INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

BIOQUÍMICA GENERAL

Práctica: Determinación de aminoácidos terminales con grupo alfa amino libre por el método
de Sange​r ​Alumnos: ​Ávila Martínez Kenia, Calónico Tamayo Alan Grupo: ​4QM1 Sección: 4
Equipo:​ 2
Introducción. Interpretación de cada paso efectuado en
El método de Sanger permite realizar un la preparación del derivado
marcado químico del grupo alfa amino dinitrofenilado.
terminal de una proteína para poder obtener
la secuencia de aminoácidos que la
conforman. El fundamento de la técnica está PASO O EXPLICACIÓN
basado en la alta reactividad del SUSTANCIA
1-fluoro-2,4-dinitrobenceno con un grupo
amino terminal al ser hidrolizado. La única Hemoglobina Proteína que vamos a
desventaja del método es la hidrólisis total estudiar
de la proteína para poder llevar a cabo el
marcado. La cromatografía por otro lado es 1-Fluor-2,4-dinitrobe Reactivo con Nucleófilos
una técnica barata y muy sensible al separar nceno (DNFB)
los componentes de una mezcla. Su Marca el amino
fundamento se basa en las diferencias de N-terminal
polaridades de un componente respecto a la Resiste a la hidrólisis
del solvente.
Objetivos. Identificación fácil por
● Marcar el grupo alfa amino terminal ser color amarillo.
de la hemoglobina con
1-fluoro-2,4-dinitrobenceno (DNFB)
Bicarbonato de El amino N-terminal que
por el método de Sanger Sodio (NaHCO​3​) necesitamos debe de
● Separar e identificar por estar en medio básico
cromatografía los restos de entre pH de 8 y 9 ya que
aminoácidos presente en la la reacción produce HF y
haría que el amino
hemoglobina
N-terminal cambie y para
● Comprender a través de la la reacción.
experimentación el método de Sanger
la secuenciación de la hemoglobina y
así saber el grupo terminal alfa-amino HCl 3N Para detener la reacción
libre que tiene.
Precipitar la proteína y
protonarla
Éter saturado con Para formar dos fases 1-Flúor-2,4-dinitrob NUCLEÓFILO
FeSO​4 Etérea (DNFB) y Acuosa enceno (DNFB) MARCADOR DEL
(proteína protonada N-AMINOTERMINAL
marcada) POR SU
COLORACIÓN
AMARILLA. NO SE
Baño maría Eliminar las trazas de DESCOMPONE NI
éter restante REACCIONA EN LA
HIDRÓLISIS ÁCIDA
Centrifugación Para separar y favorecer
la precipitación de la
BICARBONATO DE PROPORCIONA EL
proteína
SODIO (NAHCO​3​) MEDIO BÁSICO (pH
8-9) PARA QUE
REACCIONE EL
HCl 6N Para realizar la hidrólisis AMINO N-TERMINAL
AL EVITAR LA
FORMACIÓN DE HF.
Hidrólisis ácida Romper enlaces
peptídicos
HCl 3N DETIENE LA
Se realiza en presiones REACCIÓN,
altas PRECIPITA LA
PROTEÍNA Y
PROPORCIONA UN
Lavados de éter Separa la fase etérea
PROTÓN.
(amino N-terminal
marcado) y acuosa
(aminoácidos ÉTER SATURADO CREA LA FASE
protonados) CON FeSO​4 ETÉREA DONDE SE
ENCUENTRA EL
DNFB Y LA ACUOSA
Resuspender en Para concentrar más el
QUE CONTIENE EL
etanol amino N-terminal
AMINO N-TERMINAL
Por ser solvente MARCADO.
orgánico ya que es
soluble
BAÑO MARÍA ELIMINA POR
EVAPORACIÓN LOS
Cromatografía Separar los RESTOS DE ÉTER.
componentes de una
mezcla
CENTRIFUGACIÓN SEPARACIÓN DE LA
Tabla 1. Interpretación de cada paso ocurrido en el PROTEÍNA.
método de Sanger. (Ávila Martínez Kenia)

