NTC5472

NORMA TÉCNICA NTC
COLOMBIANA 5472
2007-03-21
DETERMINACIÓN DE OCRATOXINA A EN
CEREALES Y SUS DERIVADOS POR
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIENCIA, HPLC
E: DETERMINATION OF OCHRATOXIN A IN CEREALS AND

CEREAL PRODUCTS.
CORRESPONDENCIA:
DESCRIPTORES: producto alimenticios - harinas; harina

de trigo - requisitos, producto cereal,
trigo, ocratoxina, cromatografía
líquida, método de análisis.
I.C.S.: 67.060.00
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)

Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435
Prohibida su reproducción Editada 2007-03-28

PRÓLOGO
El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo

nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.
ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.
La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica

está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último
caracterizado por la participación del público en general.
La NTC 5472 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2006-03-21.
Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.
A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a

través de su participación en el Comité Técnico 50 Productos de Molinería.
ACTA-DELTAGEN HARINERA INDUPAN S.A.

ALIMENTOS POLAR S.A. ICONTEC
CARULLA VIVERO S.A. ICONTEC – NOREXPORT
CENALPAN LTDA. INSTITUTO COLOMBIANO
COLDAENZIMAS LTDA. AGROPECUARIO
COMESTIBLES LA 80 MOLINO APOLO
COMPAÑÍA DE GALLETAS NOEL S.A. MOLINO EL LOBO LTDA.
COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A. MOLINOS DEL ATLÁNTICO
CONSULTOR NUESTRO PAN
DELICOL S.A. PRICOL ALIMENTOS S.A.
DISTRIACEITES S.A. PROCOHARINAS LTDA.
DON MAÍZ S.A. PRODUCTOS ALIMENTICIOS DORIA S.A.
ENZIPÁN DE COLOMBIA LTDA. RAFAEL DEL CASTILLO & CIA S.A.
GENEROSO MANZINI Y CIA S.A. UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
HARINERA DEL VALLE
Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las

siguientes empresas:
ALIMENTOS COMPLEMENTARIOS COLOMBINA S.A.

AREPA DOÑA ALEJA COMPAÑÍA INDUSTRIAL DE CEREALES
ASINAL S.A.
ASOCIACIÓN NACIONAL DE INDUSTRIALES COMPAÑÍA NACIONAL DE LEVADURAS
-ANDI- LEVAPÁN S.A.
BIMBO S.A. CONALPAN LTDA.
CAFAM DELGRANO
CARREFOUR COLOMBIA SEDE
DELICOL S.A. (GENERAL MILLS DE MAZAPÁN
COLOMBIA S.A.) MINISTERIO DE PROTECCIÓN SOCIAL
DIETESA S.A. MOLINOS APOLO ORGANIZACIÓN
DSM NUTRITIONAL PRODUCTS SOLARTE S.C.A.
FABRICA DE PRODUCTOS ALIMENTICIOS MOLINOS SAN MARTÍN
RIALTO LTDA. NABISCO ROYAL INC
FEDERACIÓN NACIONAL DE MOLINEROS PROCOHARINAS LTDA.
DE TRIGO PRODUCTOS ALIMENTICIOS DORIA S.A.
FRITOLAY COLOMBIA LTDA. PRODUCTOS QIKELY LTDA.
FUNDACIÓN INTAL PRODUCTOS YUPI S.A.
HARINERA ANTIOQUEÑA S.A. PROMASA S.A.
INDUSTRIA DE HARINAS TULÚA LTDA. PRONTAREPA E.U.
INDUSTRIAS DEL MAÍZ S.A. PURAC SITESES
INSTITUTO PARA LA VIGILANCIA DE UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO
MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS -INVIMA- UNIVERSIDAD NACIONAL,
LISTA ALIMENTICIA S.A. LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA
MAMIPAN DE COLOMBIA LTDA.
ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados.
DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 5472
CONTENIDO
Página
0. INTRODUCCIÓN ..........................................................................................................1
1. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN ........................................................................1
2. REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................1
3. PRINCIPIO....................................................................................................................1
4. REACTIVOS .................................................................................................................2
5. EQUIPOS Y MATERIALES ..........................................................................................3
5.1 MOLINO DE LABORATORIO Y TAMIZ ......................................................................3
5.2 MEZCLADOR DE ALTA VELOCIDAD ........................................................................3
5.3 ESPECTRÓFOTOMETRO ...........................................................................................3
5.4 CELDAS DE CUARZO ................................................................................................3
5.5 EMBUDOS....................................................................................................................3
5.6 PAPEL DE FILTRO CUALITATIVO RAPIDO ..............................................................4
5.7 ERLENMEYER DE 250 ml CON TAPA ROSCA O VASOS DE LICUADORA

