual N in plants and soil. The rapid expansion
in the stable isotope use has originated an improvement
in the detection instruments and analytical techniques.
The stable isotopes have the advantage of being present
in natural form, and changes in their distribution and
natural abundance in plants and soils offer excellent
information related to the functioning of the ecosystems.
The precise determination of the N symbiotically
fixed by legumes is essential to determine the role of
these species in the improvement of agroecosystems or
the maintenance of the N levels in the soil. The central
problem in the quantification of the N symbiotically fixed
is the selection of the appropriate method. No method
can determine the amount of N without introducing some
inherent error to the method (Hauser, 1992). Chalk and
Ladha (1999) mention that the main difficulty is the
election of the non-fixing N reference plant that must be
used in this process. Bergersen (1980) summarized the
difficulties to determine the N fixed and emphasized that
considerable losses occurs by denitrification or leaching;
also, the variability in the content of the biological
material increases the analytical errors.
The use of the isotope 15N in the nitrogen fixation
Methods with 15N have been used to know the
biochemistry of the N2 fixation, to study the factors which
affect the N2 fixation, to evaluate the capacity of
 VALLES DE LA MORA et al.: METODOLOGÍAS DE ISÓTOPOS PARA EVALUAR FIJACIÓN DE N ATMOSFÉRICO
de N fijado y destacó que pérdidas considerables ocu-
rren por desnitrificación o por lixiviación; además, la
variabilidad en el contenido del material biológico
incrementa los errores analíticos.
El uso del isótopo 15N en la fijación de nitrógeno
Los métodos con 15N se han utilizado para investi-
gar la bioquímica de la fijación del N2, para estudiar los
factores que afectan la fijación del N2, evaluar la capa-
cidad de microorganismos para fijar N2, medir el des-
plazamiento de N2 simbióticamente fijado, en estudios
del balance de N, y la calibración de la técnica para la
reducción de acetileno.
La abundancia de 15N en cualquier medio es medida
mediante el análisis de una planta de referencia (no-
fijadora de N2), la cual es totalmente dependiente del N
del suelo para su crecimiento. La fijación de N2 puede
ser determinada por los cambios en el enriquecimiento
de 15N en una planta-fijadora debido a la asimilación de
N2 atmosférico de bajo enriquecimiento. También pue-
de usarse N sin 15N (N privado de 15N), pero el empleo
de este material es más delicado debido a riesgos de con-
taminación, aunque su costo es menor que el 15N enri-
quecido. El uso de 15N para medir la proporción de N2
tiene la ventaja de no ser dependiente del rendimiento
cosechado. Existen limitaciones inherentes en la utili-
zación del 15N: (1) baja disponibilidad de espectrómetros
de masas en países en desarrollo; (2) restricciones para
utilizar 15N en fase gaseosa en experimentos de campo
y en experimentos de largo plazo debido a la dificultad
para mantener constantes las condiciones de fase gaseosa
en un sistema cerrado; (3) es necesario determinar el
nivel de enriquecimiento de 15N a utilizar; (4) debe co-
nocerse la sensibilidad y la reproducibilidad de las me-
diciones de 15N antes de diseñar el experimento; (5) debe
conocerse el contenido de nitrógeno del material expe-
rimental; (6) altos costos de equipo para medir 15N, así
como del fertilizante enriquecido y, (7) se requiere un
alto nivel de entrenamiento del personal para evitar con-
taminaciones cruzadas.
El método de la dilución del 15N
15
El método de dilución de N permite evaluar cada
una de las diferentes fuentes de N en la planta, y es el
más usado para medir fijación de N2. El método requie-
re la aplicación al suelo de una pequeña dosis de fertili-
zante enriquecido con 15N previo a la siembra: 1-10 kg
N ha-1 con 1 a 10 % de exceso de átomos 15N, a fin de
reducir cualquier interferencia con la fijación de N2 de
la leguminosa. El enriquecimiento de las muestras de
plantas se expresa como porcentaje de átomos 15N en
exceso, y se estima de la siguiente forma:
119
microorganisms to fix N2, to measure the displacement
of N2 symbiotically fixed, to determine N balance, and
for calibration of the technique for the acetylene
reduction.
The abundance of 15N in any environment is
determined by analysis of a reference plant (non-fixing
N2 plant), which is totally dependent upon the soil N for
its growth. The N2 fixation can be determined by the
changes in the enrichment of 15N in the fixing plant due
to the assimilation of atmospheric N2 of low enrichment.
Also 15N-depleted material (N deprived of 15N) can be
used, but its use is more difficult due to contamination
risks, although its cost is lower than the 15N enriched.
Using 15N to measure the proportion of N2 has the
advantage of not being dependent upon the harvested
yield. There are inherent limitations in the use of 15N: (1)
low availability of mass spectrometers in developing
countries; (2) restrictions to use 15N in gaseous phase in
field experiments, as well as in long-term experiments
because it is difficult to maintain constant conditions for
the gaseous phase in a closed system; (3) it is necessary
to determine the level of enrichment of 15N to use; (4)
sensitivity and reproducibility of the measurements of
15
N must be known before designing the experiment; (5)
the nitrogen content of the experimental material must
