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Tp5 proteinas - Resumen de métodos de purificación de

proteínas: cromatografía, tratamiento
Introducción a Biología celular y molecular (Universidad Nacional de Quilmes)

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Métodos de purificación

Fraccionamiento de sulfato de amonio

La solubilidad de las proteínas varía de acuerdo con la fuerza iónica y, por lo tanto, de acuerdo con la
concentración de sal de la solución. Se observan dos efectos distintos. A bajas concentraciones de sal, la
solubilidad de la proteína aumenta con la concentración de sal. Este fenómeno se llama 'salting-in'. Sin
embargo, a medida que la concentración de sal (fuerza iónica) aumenta aún más, la solubilidad de la proteína
comienza a disminuir. A una fuerza iónica suficientemente alta, la solubilidad de la proteína habrá disminuido
hasta el punto en que la proteína se precipitará casi por completo a partir de la solución, un efecto llamado
"salificación". La base teórica de la salazón es compleja, pero un factor es probablemente la competencia
entre la proteína y los iones de sal para las moléculas de agua disponibles. A concentraciones elevadas de sal,
hay disponibles moléculas de agua insuficientes para la solvatación completa de la proteína, de modo que las
interacciones proteína proteína predominan sobre las interacciones proteína-agua y ocurre la precipitación.

Dado que las proteínas difieren notablemente en sus solubilidades a una alta fuerza iónica, la salazón es un
procedimiento muy útil para ayudar en la purificación de una proteína dada. De hecho, los esquemas de
purificación enzimática casi invariablemente incluyen dicho paso. En la práctica, el sulfato de amonio es la sal
comúnmente utilizada, ya que es altamente soluble en agua, relativamente barata y está disponible en alta
pureza. Además, no tiene efectos adversos sobre la actividad enzimática. Típicamente, se realiza inicialmente
un experimento a pequeña escala para determinar la concentración óptima de sulfato de amonio que se
utilizará. Este procedimiento típicamente se lleva a cabo a 0 - 4ºC para maximizar la estabilidad de la
proteína. Se debe tener gran cuidado para asegurar que la concentración de sal de la solución completa
aumente uniformemente sin que se produzcan altas concentraciones locales que puedan precipitar la
proteína de interés junto con las proteínas indeseadas. Por lo tanto, la solución se agita continuamente a
medida que se añaden pequeñas alícuotas de sulfato de amonio sólido triturado (o preferiblemente solución
de sulfato de amonio saturado). Después de cada adición, se deja que el sulfato de amonio se disperse por
completo antes de la siguiente adición. Una vez que se alcanza la concentración requerida de sulfato de
amonio, la incubación a 0 - 4ºC se continúa durante un breve período para permitir que se produzca la
precipitación de proteínas, y la proteína precipitada se recupera luego por centrifugación. La concentración
de sulfato de amonio en la solución se incrementa así gradualmente, recuperando la proteína precipitada en
cada etapa. Cada proteína precipitada se disuelve individualmente en tampón nuevo y se analiza tanto para
el contenido de proteína total como para la actividad de la enzima deseada. En base a estos datos, se puede
planificar un procedimiento de fraccionamiento de sulfato de amonio exitoso para la purificación masiva de
la enzima. Se elige una concentración de sulfato de amonio que precipitará la proporción máxima de
proteína indeseada mientras deja la mayor parte de la enzima aún en solución. Esta proteína precipitada se
elimina por centrifugación y luego la concentración de sulfato de amonio de la solución restante se
incrementa hasta un valor que precipitará la mayor parte de la enzima, dejando al mismo tiempo la cantidad
máxima de contaminantes proteicos residuales aún en solución. La enzima precipitada se recupera por
centrifugación y se disuelve en tampón nuevo para la siguiente etapa de purificación. El sulfato de amonio
residual estará presente en esta solución de enzima y puede necesitar ser eliminado por filtración en gel o
diálisis antes de que se pueda intentar la siguiente etapa de purificación.

Además de su papel como una etapa de purificación extremadamente útil y universalmente aplicable, la
purificación con sulfato de amonio se emplea a menudo nuevamente en etapas posteriores de purificación

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simplemente para concentrar la proteína de la solución diluida después de procedimientos tales como la
filtración en gel.