DE 200 ml EN VIDRIO..................................................................................................4
5.8 CARTUCHO DE ADSORCIÓN.....................................................................................4
5.9 MÚLTIPLE DE VACÍO..................................................................................................4
5.10 TUBOS DE ENSAYO ...................................................................................................4
5.11 FILTRO DE MEMBRANA.............................................................................................4
5.12 APARATO PARA HPLC ..............................................................................................4

Página
5.13 VIALES .........................................................................................................................5
5.14 MICROPIPETAS DE VOLUMEN VARIABLE ..............................................................5
6. PROCEDIMIENTO........................................................................................................5
6.1 GENERALIDADES .......................................................................................................5
6.2 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO.......................................................5
6.3 EXTRACCIÓN DE OCRATOXINA A DE LA MUESTRA .............................................5
6.4 PREPARACIÓN DEL CARTUCHO Y CARGA DE LA MUESTRA..............................5
6.5 LAVADO DEL CARTUCHO .........................................................................................5
6.6 ELUCION DE LA OTA..................................................................................................6
6.7 CONDICIONES DE OPERACIÓN DEL HPLC .............................................................6
6.8 CURVA DE CALIBRACIÓN .........................................................................................6
6.9 IDENTIFICACIÓN .........................................................................................................6
6.10 DETERMINACIÓN........................................................................................................6
6.11 CONFIRMACIÓN..........................................................................................................7
7. CÁLCULO.....................................................................................................................7
8. PRECISIÓN ..................................................................................................................8
8.1 GENERALIDADES .......................................................................................................8
8.2 REPETIBILIDAD...........................................................................................................8
8.3 REPRODUCIBILIDAD ..................................................................................................8
9. INFORME DEL ENSAYO .............................................................................................8

Página
ANEXOS
ANEXO A (Informativo)
METODO ALTERNATIVO POR CROMATOGRAFIA EN CAPA DELGADA .......................10
ANEXO B (Informativo)
DATOS OBTENIDOS DEL ENSAYO INTERLABORATORIO PARA LA ELABORACIÓN DE
LA NORMA ISO 15141-2:1998 .............................................................................................13
ANEXO C (Informativo)
BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................16
DOCUMENTO DE REFERENCIA..........................................................................................23
DETERMINACIÓN DE OCRATOXINA A EN CEREALES

Y SUS DERIVADOS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
DE ALTA EFICIENCIA, HPLC
0. INTRODUCCIÓN
El Comité Técnico 50 de productos de molinería elaboró el presente documento técnico,

introduciendo cambios en el método analítico para la determinación de la ocratoxina A tomado
de su documento de referencia, la ISO 15141-2:1998 que se relacionan en un cuadro en el
Anexo C (Informativo) del presente documento.
1. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN
Esta norma especifica un método para la determinación cuantitativa de ocratoxina A (OTA) en

niveles superiores a 3 μg/kg.
NOTA El método es aplicable a la determinación de OTA en cereales (trigo, cebada, avena, centeno, maíz) y
alimentos derivados.
2. REFERENCIA NORMATIVA
El siguientes documento normativo referenciado es indispensable para la aplicación de este

documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica únicamente la edición citada. Para
referencias no fechadas, se aplica la última edición del documento normativo referenciado
(incluida cualquier corrección).
EN ISO 3696, Water for Analytical Laboratory Use. Specification and Test Methods (ISO 3696:1987).
3. PRINCIPIO
La ocratoxina A (OTA) se extrae con una solución de diclorometano (cloruro de metileno,

CH2Cl2) - ácido fosfórico acuoso. Una alícuota del extracto se aplica a un cartucho de
extracción en fase sólida para OTA, se lavan los compuestos no correspondientes a la OTA y
luego se eluye la OTA con diclorometano - ácido fórmico. La OTA se separa luego mediante
cromatografía líquida de alta eficiencia (high-performance liquid chromatography, HPLC) de
fase reversa y se identifica y cuantifica mediante fluorescencia. La cromatografía líquida de alta
eficiencia del derivado éster metílico de la OTA confirma la identificación (véanse las
referencias [2] a [5], del Anexo C (Informativo)).
1 de 23
ADVERTENCIA La ocratoxina A produce daño en el riñón e hígado y probablemente es carcinógena. Observe las
precauciones apropiadas de seguridad (véase la referencia [6] del anexo C (informativo)) para la manipulación de
estos compuestos y en particular evite manipularlos en su estado seco, debido a que su naturaleza electrostática
puede originar dispersión e inhalación. Los elementos de vidrio se pueden descontaminar con solución al 4 % de
hipoclorito de sodio. Se llama la atención sobre la declaración hecha por la Agencia Internacional para la
Investigación en Cáncer (IARC, OMS) (véanse las referencias [7], [8] del anexo C (informativo)).
4. REACTIVOS
Durante el análisis, a menos que se establezca algo diferente, se utilizan únicamente reactivos
con grado analítico reconocido y agua destilada o de Grado 1, según la norma EN ISO 3696. El
solvente debe tener calidad adecuada para el análisis de HPLC.
4.1 Diclorometano
4.2 Ácido fosfórico, c (H3PO4) ≈ 0,1 mol/L.
4.3 Hexano
4.4 Ácido fórmico
4.5 Metanol
4.6 Tolueno
4.7 Ácido acético glacial, ϕ (CH3COOH) ≈ 98 %.
4.8 Acetonitrilo
4.9 Solución de elución: diclorometano y ácido fórmico, 99+1 (V+V).
4.10 Fase móvil: se mezclan acetonitrilo, agua y ácido acético glacial 49.5 + 49.5 + 1 (V+V+V) y
se desgasifica.
4.11 Mezcla de solvente para disolver la OTA: tolueno y ácido acético glacial, 99+1 (V+V).
4.12 Trifluoruro de boro
4.13 Trifluoruro de boro en solución de metanol, ρ (BF3) = 14 g/100 ml.
ADVERTENCIA Se debe usar una campana de ventilación con buen mantenimiento. Evite el contacto con la
piel, los ojos y el tracto respiratorio.
4.14 Ocratoxina A, en forma de cristales o como película en vial.
4.15 Solución madre de ocratoxina A
Se disuelve 1 mg de ocratoxina A (cristales) o el contenido de un vial (si la ocratoxina A está en