be known; (6) high costs of equipment to measure 15N,
as well as of the enriched fertilizer and, (7) a high level
of training of the personnel is required to avoid cross-
contaminations.
The method of the 15N-dilution
The method of 15N-dilution allows to evaluate each
one of the different N-sources in the plant, and it is the
most used to determine fixation of N2. The method
requires the application to the soil of a small dose of
fertilizer enriched with 15N before sowing: 1-10 kg N
ha-1 with 1 to 10 atom % 15N in excess, in order to reduce
any interference with the fixation of N2 of the legume.
The enrichment of the samples of plants is expressed as
percentage of atoms 15N in excess, and it is determined
as follows:
% atom 15N excess = (% atom 15N sample − % atom 15N
in N2 air) (1)
where % of atoms of 15N in air N2 is 0.3663.
The proportion of the N of the plant that is derived
from the atmospheric N2 and the N of the soil, can be
calculated if the isotopic abundance between these two
sources is different. This is obtained comparing the
enrichment in 15N of nodulated legume with non-fixing
N2 reference plants.
120 AGROCIENCIA VOLUMEN 37, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL 2003
% átomos 15N en exceso = (% átomos 15N muestra − %
átomos 15N en N2 del aire) (1)
donde el % de átomos de 15N en el N2 del aire es
0.3663.
La proporción del N de la planta que es derivada del
N2 atmosférico y del N del suelo puede ser calculada si
la abundancia isotópica entre estas dos fuentes es dife-
rente. Esto se logra comparando el enriquecimiento en
15
N de leguminosas noduladas con plantas de referencia
no fijadoras de N2.
La siguiente ecuación, tomada de McAuliffe et al.
(1958), se puede utilizar para evaluar el porcentaje de N
atmosférico fijado de la leguminosa (P):
% átomos 15N en exceso en leg
P = 1− × 100 (2)
% átomos 15N en exceso en ref
El porcentaje de átomos de 15N en el N derivado del
suelo en la leguminosa se mide a partir del porcentaje
de átomos de 15N de una planta de referencia no fijadora
de nitrógeno que crece en el mismo suelo y en el mismo
periodo que la leguminosa.
En el método se supone que: (1) la relación 14N/15N
de la planta no fijadora es la misma que la del N del
suelo; (2) la leguminosa y la planta de referencia explo-
ran el mismo volumen de suelo de idéntica relación 14N/
15
N; (3) ambas plantas deben absorber la misma canti-
dad relativa del 15N añadido y de N del suelo y, (4) que
la dinámica de absorción es la misma.
Salgado et al. (2001) compararon esta técnica y la
de diferencia total de N para evaluar la eficiencia de re-
cuperación de nitrógeno en caña de azúcar (Saccharum
officinarum L.) utilizando varias fuentes de N marcadas
con 15N, en una zona cañera de Tabasco, México. Ellos
encontraron que la eficiencia en la recuperación del N
aplicado, determinada por el método de la diferencia
total, fue mayor que la determinada por el método
isotópico. En el mismo Estado, pero en la región Plan
Chontalpa, Espinoza-Flores et al. (2002) evaluaron la
eficiencia de la fertilización nitrogenada en sorgo
(Sorghum bicolor) por medio de la técnica isotópica de
15
N para medir la abundancia de este isótopo en tallos,
hojas y grano a diferentes etapas fenológicas; los resul-
tados para eficiencia de la fertilización nitrogenada fue-
ron confiables.
Ledgard y Peoples (1988) y Peoples et al. (1989)
mencionaron que los errores más frecuentes para medir
la fijación de N2 ocurren cuando la leguminosa y la planta
de referencia difieren en la relación del N absorbido pro-
veniente del 15N con aquél tomado del suelo. Esto fue
observado por Gil et al. (1997), cuando utilizaron
The following equation, taken from McAuliffe et al.
(1958), may be used to determine the atmospheric
percentage of fixed N of the legume (P):
% atom 15N in excess in leg
P = 1− × 100 (2)
% atom 15N in excess in ref
The percentage of atoms of 15N in the N derived from
the soil in the legume is determined from the percentage
of atoms of 15N of a non-fixing reference plant that grows
in the same soil and in the same period that the legume.
In the method it is supposed that: (1) relation 14N/15N
of the non-fixing plant is the same as in the N of the soil;
(2) the legume and the reference plant explore the same
volume of soil with identical relation 14N/15N; (3) both
plants must absorb the same relative amount of 15N added
and N of the soil, (4) that the absorption dynamics is the
same.
Salgado et al. (2001) compared this technique and
the one of the total N-difference to evaluate the efficiency
of sugarcane (Saccharum officinarum L.) nitrogen
recovery using several labeled 15N sources, in a sugarcane
zone of Tabasco, México. They found that the efficiency
in the recovery of the applied N, determined by the total
N-difference method, was greater than that of the isotopic
method. In the same State, but in the Plan Chontalpa
region, Espinoza-Flores et al. (2002) evaluated the
efficiency of the nitrogen fertilization in sorghum
(Sorghum bicolor) using the isotopic technique of 15N to
measure the abundance of this isotope in stems, leaves
and grain at different phenologic stages; the results were
reliable for efficiency of the nitrogen fertilization.
Ledgard and Peoples (1988) and Peoples et al. (1989)
mentioned that the most frequent errors to measure the
N2-fixation occurs when the legume and the reference
plant differ in the relation of the absorbed N originated