HCl 6N HIDRÓLISIS

PASO/SUSTANCIA EXPLICACIÓN
HIDRÓLISIS ÁCIDA REACCIÓN CON LA
QUE SE ROMPEN
HEMOGLOBINA PROTEÍNA LOS ENLACES
CUATERNARIA A PEPTÍDICOS.
ANALIZAR
 LAVADOS CON SE EXTRAE EL
ÉTER AMINO N-TERMINAL
EN LA FASE ETÉREA
Y LOS
AMINOÁCIDOS
PROTONADOS EN
LA FASE ACUOSA

RESUSPENDER EN AUMENTAR
ETANOL CONCENTRACIÓN
DEL AMINO
N-TERMINAL

CROMATOGRAFÍA SEPARACIÓN DE
LOS COMPONENTES
DE LA MUESTRA
PROBLEMA.
Tabla 2. Interpretación de cada paso ocurrido en el
método de Sanger. (Calónico Tamayo Alan)

Esquema a escala 1:2 del cromatograma

obtenido y su interpretación. Imagen 2. Cromatograma obtenido de Calónico
Tamayo Alan.

Escribir las condiciones del

cromatograma.
● Colocar cantidad pequeña de
muestra.
● No tocarlo directamente con las
manos.
● Respetar la alineación de las fibras.
● Mantener perfectamente sellada la
cámara hasta que termine de correr el
cromatograma.
● Evitar adicionar exceso de fase
estacionaria.
● Secar entre cada aplicación de la
muestra problema y los estándares.

Resultados de los valores de Rf

obtenidos, en forma de tabla.

SUSTANCI RECORRID RECORRIDO Rf

A O DE LA DE FASE
Imagen 2. Cromatograma obtenido de Calónico MANCHA ESTACIONARI
Tamayo Alan. (cm) (​X​) A (cm) (​S)
 peptídicos quedando aminoácidos y el amino
DNP-Ala 20.8 34.6 0.60 N-terminal marcado.
Discusión.
DNP-Val 22.4 34.6 0.65 La hemoglobina es una proteína cuaternaria
de transporte formada por dos cadenas alfa
y dos cadenas beta y en el centro un grupo
DNP-Phe 19.2 34.6 0.55
hemo. La marcación del amino N-terminal
por el método de Sanger permitió conocer el
DNP-proble 18.5 34.6 0.53
aminoácido con el que comienza la cadena
ma
principal de la proteína, el aminoácido fue
Tabla 3. Valores de los Rf obtenidos del
fenilalanina (Phe) y esto se logra conocer
cromatograma.
Reacciones debido a que cuando se hizo la separación
de los componentes de la muestra contra los
aminoácidos marcados (DNP-Ala, DNP-Val y
DNP-Phe) de los cuales se obtuvieron los
siguientes resultados de relación de frentes
(Rf) respectivamente: DNP-Ala Rf=0.6,
DNP-Val Rf=0.65 y DNP-Phe=0.55. Mientras
que la muestra con el amino N-terminal
marcado por el DNFB tuvo un Rf=0.53, esto
lo hace muy similar al obtenido con la
DNP-Phe con tan solo dos centésimas más
de valor que el problema justo como es
mencionado en el trabajo de Sanger (1945) ,
Imagen 3. Reacción de Sustitución Nucleofílica
Aromática entre el DNFB y una proteína por lo tanto hace posible deducir que se trata
del aminoácido Fenilalanina como el
En esta reacción ocurre una sustitución aminoácido marcado.
entre el amino N-terminal y el sustituyente Conclusiones.
Flúor, en donde el flúor desprotona el amino ● El método de Sanger es útil para
N-terminal y se formará HF, posteriormente conocer la secuenciación de una
se formará un enlace entre el N-terminal y el proteína al marcar el amino
DNB. N-terminal.
● las proteínas comienzan por un
extremo amino N-terminal y terminan
con un grupo alfa carboxilo.
● El método de cromatografía en papel
es sensible a la separación de
muestras.
Bibliografía.
Nelson D.L., Cox M.M., “Lehninger.
Principios de Bioquímica”, 3a. Ed. Editorial
Omega., pp 138,141,142 (2000)

Imagen 4. Reacción de hidrólisis ácida

La proteína marcada con el DNB por medio

de la hidrólisis ácida romperá los enlaces