Tratamiento térmico

Los procedimientos de purificación de proteínas generalmente se llevan a cabo a baja temperatura (0 - 4ºC)
ya que la mayoría de las proteínas son estables a baja temperatura. A medida que la temperatura aumenta
de 0ºC a 37 - 40ºC, su estabilidad disminuye significativamente. Por encima de 40ºC aproximadamente, la
mayoría de las proteínas se vuelven cada vez más inestables y se desnaturalizan, y a pH neutro, las proteínas
desnaturalizadas generalmente precipitan.

Las proteínas individuales difieren en su sensibilidad al calor, por lo que pueden usarse con fines de
purificación. La estabilidad a la temperatura de la enzima deseada se determina mediante un experimento
de prueba que sigue a la actividad enzimática en el extracto celular después de la incubación a diferentes
temperaturas durante un período de tiempo determinado. Se anota la temperatura mínima a la que ocurre
la inactivación total. Una vez que se conoce esta temperatura, las proteínas menos estables pueden
inactivarse preferentemente incubando el extracto celular a una temperatura de 5 - 10ºC por debajo de este
valor durante 15 - 30 minutos. La proteína precipitada desnaturalizada se elimina luego por centrifugación.

Debe observarse que la estabilidad térmica de la enzima deseada puede aumentarse durante la
desnaturalización por calor mediante la presencia de su sustrato, producto o un inhibidor competitivo que se
une al sitio activo y ayuda a estabilizar la conformación proteica. Dado que la desnaturalización de las
proteínas celulares se produce hasta cierto punto a todas las temperaturas y simplemente aumenta con el
aumento de la temperatura, la actividad total de la enzima deseada normalmente cae hasta cierto punto
después de una etapa de desnaturalización térmica. Este procedimiento es bastante crudo. Sin embargo,
puede ser un primer paso útil para la purificación de proteínas más estables al calor.

Filtración en gel

Se puede separar una amplia gama de moléculas biológicas en función de las diferencias en su tamaño y
forma, lo que conduce a diferencias en su capacidad para penetrar en matrices porosas. Este procedimiento
se conoce como cromatografía de tamiz molecular o cromatografía de exclusión molecular. Se puede
emplear una variedad de matrices porosas dependiendo de la naturaleza de las moléculas a fraccionar. Para
propósitos de purificación de proteínas, la matriz típicamente consiste en perlas porosas de un gel inerte
altamente hidratado y, por lo tanto, el proceso a menudo se denomina filtración en gel.

matrices de gel comerciales comunes son Sephadex (perlas de dextrano), Sepharose y Bio-Gel A (agarosa) y
Bio-Gel P (poliacrilamida), mientras que otros materiales tales como polyacryloylmorpholine y diversos
poliestirenos también se han utilizado. Las perlas de dextrano, agarosa y gel de poliacrilamida se pueden
fabricar con diferentes grados de porosidad y fraccionarán diferentes rangos de tamaño de proteínas. Los
geles de dextrano Sephadex y geles de poliacrilamida Bio-Gel P permiten el fraccionamiento de las proteínas
globulares hasta aproximadamente 800.000 de peso molecular mientras que los geles de agarosa, debido a
su mayor porosidad, puede separar las moléculas de proteínas y complejos macromoleculares de hasta
varios millones de peso molecular. Más recientemente, se han comercializado geles de dextrano reticulados
(Sephacryl) que son matrices estables excepcionalmente rígidas que pueden fraccionar proteínas de pesos
moleculares de hasta 8 millones. La rigidez y la estabilidad de los geles de poliacrilamida se pueden mejorar
incluyendo la agarosa en la matriz del gel. Los geles de poliacrilamida / agarosa de este tipo también están

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disponibles comercialmente (Ultrogel). Nuevos tipos de gel comercial se están desarrollando

constantemente. La siguiente tabla resume las propiedades de las matrices utilizadas en este programa.

Características de los medios de filtración en gel utilizados en esta simulación.