from 15N with that taken from the soil. This was observed
by Gil et al. (1997), when they used Brachiaria
humidicola as a non-fixing grass in pastures associated
with the forage legumes Centrosema pubescens, Pueraria
phaseoloides or Stylosanthes hamata. They observed an
unequal pattern of N uptake from the soil between species
and, therefore, measurements of the N2-fixed were
erroneous.
Previously, Wagner and Zapata (1982) approached
the problem of the suitable reference crop for studies of
nitrogen fixation using the isotopic technique of double
labeling (labeling of the soil with 15N and 35S). These
researchers used faba bean (Vicia faba) and soybean
(Glycine max) as N2-fixing species; they determined the
symbiotic fixation of N using Sudan grass (Sorghum
sudanense) radish (Raphanus sativus) and barley
(Hordeum vulgare) as reference plants. The interval of
 VALLES DE LA MORA et al.: METODOLOGÍAS DE ISÓTOPOS PARA EVALUAR FIJACIÓN DE N ATMOSFÉRICO
Brachiaria humidicola como gramínea no fijadora en
praderas asociadas con las leguminosas forrajeras
Centrosema pubescens, Stylosanthes hamata o Pueraria
phaseoloides. Ellos observaron un patrón desigual de
toma de N del suelo entre especies y, por lo tanto, fue-
ron erróneas las mediciones del N2 fijado.
Wagner y Zapata (1982) abordaron el problema del
cultivo de referencia idóneo para estudios de fijación de
nitrógeno usando la técnica isotópica de doble marcaje
(marcaje del suelo con 15N y 35S). Estos investigadores
emplearon haba (Vicia faba) y soya (Glycine max) como
especies fijadoras de nitrógeno y determinaron su fija-
ción simbiótica usando como plantas de referencia zacate
sudán (Sorghum sudanense) rábano (Raphanus sativus)
y cebada (Hordeum vulgare). El intervalo de fijación de
N fue de 74 a 83% y concluyeron que los tres cultivos
de referencia fueron satisfactorios para los propósitos
indicados.
En vista de la importancia de la selección apropiada
de una planta no fijadora de N2, Thomas et al. (1997)
realizaron un experimento usando Brachiaria
dictyoneura como gramínea acompañante. Ellos califi-
caron como satisfactoria a esta planta no fijadora de N2
al cotejarla con las leguminosas Stylosanthes capitata,
Centrosema acutifolium y Arachis pintoi. La técnica de
la dilución del isótopo 15N también fue utilizada por
Cadisch et al. (1989) para evaluar el efecto del aporte
de P:K en la fijación de N2 en ocho leguminosas
forrajeras tropicales. Encontraron que suelo pobre en P
y K la fijación de N2 se redujo, y reportaron considera-
bles diferencias entre especies en el N derivado de la
atmósfera. Algunas desventajas del método de dilución
de 15N son el alto costo del fertilizante enriquecido, la
reducción (en el tiempo) del enriquecimiento de 15N del
N del suelo disponible para la planta, la distribución no-
uniforme de 15N (Witty y Ritz, 1984), y la contamina-
ción cruzada. Estos efectos conducen a errores impor-
tantes si la toma de N, en tiempo y espacio, por las plan-
tas de referencia no fijadoras difiere de aquél que toma
la leguminosa (Ledgard et al., 1985).
El método de la abundancia natural del 15N
Este método es una variación de la técnica de dilu-
ción de isótopos, basada en pequeñas diferencias en la
abundancia natural de 15N entre el N2 atmosférico
(0.3663% átomos 15N) y el N del suelo. Estas diferencias
se expresan como delta (δ)15N o partes por mil (‰) rela-
tivo a la composición de 15N en el N2 atmosférico (Shearer
y Kohl, 1986) y se calcula de la siguiente forma:
% átomos 15N (muestra) – % átomos 15N (std)
δ 15N(‰) =
% átomos 15N (std)
121
N fixation was 74 to 83% and they concluded that the
three reference plants were satisfactory for their
objectives.
Since the appropriate selection of a non-fixing N2
plant is important, Thomas et al. (1997) carried out an
experiment using Brachiaria dictyoneura as
accompanying grass. They found that this non-fixing N2
plant was satisfactory when matched with the legumes
Stylosanthes capitata, Centrosema acutifolium and
Arachis pintoi. The technique of the 15N isotope dilution
also was used by Cadisch et al. (1989) to determine the
effect of the contribution of P:K in the fixation of N2 in
eight tropical forage legumes. They found that in soil
low in P and K the N2-fixation was reduced, and reported
large differences among species in the N derived from
the atmosphere. Some disadvantages of the dilution of
15
N method are the high cost of the enriched fertilizer,
the reduction (in the time) of the enrichment of 15N of
the N of the soil available for the plant, the non-uniform
distribution of 15N (Witty and Ritz, 1984), and the cross-
contamination. These effects lead to mistakes if the N
uptake, in time and space, by the reference non-fixing
plants differs from the legume uptake (Ledgard et al.,
1985).
Natural 15N abundance method
This method is a variation of the isotope dilution
technique, based on small differences in the natural
abundance of 15N between atmospheric N2 (0.3663%
atoms 15N) and the soil N. These differences are expressed
as delta (δ)15N or parts by thousand (‰) relative to the
composition of 15N in the atmospheric N2 (Shearer and
Kohl, 1986) and it is calculated as follows:
% atom 15N (sample) – % atom 15N (std)
δ 15N(‰) = × 1000 (3)
% atom 15N (std)
where (std) is the standard atmospheric abundance of 15N,
that is, 0.3663% atoms of 15N. Therefore, by definition,
the value of d15N of the N2 of the air is equal to zero.
Shearer and Kohl (1986) mentioned that soils are
