ASIGNATURA

INGENIERIA DE BIOPROCESOS AGROALIMENTARIOS

DOCENTE

DR. EDILBERTO FLORES AGUILAR

PRACTICA N° 01

MEDIOS DE CULTIVO

1. Introducción:

Toda célula viva para su mantenimiento, reproducción y formación de metabolitos útiles al hombre,
requiere consumir nutrientes que permitan el proceso de catabolismo y anabolismo que den lugar a
los procesos y productos esperados.

Los microorganismos y células superiores animales requieren para su reproducción de una cierta
cantidad de los elementos estructurales químicos tales como: C, H, O, N, así como otros compuestos
fuentes de minerales.

Estos requerimientos estarán en relación directa con el tipo de microorganismos y los productos
correspondientes o el tipo de célula.

Estos requerimientos son conocidos como nutrientes, las cuales son tomados del medio exterior.

El medio de cultivo puede definirse como el conjunto de elementos o sustancias que garantizan a los
microorganismos los nutrientes necesarios para su conservación o desarrollo.

Los medios de cultivos son muy importantes dado que:

- Facilitan el estudio de los requerimientos nutricionales de los microorganismos, su

metabolismo, características morfológicas y bioquímicas en condiciones controladas.

- Permiten el aislamiento del habitat natural u ocasional.

- Posibilitan su identificación y el estudio de la influencia de factores físicos, químicos y

mecánicos.

- Permiten el cultivo masivo de microorganismos productores de sustancias de interés.

Sus aplicaciones son por tanto variadas y se utilizan en:

- Diagnóstico clínico en medicina humana y veterinaria.

- Control de la calidad en la industria alimentaria.

- Control de calidad en otras industrias.

 - Industria médico farmacéutica y biotecnológica (producción y control)

- Investigaciones científicas, biológicas y ecológicas.

- Industria alimentaria y biotecnológica (producción y control).

- Otras aplicaciones industriales

Nos interesan en esta práctica los medios de cultivo que permitan su uso en la producción de
productos biotecnológicos en la Industria Alimentaria.

2. Diseño y Preparación de Medios:

En general las células requieren:

- Una fuente de energía suficiente

- Concentración adecuada de otros elementos

- Requerimientos específicos.

Es importante lo señalado por Scragg 1996 que la determinación de estos requerimientos se puede
conseguir a partir de principios básicos, aunque se han propuesto miles de medios diferentes en los
cuales a menudo no se especifica la razón por la que deben estar presentes varios componentes. En
un mundo ideal el diseño del medio debe comenzar con un análisis del organismo a desarrollar. En
contraste, la composición de muchos medios industriales inicialmente es el resultado de pruebas
empíricas dirigidas al crecimiento. Es común que la optimización de la producción comercial se
mantenga en secreto.

Scragg A. Biotecnología para Ingenieros, Limusa, Noriega Editores, 1996.

Sin embargo, al diseñar un medio deben de considerarse las siguientes etapas (Ojito 1997):

- Planteamiento del objetivo

- Revisión de la bibliografía

- Selección de los componentes

- Selección de las materias primas

- Selección de las condiciones de cultivo

- Diseño del experimento

- Optimización de la formulación

- Ensayos ampliados.

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Ojito E. Curso Internacional de Biotecnologia. Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad
Nacional Mayor de San Marcos, 1997.

Es necesario tener en cuenta también los parámetros de operación donde se van a cultivar los
microorganismos, material, diseños mecánicos, etc.

En la metodología para el diseño, evaluación y selección de medios de cultivo puede considerarse

también la siguiente metodología:

1. Composición elemental de las células

2. Estudio de las rutas metabólicas

3. Estudio de trabajos en la literatura

4. Evaluación económica

5. Selección.

2.1. Fuentes de Carbono:

Principalmente entre otras cumplen el papel de: ser fuente de energía para el metabolismo y ser
fuente de material para la construcción de la célula.