Nombre de la matriz

Tipo de cuentas

Rango de fraccionamiento aproximado para péptidos y proteínas globulares (peso molecular)

Sephadex G-50¹ dextran 1500 - 30000

Sephadex G-100¹ dextran 4000 - 150000

Sephacryl S-200 HR¹ dextran / acrilamida 5000 - 250000

Ultrogel AcA 54² poliacrilamida / agarosa 6000 - 70000

Ultrogel AcA 44² poliacrilamida / agarosa 12000 - 130000

Ultrogel AcA 34² poliacrilamida / agarosa 20000 - 400000

Bio-Gel P-60³ poliacrilamida 3000 - 60000

Bio Gel P-150³ poliacrilamida 15000 - 150000

Poliacrilamida Bio-Gel P-300³ 60000 - 400000

¹ Sephadex® y Sephacryl® son marcas registradas de GE Healthcare Bio-Sciences AB.

² Ultrogel® es una marca registrada de BF Biotechnics, Inc.

³ Bio Gel® es una marca registrada de Bio-Rad Laboratories, Inc.

El fraccionamiento de una mezcla de proteínas mediante filtración en gel se lleva a cabo típicamente de la
siguiente manera. Las perlas de gel, presentes como una suspensión espesa en el tampón elegido, se vierten
en una columna de cromatografía de vidrio o plástico de dimensiones adecuadas y se dejan sedimentar por
gravedad. Después de lavar y equilibrar la columna con tampón solo, la mezcla de proteína en tampón se
aplica a la parte superior de la columna y el eluato se recoge en la base de la columna en una serie de
fracciones. A medida que las proteínas pasan por la columna, penetran en los poros de las perlas de gel en
diferentes grados y viajan por la columna a diferentes velocidades. Todas las proteínas que excedan el
tamaño máximo de los poros no podrán ingresar a las cuentas. Por lo tanto, estas proteínas se distribuirán
solo en la solución entre las perlas y eluirán de la columna primero en el denominado "volumen de
exclusión" (o volumen vacío). Todas las proteínas por debajo del tamaño mínimo de los poros se equilibrarán
completamente con el tampón dentro y fuera de las perlas de gel y, por lo tanto, pasarán una parte de su
tiempo dentro de las perlas. Por lo tanto, estas proteínas se moverán más lentamente a través de la columna
y se eluirán al final, junto con cualquier otra molécula pequeña presente en la mezcla de proteína original,

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como los iones de sal. El volumen total de la columna se llama volumen de la cama. Por lo tanto, estas
proteínas se eluirán en un volumen de tampón muy cercano al volumen del lecho de la columna (aunque
algo menos debido al volumen físicamente ocupado por la propia matriz de gel). Los poros en las cuentas no
son de tamaños exactamente idénticos, sino que abarcan una estrecha gama de tamaños. Algunas proteínas
tendrán tamaños muy similares al rango de tamaño de los poros y, por lo tanto, se excluirán de algunos
poros al entrar en otros. Por lo tanto, estas proteínas de tamaño intermedio se excluirán parcialmente de las
perlas en una medida que depende de su tamaño y forma. Se eluirán de la columna en orden de peso
molecular con las proteínas más grandes eluyendo primero y las proteínas más pequeñas después.

La elección cuidadosa del tipo de gel es importante para el fraccionamiento óptimo de las mezclas de
proteínas complejas. El uso de un tipo de gel inapropiado puede llevar a que la proteína de interés sea
totalmente excluida de las perlas de gel y así eluir con muchas otras proteínas en el volumen vacío o, por el
contrario, puede equilibrarse con el volumen total de gel y así eluir con muchas otras proteínas en la fracción
de sal cerca del volumen del lecho. En ambas situaciones, la resolución del fraccionamiento es pobre.
Idealmente, el tamaño de poro del gel debería ser tal que la proteína deseada se excluya parcialmente de las
perlas de gel, una condición que conduzca al mayor grado de fraccionamiento de otras especies de proteínas.
Para las proteínas parcialmente excluidas, un gráfico de logaritmo (peso molecular de la proteína) versus Kav,
conduce a una relación en línea recta, donde

Kav =

volumen de elución - volumen vacío

volumen total de la matriz empaquetada - volumen vacío

Relación lineal entre Kav y log (peso molecular)

Por lo tanto, una columna se puede calibrar con proteínas estándar de peso molecular conocido, teniendo en
cuenta sus volúmenes de elución, y estos datos se utilizan para dibujar dicho gráfico. Posteriormente,
durante el fraccionamiento de la mezcla de proteína de muestra en la misma columna, la medición del
volumen de elución de la proteína de interés permite deducir su peso molecular por referencia a la curva
estándar. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la forma de las moléculas de proteína también juega un
papel importante en la filtración en gel. Los polipéptidos y proteínas largos y extendidos tienden a
comportarse como si fueran moléculas proteicas globulares más grandes. Por lo tanto, una curva de
calibración es tan precisa como lo permita la naturaleza de los estándares de proteína utilizados para
construirla.