more enriched in 15N (range of δ15N=−6 to +16%) in
comparison to the atmospheric N2 (δ15N=0%); this
enrichment is due to the isotopic discrimination in the
processes of volatilization of ammonium, nitrification,
denitrification and other N transformations in the soil.
Since 15N is heavier than 14N, the compounds with 15N
tend to react more slowly. The net effect is that through
time, the soil becomes slightly more enriched with 15N,
× 1000 (3) and these differences, in fixing and no-fixing plants, are
used to calculate the fixed N2.
122 AGROCIENCIA VOLUMEN 37, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL 2003
donde el (std) estándar es la abundancia de 15N atmosfé-
rico, es decir 0.3663% átomos de 15N. Por consiguiente,
por definición el valor de δ15N del N2 del aire es igual a
cero.
Shearer y Kohl (1986) mencionan que los suelos es-
tán más enriquecidos en 15N (intervalo de δ15N= −6 a
+16‰) en comparación con el N2 de la atmósfera
(δ15N=0‰) y este enriquecimiento se debe a la discri-
minación isotópica en los procesos de volatilización de
amonio, nitrificacion, denitrificación y otras transfor-
maciones del N en el suelo. Ya que el 15N es más pesado
que el 14N, los compuestos con el primero tienden a re-
accionar más lentamente. El efecto neto es que a través
del tiempo el suelo se vuelve ligeramente más enrique-
cido con 15N, y estas diferencias, en plantas fijadoras y
de referencia, son usadas para calcular el N2 fijado.
El porcentaje (P) de N2 atmosférico que es fijado
por la leguminosa se calcula mediante la siguiente ecua-
ción (4) propuesta por Bergersen y Turner (1983) y
Ledgard et al. (1985):
δ 15N ref − δ 15N leg
P= × 100 (4)
δ 15N ref − B
donde B es el δ 15N de la leguminosa que crece con N2
atmosférico como la única fuente de nitrógeno, δ 15N
ref y δ 15N leg son las unidades de d 15N (%) para las
plantas no fijadoras (referencia) y leguminosa.
Considerando que el N del suelo es generalmente
más abundante en 15N que el N2 atmosférico, se espera-
ría que las plantas no fijadoras, en las que la fuente pri-
maria de N es el derivado del suelo, tuvieron más 15N
que las plantas fijadoras que toman el N2 de la atmósfe-
ra así como del suelo.
La separación de los isótopos 15N y 14N se puede
hacer mediante espectrometría de emisión o de masas.
La ventaja de los espectrómetros de alta precisión es su
capacidad de medir diferencias extremadamente peque-
ñas en abundancia isotópica entre el material experimen-
tal y un estándar del nitrógeno (Robinson y Smith, 1991).
Ledgard y Peoples (1988) mostraron resultados si-
milares entre la técnica de la abundancia natural de 15N
y aquéllas que usan enriquecimiento artificial con 15N.
Algunas ventajas y limitaciones del método de la abun-
dancia natural de 15N son mencionadas por Peoples et
al. (1989).
Ventajas: (1) no requiere la adición de 15N; (2) el δ15N
del N del suelo disponible para las plantas puede ser
relativamente constante con la profundidad y tiempo y,
(3) la selección de las plantas de referencia puede ser de
The percentage (P) of atmospheric N2 that is fixed
by the legume is calculated following the equation (4)
proposed by Bergersen and Turner (1983) and Ledgard
et al. (1985):
δ 15N ref − δ 15N leg
P= × 100 (4)
δ 15N ref − B
where B is the d15N of the legume that grows with
atmospheric N2 as the only nitrogen source, d15N ref and
d15N leg are the units of d15N (‰) for the non-fixing
reference plant and legume.
Considering that soil is N generally more abundant
in 15N than the atmospheric N2, it would be expected that
the non-fixing plants in which the primary N source is
that derived from the soil, would have more 15N than the
fixing plants which take N2 from the atmosphere and the
soil.
The separation of isotopes 15N and 14N can be done
by mass spectrometry or spectrometry of emission. The
advantage of high precision spectrometers is its capacity
to measure extremely small differences in isotopic
abundance between the experimental material and a N
standard (Robinson and Smith, 1991). Ledgard and
Peoples (1988) showed similar results between the natural
15
N abundance technique and those using artificial
enrichment with 15N. Some advantages and limitations
of the method of the natural 15N abundance are mentioned
by Peoples et al. (1989).
Advantages: (1) it does not require the addition of 15N;
(2) the δ15N of the N of the soil available for the plants
can be relatively constant with depth and time and, (3)
the selection of the reference plants can be of minor
importance than in studies with 15N enriched, although
in some cases it is necessary to take precautions when
matching reference plants with N2-fixing plants (Cadisch
et al., 2000).
Limitations: (1) requirement of a precise mass
spectrometer and meticulous analytical procedures; (2)
it is needed to measure the factor of discrimination (B
value) in the legumes during the N2-fixation; (3) the
technique is insensible if the δ15N of the soil is near the
δ15N of the air, and it is suggested that the δ15N of the
soil be >5 and, (4) the field variability can be considerable
in some cases.
In order to reduce the effect of field variability,
Unkovich et al. (1994) suggested a method of paired
sampling in systems of associated pastures, v.gr., by each
sample of legume, a grass sample from a bordering zone
is taken.
 VALLES DE LA MORA et al.: METODOLOGÍAS DE ISÓTOPOS PARA EVALUAR FIJACIÓN DE N ATMOSFÉRICO
menor importancia que en estudios con 15N enriqueci-