Las fuentes de carbono usadas actualmente se listan a continuación (Scragg 1996):

Grupos Principales Ejemplos

Monosacáridos Xilosa

Glucosa

Disacáridos Sucrosa (melazas, remolacha y caña de azúcar)

Lactosa

Maltosa

Polisacáridos Almidón

Dextrina

Inulina

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 Celulosa (turba, licor de sulfito)

Alcoholes Metanol

Etanol

Polialcoholes (glicerol)

Acido Carboxilico Acido acético, ácido succínico

Grasas Hidrocarburos Metano

n-Pentano

n-Butano

n-Parafinas

2.2. Fuentes de Nitrógeno y Otros Elementos:

El nitrógeno resulta importante para la síntesis proteica de las células, se usan sales de amonio, úrea,
harinas, licor de maíz, extracto de levadura, que aportan también aminoácidos, sales minerales y
vitaminas. En algunos casos como en la producción de enzimas y antibióticos es necesarios la
presencia de inductores o precursores.

3. Utilizacion de melazas: Tratamientos

Las melazas de caña o de remolacha, subproductos de la industria azucarera representa una fuente
de carbono ampliamente utilizada, siendo el componente principal del medio en la producción de
levaduras para panadería, proteina unicelular, alcohol, ácido cítrico, glutamato de sodio, acetona,
butano, ácidos orgánicos y aminoácidos.

La melaza de caña es un residuo siruposo de color oscuro que resulta después de extraer la mayor
cantidad de azúcar cristalizado.

La composición de las melazas varían según las localidades, las condiciones del suelo, el clima, las
variedades de caña, madurez y los métodos de fabricación del azúcar.

En general, las melazas son una mezcla compleja de diferentes azúcares, compuestos orgánicos e
inorgánicos y materiales en suspensión. La presencia de ellas por una parte, es debida a la

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acumulación durante la producción de algunos de estos compuestos que ya estaban presentes en el
jugo usado en el proceso y, por otra parte, la acumulación de productos añadidos y formados
durante las etapas de fabricación de azúcar.

Las melazas de caña en el Perú contienen en promedio ( Perez, 1994):

Pérez Alva S. Tópicos sobre biotecnología. Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, 1994.

Composición %

Sacarosa 35%

Azúcares reductores 15%

Azúcares reductores totales 50%

(sacarosa + azúcares reductores)

Cenizas sulfatadas, máximo 12%

Sustancias orgánicas no azúcares (no fermentable) 12%

Propiedades

°Brix 85

Densidad 1.5

pH 5.5 – 6.5

3.1. Tratamientos de clarificación

- Método ácido en caliente.- Consiste en diluir la miel 1:1 en peso, calentar durante 30
minutos a 80°C, ajustar el pH mediante H2SO4 a 3.5, calentar de nuevo a 80°C
durante 60 minutos, se deja sedimentar y enfriar durante 12 horas y luego se
centrifuga.

- Dilución de melaza al 20% en peso, a un pH de 4.- Calentar a 95°C durante 30

minutos, decantar después de 5 horas y centrifugar a 2000 rpm durante 20 minutos.
Se recomienda el uso de superfosfato de calcio al 6%.

El objetivo de acidificar es la de:

1. Provocar la hidrólisis de los carbohidratos.

2. Mantener el pH adecuado

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 3. Convertir el Ca(OH)2 en CaSO4.

La dilución de la melaza favorece la precipitación del CaSO4 como cristales monocálcicos y hace
posible su eliminación. La reacción entre el Ca(OH)2 y el H2SO4 no es rápida debido a la acción
buffer de las sales presentes en la melaza. Después del tratamiento es necesario un reposo y luego
realizar la decantación. Cuando la miel tiene muchos materiales en suspensión es necesario clarificar
sea por filtración con ayuda de bentonita, filtros prensa o centrifugación.

Las melazas clarificadas son luego esterilizadas estando en condiciones para utilizarse como
componente de un medio de cultivo cuyo diseño dependerá según los objetivos a alcanzar.

4. Medios de Cultivo Naturales:

Como es el caso del mosto de uva para la elaboración de vinos.