Cuando se aplica por primera vez la filtración en gel para cualquier purificación de proteínas particular, es
una buena práctica fraccionar la mezcla de proteínas en varias matrices de gel de diferente porosidad,
recoger fracciones y analizar cada una el contenido de proteínas y la actividad enzimática. Empíricamente,
uno puede elegir una matriz que proporcione una buena resolución de la proteína deseada de otras
proteínas y, al mismo tiempo, proporcionar cierta información sobre su peso molecular, información que
puede resultar extremadamente útil en posteriores pasos de purificación.

Cromatografía de intercambio de iones

Una resina de intercambio iónico consiste en una matriz insoluble con grupos de carga unidos
covalentemente. Tanto los intercambiadores de iones cargados positivamente como los cargados

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negativamente están disponibles comercialmente. Los intercambiadores cargados negativamente se unen a

iones con carga positiva (cationes). Pueden unir un tipo de catión pero, cuando se presentan con un segundo
tipo de catión, esto puede desplazar, o intercambiar con, el primero. Por lo tanto, estas resinas se llaman
resinas de intercambio catiónico. De forma similar, las resinas de intercambio aniónico están cargadas
positivamente y unen (e intercambian) iones cargados negativamente (aniones).

Una resina de intercambio de cationes con contraiones positivos unidos

Resina de intercambio de aniones B con contraiones negativos unidos

Varios grupos de cadena lateral de los residuos de aminoácidos en las proteínas son ionizables (por ejemplo,
lisina o ácido glutámico) como lo son los grupos amino N-terminal y carboxilo C-terminal. Por lo tanto, las
proteínas son moléculas cargadas. Esta característica se puede usar para separar diferentes proteínas
mediante cromatografía de intercambio iónico. Las dos resinas más comúnmente usadas para la
cromatografía de intercambio iónico de proteínas son carboximetilcelulosa (CM-celulosa) y
dietilaminoetilcelulosa (DEAE-celulosa). Estas son celulosas granulares que han sido modificadas
químicamente. CM-celulosa es una resina donde los grupos -CH2OH del carbohidrato se han convertido a
grupos -CH2OCH2COOH. A pH neutro, este grupo se ioniza como -CH2OCH2COO¯, de modo que CM-celulosa
está cargada negativamente, es decir, es un intercambiador de cationes. DEAE-celulosa contiene un grupo de
amina terciaria ionizable en su lugar. Está cargado positivamente a pH neutro y, por lo tanto, DEAE-celulosa
es un intercambiador de aniones. Estrechamente relacionados con estas celulosas de intercambio iónico se
encuentran DEAE-Sephadex y CM-Sephadex, que contienen los mismos grupos ionizables unidos
covalentemente a una matriz de perlas de Sephadex, y los intercambiadores de iones de cuentas de agarosa
covalentemente reticulados DEAE-Sepharose y CM-Sepharose. La DEAE-celulosa ahora también está
disponible en forma de perlas llamada DEAE-Sephacel. Los tipos de Sephadex y Sepharose son
particularmente útiles para la separación de proteínas de alto peso molecular. En la práctica, dado que estas
matrices son muy similares a las utilizadas para la filtración en gel, puede que haya algún tamiz molecular
que acompañe al proceso de intercambio iónico. Esto puede mejorar o reducir la efectividad del
fraccionamiento en comparación con el uso de una celulosa de intercambio iónico. Para simplificar la
simulación por computadora, se supone que el tamizado molecular no ocurre durante la cromatografía de
intercambio iónico. Otras resinas de intercambio iónico que usan diferentes grupos ionizables de las
descritas aquí también están disponibles comercialmente. Esta simulación por computadora incluye las
siguientes resinas de intercambio iónico: CM-celulosa, DEAE-celulosa, Q-Sepharose Fast Flow y S-Sepharose
Fast Flow. El grupo cargado de Q-Sepharose es una amina cuaternaria que lleva una carga positiva no
valorable. Por lo tanto, esta matriz se puede usar a valores de pH alcalinos a los que la carga positiva del
grupo DEAE se habría titulado. El grupo cargado de S-Sepharose es el grupo sulfonilo (-SO3¯).