do, aunque en algunos casos es necesario tomar precau-
ciones al cotejar plantas de referencia con las plantas
fijadoras (Cadisch et al., 2000).
Limitaciones: (1) se requiere un espectrómetro de ma-
sas preciso y procedimientos analíticos meticulosos; (2)
se necesita medir el factor de discriminación (B value)
en las leguminosas durante la fijación de N2; (3) la téc-
nica es insensible si el δ15N del suelo es cercano al δ15N
del aire y se sugiere que el δ15N del suelo sea >5 y, (4) la
variabilidad en el campo puede ser considerable en al-
gunos casos.
Para reducir el efecto de variabilidad en el campo,
Unkovich et al. (1994) sugirieron un método de muestreo
apareado en sistemas de pasturas asociadas, v.gr., por
cada muestra de leguminosa se toma una muestra de una
gramínea aledaña.
Una deficiencia del método de abundancia natural
de 15N es que una pequeña variación en el δ15N corres-
ponde comparativamente a una enorme diferencia en la
fijación de N2 (Vose et al., 1981). Sin embargo se ha
usado este método de manera exitosa para determinar la
fijación de N2 en leguminosas forrajeras y de grano
(Cadisch et al., 2000; Cadisch et al., 1993; Hossain et
al., 1995; Sanford et al., 1995; Bolger et al., 1995).
El método de la diferencia total de N
El método está basado en el rendimiento total del N
de la leguminosa, así como de la planta de referencia
que crece en el mismo suelo (Giller y Wilson, 1991). La
substracción del N en la planta de referencia de aquél en
la planta fijadora dará un estimado del N2 fijado.
Peoples y Herridge (1990) mencionaron dos reque-
rimientos básicos del método: (1) el N en la planta de
referencia proviene sólo del suelo y, (2) la leguminosa y
la planta de referencia absorben la misma cantidad de N
del suelo. Ellos sugirieron que las dos plantas deben
explorar idealmente el mismo volumen en la zona de las
raíces, tener la misma capacidad de extraer y utilizar el
N mineral del suelo, y acumular el N del suelo en el
mismo periodo. Las comparaciones de este método con
los de abundancia natural de 15N o de dilución de 15N
han producido resultados contrastantes. Kohl et al.
(1980) encontraron una buena relación entre el método
de diferencia total de N y abundancia natural de 15N en
tres experimentos con soya (Glycine max) usando como
referencia una línea no nodulante de esta especie. Por el
contrario, Carrancá et al. (1999) con Trifolium
subterraneum como leguminosa fijadora, y una mezcla
de Lolium perenne con Dactylis glomerata como plan-
tas de referencia, observaron que el método de la dife-
rencia de N mostró valores más bajos en varios períodos
de muestreo, comparado con los métodos de dilución y
123
A deficiency of the natural 15N abundance method is
that a small variation in δ15N corresponds comparatively
to a large difference in the N2-fixation (Vose et al., 1981).
Nevertheless, this method has been successfully used to
estimate N2-fixation in forage legumes and grain legumes
(Cadisch et al., 2000; Cadisch et al., 1993; Hossain et
al., 1995; Sanford et al., 1995; Bolger et al., 1995).
The total N-difference method
The method is based on the total N yield of the
legume, as well as of the reference plant that grows in
the same soil (Giller and Wilson, 1991). The subtraction
of the N in the reference plant of that one in the fixing
plant gives an estimator of the N2 fixed.
Peoples and Herridge (1990) mentioned two basic
requirements of the method: (1) the N in the reference
plant comes only from the soil and, (2) the legume and
the reference plant absorb the same amount of N of the
soil. They suggested that the two plants must ideally
explore the same volume in the root-zone, to have the
same capacity to extract and use the mineral soil-N, and
to accumulate the N of the soil in the same period. The
comparisons of this method with those of natural
abundance of 15N or dilution of 15N have produced
contrasting results. Kohl et al. (1980) found a good
relationship between the total N-difference method and
natural 15N abundance in three experiments with soybean
(Glycine max) using as reference a non-nodulating line
of this species. On the contrary, Carrancá et al. (1999)
used Trifolium subterraneum as fixing-N2 legume, and a
mixture of Lolium perenne with Dactylis glomerata as
reference plants, and observed that the total-N difference
method showed lower values in several periods of
sampling, compared with the 15N-dilution and natural 15N
abundance methods. Nevertheless, since the method is
dependent of the crop yield, it is considered not so
reliable.
The acetylene reduction method
Since the nitrogenase (the N2-fixation enzyme) can
reduce other substrates with triple bond such as acetylene
(C2H2) to ethylene (C2H4), this latter reaction is the basis
of the acetylene reduction technique. The reduction can
be quantified by gas chromatography (Giller and Wilson,
1991) reading the concentration (peaks) of both gases.
According to Turner and Gibson (1980) the technique is
simple, rapid, of low equipment and resources costs.
However, these authors added that the apparent simplicity
of the method can be deceptive because of several
operational problems, and interpretation of the results
requires great care. One disadvantage is that it is
complicated to measure N2 fixation in soils due to the
124 AGROCIENCIA VOLUMEN 37, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL 2003
de abundancia natural de 15N. Sin embargo, dado que el