La uva (vitis vinifera) constituye la materia prima fundamental (ver Flanzy, 2003) Las uvas en general
tienen un contenido de agua de 70 – 80% y un contenido de nitrógeno de alrededor de 0.06%, siendo
la mayor parte de éste, no proteico. Los azúcares varían entre 12 y 25%, dependiendo de la variedad
y las condiciones de cultivo, siendo la mayor parte la glucosa y la fructosa.

La relación entre estos dos carbohidratos es de 1. La concentración de sacarosa es en general muy

baja (alrededor de 0.2%) aunque existen variaciones de entre 0.02 y 2% de la composición total; esto
se debe a la presencia de invertasa en la uva, la cual es resistente a altas temperaturas y al
tratamiento con SO2; por este motivo, y dado que la levadura también tiene una gran actividad de
invertasa, el contenido de sacarosa en el vino, aún cuando este azúcar pudiera añadirse en forma
exógena, es prácticamente nulo.

La uva contiene además cantidades importantes de ácido L(+) tartárico y ácido L(-) málico, las cuales
confieren las características de acidez. Esta acidez total titulable expresada como ácido tartárico
varía entre 0.3 y 1.5%, considerándose en general como un criterio de calidad un mínimo de 0.65%.
La relación tartárico/málico en uvas cultivadas en clima caliente y seco varía entre 0.75 y 6.1,
mientras que en clima frío y húmedo es de 0.65 –2.3. En las regiones más frías las uvas tienen mayor
contenido de ácido málico y mayor acidez total que las de regiones cálidas. Adicionalmente, se ha
reportado que la levadura S. Cerevisiae puede sintetizar ácido málico en cantidades que dependen
de la cepa y la fuente de nitrógeno.

La relación entre °Bx y acidez titulable es un criterio de la madurez y calidad de la uva siendo
recomendable:

Tipo de Vino °Bx Acidez Minima °Bx/Acidez

Blanco 19.5 – 23 0.70 27.9 – 33.0

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 Tinto 20.5 – 23.5 0.65 31.5 – 35.2

Dulce 22.0 – 25.0 0.65 33.8 – 38.5

Postre 23.0 – 26.0 0.50 46.0 – 52.0

Otros componentes importantes de la uva son las sustancias pécticas, estas se encuentran en
proporciones de entre 0.02 y 0.6%. Su importancia principal radica en el hecho de que estos
compuestos confieren turbiedad al jugo de uva y posteriormente al vino, característica indeseable.
Durante el proceso de elaboración, debido a la presencia de alcohol, parte de estas sustancias
pécticas junto con otros componentes mantenidos en suspensión por ella se precipitan. Cuando esto
ocurre se precipitan entre el 30 y 90% de las pectinas, por lo que el grado de clarificación puede ser
muy variable, siendo satisfactorio en algunos casos y en otros no. En estos últimos pueden utilizarse
enzimas pectinolíticos para lograr un mayor grado de clarificación.

Otros componentes de importancia de la uva son: los minerales, entre los cuales se encuentran
potasio, calcio y magnesio, pigmentos, leucoantocianinas y vitaminas. Entre los pigmentos son de
importancia en la elaboración de vinos rojos y rosados las antocianinas, siendo la principal la
cenidina.

Las leucoantocianinas (taninos) tienen una gran importancia en la elaboración de vinos ya que son
responsables de la astringencia y además son los sustratos de las polifenoxidasas nativas de la uva en
la reacción de oscurecimiento enzimático del mosto, tanto de vinos blancos como rojos. Las
leucoantocianinas se encuentran en mayor proporción en las semillas que en la piel. También los
tallos tienen un contenido elevado de estos compuestos. Los hidroxicinamatos, compuestos
fenólicos diferentes de las leucoantocianinas, son los principales compuestos fenólicos en vinos
blancos que han unido mucho contacto con las pieles de uvas y además de su efecto en el
oscurecimiento han sido asociados a sabores amargos.