El fraccionamiento de proteínas por cromatografía de intercambio iónico depende de las diferencias en la

carga de diferentes proteínas. La carga de una proteína depende del número y tipo de grupos de cadenas
laterales de aminoácidos ionizables. Los residuos de lisina, por ejemplo, tienen un grupo de cadena lateral
con carga positiva cuando se ionizan, mientras que los residuos de ácido glutámico se cargan negativamente
cuando se ionizan. Cada grupo de cadena lateral ionizable tiene un pKa distinto; es decir, el pH al que está
mitad disociada. Por lo tanto, el número total de cargas en una proteína particular a un pH particular
dependerá del número y tipo de grupos de cadenas laterales de aminoácidos ionizables que contenga. Dado
que, por definición, las diferentes proteínas tienen diferentes composiciones de aminoácidos, tenderán a
tener cargas diferentes a un pH dado y, por lo tanto, pueden fraccionarse sobre esta base.

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El fraccionamiento de proteínas por cromatografía de intercambio iónico depende de las diferencias en la

carga de diferentes proteínas. La carga de una proteína depende del número y tipo de grupos de cadenas
laterales de aminoácidos ionizables. Los residuos de lisina, por ejemplo, tienen un grupo de cadena lateral
con carga positiva cuando se ionizan, mientras que los residuos de ácido glutámico se cargan negativamente
cuando se ionizan. Cada grupo de cadena lateral ionizable tiene un pKa distinto; es decir, el pH al que está
mitad disociada. Por lo tanto, el número total de cargas en una proteína particular a un pH particular
dependerá del número y tipo de grupos de cadenas laterales de aminoácidos ionizables que contenga. Dado
que, por definición, las diferentes proteínas tienen diferentes composiciones de aminoácidos, tenderán a
tener cargas diferentes a un pH dado y, por lo tanto, pueden fraccionarse sobre esta base.

Para cualquier proteína, habrá un pH en el cual la cantidad total de cargas negativas será igual a la cantidad
de cargas positivas y, por lo tanto, no tendrá carga neta. Este es su punto isoeléctrico (pI), o más
estrictamente hablando, su punto isoiónico. A este pH, la proteína no se unirá a ninguna resina de
intercambio iónico. Por debajo de este pH, la proteína tendrá una carga positiva neta y se unirá a un
intercambiador de cationes, mientras que por encima de este pH tendrá una carga neta negativa y se unirá a
un intercambiador de aniones. En principio, por lo tanto, se puede elegir usar un intercambiador de cationes
o un intercambiador de aniones para unir la proteína de interés. Sin embargo, las proteínas suelen ser
estables (y funcionalmente activas) solo dentro de un intervalo de pH bastante estrecho, de modo que la
elección del intercambiador de iones a menudo viene dictada por la estabilidad del pH de la proteína
deseada. Si la proteína es más estable a valores de pH por debajo de su pI, se debe usar un intercambiador
de cationes, mientras que si es más estable a valores de pH superiores a su pI, se elegiría un intercambiador
de aniones. Claramente, si es estable en un amplio rango de pH, se puede intentar el uso de cualquier tipo de
resina y se selecciona la que da el mejor fraccionamiento.

Cuando se adquieren resinas de intercambio iónico, los iones unidos a los grupos cargados en la resina se
llaman 'contraiones'. Para CM-celulosa, el contraión suele ser Na + y para DEAE-celulosa el contraión es
normalmente Cl¯. Después de la elección de la resina apropiada, se mezcla con tampón para formar una
suspensión espesa que se vierte en una columna de cromatografía adecuada. El pH de este tampón de
partida es crucial ya que determinará la carga sobre las proteínas que se van a separar. El pH del tampón de
partida debería ser al menos una unidad de pH por encima o por debajo del pI de la proteína que se unirá a la
resina para asegurar una unión adecuada. Sin embargo, tenga en cuenta que CM-celulosa y DEAE-celulosa
son ejemplos de intercambiadores de iones débiles. Un intercambiador de iones débil es uno que se ioniza
solo en un rango de pH limitado. Por lo tanto, la DEAE-celulosa comienza a perder su carga por encima de pH
9 mientras que CM-celulosa comienza a perder su carga por debajo de pH 5. El término "débil" no se refiere a
la fuerza de unión de iones a la resina ni a la resistencia física de la resina en sí misma Con estos puntos en
mente, el rango efectivo de pH inicial cuando se utiliza DEAE-celulosa o CM-celulosa es solo de pH 5 - 9.
Además de la correcta elección del pH del tampón de partida, se debe tener cuidado de que su fuerza iónica
es razonablemente bajo ya que la afinidad de las proteínas por las resinas de intercambio iónico disminuye a
medida que aumenta la fuerza iónica. De hecho, esta propiedad se usa en un método para eluir las proteínas
unidas (ver a continuación).