método depende del rendimiento, se le considera poco
confiable.
El método por reducción de acetileno
Puesto que la nitrogenasa (enzima responsable de la
fijación de N2) puede reducir otros substratos con triple
enlace tales como acetileno (C2H2) a etileno (C2H4), esta
última reacción es la base del método por reducción de
acetileno. La reducción se puede cuantificar por
cromatografía de gases (Giller y Wilson, 1991) a través
de la lectura de los picos de concentración de ambos
gases. Según Turner y Gibson (1980) la técnica es sim-
ple, rápida, de bajo costo de equipo y recursos. Sin em-
bargo, estos autores mencionaron que la simplicidad
evidente del método puede ser engañosa debido a pro-
blemas operativos y a que los resultados requieren una
interpretación cuidadosa. Otra desventaja es que es com-
plicado medir la fijación del N2 en suelos debido a los
efectos del acetileno en los procesos microbianos. Otros
problemas resultan de la diferencia en solubilidad e ín-
dices de difusión del acetileno y del etileno en suelos,
asi como a alteraciones de la función nodular (Giller y
Wilson, 1991). Este método no es lo suficientemente
exacto, ni siquiera para estudios comparativos entre le-
guminosas (Peoples et al., 1989).
En el trópico húmedo de Veracruz, Melchor-
Marroquin et al. (1999) aplicaron esta técnica y encon-
traron que la aplicación de podas al follaje afectó la ac-
tividad de la enzima nitrogenasa en cocuite (Gliricidia
sepium). Así, los investigadores hicieron propuestas acer-
ca del manejo de la especie como componente
agroforestal.
El método de ureidos
Debido a que existen importantes diferencias en las
formas principales de N transportadas en el xylema de
leguminosas noduladas y no noduladas, es posible utili-
zar la abundancia de ureidos en la savia del xylema como
medida indirecta de la proporción de N de la planta de-
rivado de la fijación de N2. Muchas leguminosas tropi-
cales, principalmente Phaseoleae y Desmodieae, trans-
portan los productos de la fijación de N2 desde los
nódulos a otras partes de la planta en forma de ureidos,
alantoina y ácido alantoico (Giller y Wilson, 1991;
Peoples y Herridge, 1990). Este método es aplicable a
las leguminosas de grano más importantes, pero no a
muchas leguminosas forrajeras.
El muestreo del xylema es rápido, sencillo, y no es
totalmente destructivo. También se pueden extraer ureidos
de muestras secas de plantas, como los peciolos, lo que
simplifica la aplicación de la técnica. Los componentes
effects of acetylene on microbial processes. Other
problems result from the differences in solubility and rates
of diffusion of acetylene and ethylene in soils, as well as
alterations on the nodulating function (Giller and Wilson,
1991). This method is not accurate enough, even for
comparative studies between legumes (Peoples et al.,
1989).
In the humid tropic of Veracruz, Melchor-Marroquin
et al. (1999) applied this technique and found that the
foliage prunings affected the activity of the enzyme
nitrogenase in cocuite trees (Gliricidia sepium). The
authors made proposals about the management of this
species as agroforestal component.
The ureides method
Because there are important differences in the
principal forms of N transported in the xylem of nodulated
and non-nodulated legumes, it is possible to use the
abundance of ureides in the xylem sap as an indirect
measure of the proportion of plant N derived from N2
fixation.
In many tropical legumes, mainly Phaseoleae and
Desmodieae, the product of N2 fixation is transported
from the nodules to other plant parts in form of the
ureides, allantoin and allantoic acid (Giller and Wilson,
1991; Peoples and Herridge, 1990). This method is
applicable to the more important grain legumes, but not
for many forage legumes.
The sampling of xylem is rapid, simple, and not
completely destructive. Also, it is possible to extract
ureides from dry samples of plants, as petioles, which
simplifies the application of the technique. N solute
components can be analyzed by colorimetric analyses.
Not expensive equipment is necessary, and many samples
can be collected and analysed on a single day. Some
limitations are: (1) the method is valid only for legumes
that export ureides; (2) it requires calibration for different
plant age to cover all stages of growth; (3) diurnal
variations for solute concentration and volume, (4) sap
composition is stable for only 4 h at 25 to 30 oC (Peoples
and Herridge, 1990). However, the major disadvantage
of the method is that it provides only a short-term measure
of symbiotic dependence. Thus, to determine seasonal
N2 fixation are required, it would be necessary to repeat
measurements of xylem combined with sequential
sampling for dry matter and N.
Limitations to the biological nitrogen fixation
The environmental conditions determine to a large
extent the symbiotic efficiency of the N2-fixing legumes.
Physical and chemical factors affect the fixation process:
the first case includes the effects by high temperatures
and hydric stress; the second is related to problems by
toxic effects of the soil, such as acidity and aluminum
 VALLES DE LA MORA et al.: METODOLOGÍAS DE ISÓTOPOS PARA EVALUAR FIJACIÓN DE N ATMOSFÉRICO
de N se pueden analizar por métodos colorimétricos. No
es necesario equipo costoso, y se puede recolectar y
analizar un gran número de muestras en un día. Algunas
limitaciones son: (1) el método es válido sólo para legu-
minosas que exportan ureidos; (2) requiere calibración