La piel de uva contiene en general esteroides, las cuales al pasar al mosto y ser asimilados por la
levadura durante la fermentación alcohólica, le confiere a esta mayor resistencia al etanol.

Flanzy C. Enología: Fundamentos Científicos y tecnológicos. AMV Ediciones, 2003

Obtención del Mosto

Se obtiene por estrujado obteniéndose zumo, pulpa o carne del fruto, pieles u hollejo y semillas o
pepitas. Los escobajos o raspas se separan primero la mayoría de las veces con despalilladoras
porque contienen sustancias que proporcionan mal sabor y que podrían pasar a la vendimia. En los
vinos tintos se fermenta con el hollejo y las pepitas. Para los vinos blancos por lo general el mosto
consiste exclusivamente del jugo exprimido de las uvas libre de los compuestos mencionados.

Es una práctica universal agregar SO2 al mosto antes de la fermentación alcohólica. Esto con el
objeto de inhibir el crecimiento de bacterias y levaduras indeseables y además inhibir la acción de las
polifenoxidasas que provocan el oscurecimiento del producto. Las cantidades adicionales son del

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orden de entre 100 y 200 mg/lt. La forma de adición es como SO2 gaseoso, en solución acuosa o
como metabisulfito de potasio sólido. La acción antimicrobiana y antioxidante del sulfito puede
sustituirse por procesos de pasteurización térmica de alta temperatura y corto tiempo, lo cual es más
factible en mostos blancos que en mostos tintos, ya que en estos últimos la operación se complica
por la necesidad de macerar la piel durante la fermentación alcohólica, a menos que se realice el
proceso de la termovinificación.

La termovinificación consiste en macerar la piel de uva con el mosto calentado a 85°C durante un
corto tiempo, y de esta manera se obtiene una eficiente extracción de los pigmentos pero con menos
extracción de los taninos.

Si se efectúa una pasteurización es imprescindible el uso de cultivos puros de levadura para realizar
la fermentación alcohólica.

5. EXPERIMENTO 1: Tratamiento de Melazas

Materiales y Equipos

- Vasos de precipitados - Mechero, tripode, rejilla

- Varillas de agitación - Melaza de caña

- Tubos de centrífuga - Refractómetro

- Termómetro - Balanza

- Acido sulfúrico - Potenciómetro

- Superfosfato de calcio - Centrífuga

Procedimiento

- Realizar el acondicionamiento de la melaza de caña para la preparación de mostos o medios

de cultivo, efectuando la clarificación por los tratamientos mencionados.

- Caracterizar la melaza antes y después del tratamiento determinando los °Bx, pH y Azúcares
reductores totales, esta última según el método de Eynon Lane y Munson Walker.

6. EXPERIMENTO 2: Obtencion de Mosto de Uva e Inicio de la Fermentacion

Materiales y Equipos

- Uva - Bureta y soportes

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 - Vasos de precipitados

- Varillas de agitación

- Fenolftaleina

- Hidróxido de sodio 0.1 N

- Pipetas de 5, 10 ml.

- Refractómetro

- Potenciómetro

- Balanza

- Mostímetro

- Metabisulfito de potasio

- Depósitos

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Procedimiento

- Realizar la obtención de mosto de uva para la obtención de vino tinto y blanco según lo
señalado en el punto 4.

- Determinar los °Bx, pH, acidez titulable, usar el refractómetro y mostímetro

respectivamente. Acondicionar el mosto con SO2 para iniciar una fermentación con
flora nativa.

7. Informes Y Cuestiones:

- Realizar una investigación bibliográfica sobre melazas de caña, indicar su composición

aproximada. Justificar su uso por las industrias biotecnológicas. Porque es necesario
darles un tratamiento previo.

- Elaborar un cuadro indicando los diferentes productos que se obtienen de las

diferentes fuentes de carbono que se usan en los medios.

- En la elaboración de vino de uva, analizar las diferencias entre una fermentación del
mosto con flora nativa y con cultivo inoculado. Señalar ventajas y desventajas.

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