Una vez vertido en la columna, el lecho de resina de intercambio iónico se lava bien con tampón de partida y
luego se aplica la mezcla de proteínas. Las proteínas que están cargadas opuestamente a la resina al pH
inicial se unirán a ella, por lo que se desplazarán los contraiones. Las proteínas con la misma carga que la
resina o sin carga neta no se unirán y fluirán directamente a través de la columna. Las diferentes proteínas
unidas a la columna, una de las cuales será la proteína de interés, tendrán diferentes afinidades para el

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intercambiador de iones debido a las diferencias en su carga neta. Estas afinidades pueden alterarse
variando el pH o la fuerza iónica del tampón de la columna. Considere un conjunto de proteínas unidas al
intercambiador de aniones, DEAE-celulosa. A medida que se reduce el pH, los grupos -COO¯ en la proteína
comienzan a protonarse y pierden su carga. Por lo tanto, la carga negativa global de la proteína disminuirá y,
por lo tanto, también lo hará su afinidad por la resina. Diferentes proteínas se eluirán de la resina a
diferentes valores de pH a medida que su número de cargas negativas disminuya a un valor crítico. Por lo
tanto, se pueden resolver las proteínas unidas a la columna reduciendo lentamente el pH usando un
gradiente de pH tampón y recogiendo fracciones, cada una de las cuales contendrá proteínas diferentes
eluidas a diferentes valores de pH. Por el contrario, cuando se utiliza un intercambiador de cationes, el
gradiente de pH se organizará para aumentar eluir las proteínas unidas.

En lugar de cambiar el pH para eluir las proteínas unidas a un intercambiador de iones, se puede aumentar la
fuerza iónica del tampón de la columna. A baja fuerza iónica, la competencia entre los iones tampón y las
proteínas para los grupos cargados en el intercambiador de iones es mínima, por lo que las proteínas se unen
fuertemente. Sin embargo, una vez que las proteínas se unen, el aumento de la fuerza iónica aumenta la
competencia y, por lo tanto, reduce la interacción entre el intercambiador de iones y las proteínas, lo que
hace que las proteínas se eluyan. Se puede eluir las proteínas unidas aumentando la fuerza iónica,
independientemente de si se utilizó un intercambiador de aniones o cationes. Esto generalmente se logra
incorporando un gradiente de concentración lineal de NaCl en el tampón de la columna mientras se
mantiene constante el pH.

El uso de un gradiente continuo de pH o un gradiente continuo de sal (fuerza iónica) dará como resultado un
alto grado de fraccionamiento de proteínas basado en la carga de proteínas. En la práctica, también se puede
usar elución por etapas, es decir, alterar el pH o la fuerza iónica en pasos discretos conocidos. Aunque
técnicamente es más fácil de llevar a cabo en ocasiones, los gradientes escalonados suelen dar una
resolución más pobre que la elución continua de gradiente, por lo que no se modelan en este programa.

Cromatografía de interacción hidrófoba

Esta técnica fracciona las proteínas en función de su unión y elución a partir de una matriz hidrófoba,
comúnmente octil o fenil-agarosa. La unión de las proteínas a menudo se lleva a cabo a una alta
concentración de sal para favorecer las interacciones hidrófobas. Algunas proteínas pueden precipitar a esta
alta fuerza iónica y, por lo tanto, deben eliminarse por centrifugación antes de cargar la mezcla de proteínas
en la columna. La elución selectiva de proteínas unidas se lleva a cabo aplicando un gradiente de sal
decreciente. Las proteínas que no pueden eluir a baja concentración de sal pueden eluirse lavando la
columna con etilenglicol acuoso, etanol o ciertos agentes caotrópicos tales como urea, pero esto no se
simula en este programa. Esta técnica es, por lo tanto, como otros procedimientos cromatográficos
generales, tales como la cromatografía de intercambio iónico y la filtración en gel, ya que depende de las
diferencias en una propiedad física particular de las moléculas de proteína que se separan.

Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad es mucho más específica que otras técnicas de purificación. Se basa en la
preparación de una matriz a la cual la proteína de interés, y preferiblemente solo esta proteína, se unirá
reversiblemente. La matriz suele ser agarosa en perlas (Sepharose o BioGel A), poliacrilamida (por ejemplo,
BioGel P) o dextrano reticulado (por ejemplo, Sephacryl) a la que se ha unido covalentemente un ligando. La
naturaleza química del ligando está determinada por la especificidad biológica conocida de la proteína a

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purificar. En la práctica, la cromatografía de afinidad se ha utilizado para purificar proteínas tales como
inmunoglobulinas, receptores de membrana, enzimas y hormonas, así como ácidos nucleicos e incluso
células enteras. En el caso de una enzima, el ligando elegido probablemente sea un sustrato o un inhibidor o
activador reversible. Se podría intentar usar un ligando que sea absolutamente específico ya que se unirá
solo a esa enzima pero, en caso de que esto ocurra, se puede usar un ligando "específico de grupo". Por
ejemplo, si se usa 5 'AMP como ligando, su similitud estructural con NAD + hace que se una a muchas
deshidrogenasas dependientes de NAD + que, por lo tanto, se co-purifican a partir de otras proteínas.

El procedimiento para la cromatografía de afinidad de proteínas es similar al de los otros tipos de

cromatografía líquida. La matriz se empaqueta en una columna en un tampón que será óptimo para la unión
enzima-ligando. Por lo tanto, el buffer debe contener cualquier cofactor, como los iones metálicos necesarios
para la unión. Normalmente, el tampón tiene una fuerza iónica bastante alta para minimizar la unión no
específica de otras proteínas al ligando. La muestra se aplica y se lava a través de la columna. Idealmente,
solo la enzima de interés se uniría. Luego se puede eluir específicamente mediante la adición de una
concentración relativamente alta de sustrato o inhibidor competitivo o, en su defecto, cambiando el pH y / o
la fuerza iónica para interrumpir la interacción enzima-ligando.

Se puede usar un protocolo alternativo si está disponible un anticuerpo específico para la proteína de
interés. Este procedimiento es aplicable a todas las proteínas independientemente de sus actividades
funcionales. El anticuerpo se acopla covalentemente a una matriz adecuada y luego se vierte en una columna
y se expone a la mezcla de proteína de muestra como se describió anteriormente. Solo la proteína requerida
se unirá al anticuerpo y luego se puede eluir mediante procedimientos que debilitan la interacción del
antígeno anticuerpo.

La cromatografía de afinidad es teóricamente capaz de purificar una única proteína de una mezcla compleja
en una sola etapa. Sin embargo, incluso si este ideal teórico no se logra, el grado de purificación es
comúnmente muy bueno. Como tal, es quizás el procedimiento de purificación de proteínas más poderoso
actualmente disponible. Sin embargo, la cromatografía de afinidad solo puede aplicarse cuando se conoce la
actividad funcional de la proteína requerida y está disponible un ligando adecuado o cuando ya se ha
obtenido un anticuerpo específico para la proteína. Desafortunadamente, en muchos casos ninguna de las
dos condiciones se satisface, por lo que la purificación de proteínas debe basarse en procedimientos más
generales.

En esta simulación, tres tipos de anticuerpos monoclonales inmovilizados están disponibles para cada
proteína en la mezcla. Estos difieren en sus afinidades por la proteína. Los anticuerpos de baja afinidad no se
unirán a la proteína suficientemente bien para evitar su paso a través de la columna. Los anticuerpos de alta
afinidad se unirán a la proteína tan fuertemente que no se puede eluir en una forma activa. Por lo tanto,
deberá usar los anticuerpos de afinidad media. ¡Tendrás que llevar a cabo algunos experimentos para
descubrir cuáles son! También está disponible una preparación de IgG policlonal inmovilizada y, para algunas
proteínas, un inhibidor competitivo inmovilizado.

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