para diferentes edades de la planta a fin de cubrir todas
las etapas de crecimiento; (3) se presentan variaciones
diurnas para la concentración del soluto y volumen y,
(4) la composición de la savia es estable sólo por 4 h a
25 a 30 oC (Peoples y Herridge, 1990). Sin embargo, la
desventaja principal del método es que proporciona sola-
mente una medida a corto plazo de la dependencia
simbiótica. Así, para evaluar la fijación estacional de N2,
es necesario repetir las mediciones del xylema combina-
das con muestreos secuenciales para materia seca y N.
Limitaciones a la fijación biológica de nitrógeno
Las condiciones ambientales determinan en gran
parte la eficiencia simbiótica de las leguminosas fijadoras
de N2. Factores físicos y químicos afectan el proceso de
fijación: el primer caso incluye los efectos por altas tem-
peraturas y estrés hídrico; el segundo se relaciona con
problemas por efectos tóxicos del suelo, como acidez y
presencia de aluminio, así como deficiencias
nutricionales (Giller y Cadisch, 1995; Giller y Wilson,
1991).
Las altas temperaturas inhiben la fijación de N2, y la
nodulación puede fallar si las temperaturas del suelo al-
canzan 40 ºC o más en los primeros 5 cm de profundi-
dad, temperatura que mata a muchas bacterias reducien-
do su población en el suelo. Los límites máximos para
el crecimiento de rizobios están entre 32 a 47 ºC, aun-
que la tolerancia varía entre especie y cepas (Hungria y
Vargas, 2000). Las altas temperaturas también inhiben
la formación de pelos radicales, lo cual disminuye el
número de sitios posibles para nodulación; es necesario
inocular repetidamente cuando las temperaturas son más
altas a fin de mantener el proceso de fijación de N2
(Hungria y Vargas, 2000). Giller y Wilson (1991) indi-
caron que en periodos cortos las cepas de
Bradyrhizobium son más tolerantes a la sequía que las
cepas de Rhizobium. La tolerancia a la sequía es
influenciada por la capacidad de las plantas para captar
el agua del suelo; las leguminosas de raíces profundas
lo extraen de mayores profundidades para mantener su
potencial hídrico y evitar una reducción en el índice de
fijación de N2 y en el desplazamiento de los productos
de la fijación del N2 a los tallos.
Las limitaciones a la fijación de N2 por acidez del
suelo son importantes, y una proporción significativa
de las áreas tropicales posee esta condición. Dos
implicaciones son (Giller y Wilson, 1991): (1) supervi-
vencia en un medio de pH bajo y, (2) cambios químicos
125
presence, as well as nutritional deficiencies (Giller and
Cadisch, 1995; Giller and Wilson, 1991).
The high temperatures inhibit the N2-fixation, and the
nodulation can fail if the soil temperatures reach 40 ºC
or more in the first 5 cm of depth, temperature which kill
many bacteria reducing their population in the soil. The
maximum limits for the growth of rizobia are between
32 and 47 ºC, although the tolerance varies between
species and strains (Hungria y Vargas, 2000). The high
temperatures also inhibit the formation of root-hairs,
which diminish the number of possible sites for
nodulation; it is necessary to inoculate repeatedly when
the temperatures are higher in order to maintain the
N2 fixation process (Hungria y Vargas, 2000). Giller and
Wilson (1991) indicated that in short periods the strains
of Bradyrhizobium are more tolerant to the drought that
the strains of Rhizobium. The tolerance to the drought is
influenced by the capacity of the plants to absorb the
water of the soil; deep-root legumes extract it from greater
soil depths to maintain their hydric potential and avoid a
reduction in the N2-fixation rate and in the displacement
of the N2 fixation products to the stems.
The limitations to the N2-fixation by acidity of the
soil are important, and a significant proportion of the
tropical areas has this condition. Two implications are
(Giller and Wilson, 1991): (1) survival in a low pH
environment and, (2) chemical changes in the soil caused
by high soil acidity, such as a high proportion of
aluminum and iron-manganese. In acid soils, the
availability of P and Mo diminish and there are Ca
deficiencies. The common peanut (Arachis hypogaea) is
susceptible to Ca deficiency which affects the
development of the pods. The optimum pH for rizobia
growth is between 6.0 and 7.0 and little rizobia grows
well with pH below 5.0, in tropical soils. Hungria and
Vargas (2000) indicated that acidity affects the first stages
of the infection process for the nodulation. According to
Thomas (1995), most of the collected forage legumes by
CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical, Cali,
Colombia) have been selected from acid soils of Latin
America and they are extremely tolerant to acidity. This
author mentions that Calopogonium mucunoides, Arachis
pintoi and Centrosema spp are good options for poor soil
of the tropic pastures. In fact, Arachis species are more
tolerant to acidity that grain legumes, such as soybean or
common bean. Table 1 shows information about the
potential for N2-fixation of several legumes forage. The
range of N2-fixed is between 52 and 88%, according to
the species, region and method used for determining it.
The amount also depend upon type of legume and forage
yield, in addition to their percentage of fixation.
CONCLUSIONS
The use of the stable isotope 15N has an extensive
application in understanding the chemical or biological
126 AGROCIENCIA VOLUMEN 37, NÚMERO 2, MARZO-ABRIL 2003

Cuadro 1. Algunas estimaciones de la fijación de N2 por leguminosas forrajeras tropicales en nivel de campo (adaptado de Giller, 2001).
Table 1. Some estimations of N2 fixation by tropical forage legumes on field (adapted from Giller, 2001).

Especies N2 fijado Periodo País Método† Ref¶

(kg N ha-1) % (Años)

Calopogonium 64-182 - 1 W. Samoa, Dif-N 1, 2

mucunoides Brasil

Centrosema 43 82 0.33 Colombia DI 3

acutifolium

Centrosema 41 83 0.33 Colombia DI 3

macrocarpum

Desmodium 25-110 70-89 0.25-1 Colombia, Dif-N 1,3,4

ascendens W. Samoa, Brasil

Galactia 31-54 81-93 0.27 Brasil DI 4

striata

Pueraria 115 88 0.33 Colombia DI 3

phaseoloides

Stylosanthes 3-179 73-88 0.3-1 Colombia, DI, AN 3, 5, 6

capitata Brasil

Stylosanthes 7-102 68-79 0.3-1.3 Colombia, Brasil DI, 3, 5, 6

guianensis Dif-N, AN

Stylosanthes 4-89 74-88 1-1.4 Colombia, DI, 3, 5, 6

macrocephala Brasil Dif-N, AN

Stylosanthes 22-40 52-70 0.31 Brasil AN 6

scabra

Zornia 61 88 0.33 Colombia DI 3

glabra
†
Dif-N = Diferencia de N; DI = Dilución de isótopos 15N; AN= abundancia natural 15N.
¶
Referencias: (1) Reynolds (1982); (2) Seiffert et al. (1985); (3) Cadisch et al. (1989); (4) Viera-Vargas et al. (1995); (5) Thomas y de Andrade
(1984); (6) Vallis et al. (1977).

en el suelo causados por acidez alta, como una alta pro-
porción de aluminio y hierro-manganeso. En suelos áci-
dos disminuye la disponibilidad de P y Mo y hay defi-
ciencia de Ca. El cacahuate común (Arachis hypogaea)
es susceptible a la carencia de Ca que afecta el desarro-
llo de las vainas. El pH óptimo para el crecimiento de
rizobio está entre 6.0 y 7.0 y poco rizobio crece bien
con pH menor a 5.0, en suelos tropicales. Hungria y
Vargas (2000) asientan que la acidez afecta las primeras
etapas del proceso de infección para la nodulación. De
acuerdo con Thomas (1995), la mayoría de las legumi-
nosas forrajeras recolectadas en el CIAT (Centro Inter-
nacional de Agricultura Tropical, Cali, Colombia) han
sido seleccionadas de suelos ácidos de América Latina
y son extremadamente tolerantes a la acidez. Este autor
menciona que Calopogonium mucunoides, Arachis pintoi
y Centrosema spp son buenas opciones para pasturas en
suelos pobres de los trópicos. Las especies de Arachis
son más tolerantes a la acidez que las leguminosas de
processes that affect the nitrogen cycle and the nitrogen
compounds, movement in the plant/soil system. The
evidences presented show that no method is precise and
totally reliable to measure the biological fixation of the
atmospheric N2, due to multiple factors that affect their
quantification. Nevertheless, the methods that involve the
use of 15N, as 15N-dilution and natural 15N abundance,
would be most recommendable. The method to select
dependes on the availability of laboratory equipment. In
many developing countries, access to the spectrometry
of masses is a serious limitation; therefore, a method that
does not require a sophisticated equipment, such as that
of total N-difference, could be more recommendable.
—End of the English version—




grano como soya o frijol. El Cuadro 1 presenta informa-
ción acerca del potencial de fijación de N2 por varias
 VALLES DE LA MORA et al.: METODOLOGÍAS DE ISÓTOPOS PARA EVALUAR FIJACIÓN DE N ATMOSFÉRICO
leguminosas forrajeras. El intervalo de N2 fijado está
entre 52 y 88% según la especie, localidad y método
empleado para medirlo. La cantidad depende también
del tipo de leguminosa y los rendimientos de forraje,
además de su porcentaje de fijación.
CONCLUSIONES
El empleo del isótopo estable 15N tiene una amplia
aplicación en la comprensión de los procesos químicos
o biológicos que afectan el ciclo del nitrógeno y el mo-
vimiento de compuestos nitrogenados en el sistema sue-
lo/planta. Las evidencias presentadas muestran que nin-
gún método es preciso y totalmente confiable para me-
dir la fijación biológica del N2 atmosférico, debido a
múltiples factores que afectan su cuantificación. Sin
embargo, los métodos que involucran el uso de 15N, como
la dilución de 15N y la abundancia natural de 15N, son
los más recomendables. La elección del método depen-
de de la disponibilidad de equipo de laboratorio. En mu-
chos países en desarrollo el acceso a la espectrometría
de masas es una limitación seria; por tanto, un método
que no requiera equipo muy elaborado, como el de dife-
rencia total de N, podría ser más recomendable.
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