forma de película) en una mezcla de solvente (véase el numeral 4.11), para obtener una
solución que contenga aproximadamente 20 μg/ml a 30 μg/ml de ocratoxina A.
Para determinar la concentración exacta, se registra la curva de absorción entre una longitud
de onda de 300 nm y 370 nm en una celda de cuarzo de 1 cm (véase el numeral 5.4), con la
mezcla de solvente de referencia (véase el numeral 4.11). Se identifica la longitud de onda para
la absorción máxima haciendo el registro a intervalos de 1 nm alrededor del máximo como
2
referencia. Se calcula la concentración de masa de ocratoxina A, ρota, en microgramos por

mililitro usando la ecuación 1:
M x 1 000
ρOTA = Amáx x
k
en donde
Amáx = es la absorción determinada en el máximo de la curva de absorción en este caso (aldededor de

333 nm).
M = es la masa molecular relativa de ocratoxina A (M = 403,8 g/mol).
κ = es el coeficiente de absorción molar relativa de ocratoxina A en la mezcla de solvente (en este

-1 -1
caso: 5,440 l mol cm ).
4.16 Solución estándar de ocratoxina A
Se diluye la solución base con la mezcla de solvente para obtener una solución estándar con
una concentración de masa de OTA de 1 μg/ml.
Esta solución se puede almacenar en un refrigerador a 4 °C. Se debe verificar su estabilidad.
4.17 Soluciones de calibración de ocratoxina A
Se dispensan alícuotas de 5 μl, 25 μl, 50 μl y 100 μl de la solución estándar en viales separados

de 4 ml a 5 ml, usando una micropipeta apropiada. Se evapora bajo nitrógeno, justo hasta que se
seque. Se adiciona 1,0 ml de la fase móvil a cada frasco para obtener concentraciones finales de
masa de OTA de 0,125 ng/25 μl, 0,625 ng/25 μl, 1,25 ng/25 μl, y 2,5 ng/25μl. Estas cantidades
equivalen a una concentración en una muestra de 2,5 µg/kg, 12,5 µg/kg, 25,0 µg/kg y 50,0 µg/kg,
respectivamente.
4.18 Solución de hipoclorito de sodio
ρ (NaOCl) = 4 g/100 ml.
5. EQUIPOS Y MATERIALES
Equipo común de laboratorio y, en particular, lo siguiente:
5.1 MOLINO DE LABORATORIO Y TAMIZ
El tamaño del orificio del tamiz debe ser de 1 mm.
5.2 MEZCLADOR DE ALTA VELOCIDAD
Con frasco de 1250 ml y tapa.
5.3 ESPECTRÓFOTOMETRO
Adecuado para mediciones de longitudes de onda entre 300 nm y 370 nm, con ancho de banda
espectral no superior a ± 2 nm.
3
5.4 CELDAS DE CUARZO
Con longitud de trayectoria óptica de 1 cm y sin absorción significativa entre longitudes de onda
de 300 nm y 370 nm.
5.5 EMBUDOS
Deben tener diámetros apropiados, por ejemplo, 9 cm y 25 cm.
5.6 PAPEL DE FILTRO CUALITATIVO RÁPIDO
Deben tener un diámetro apropiado, por ejemplo 15 cm.
5.7 ERLENMEYER DE 250 ml CON TAPA ROSCA O VASOS DE LICUADORA DE 200 ml

EN VIDRIO
5.8 CARTUCHO DE ADSORCIÓN
Tubo desechable de polipropileno, de 6 ml especial para la determinación de OTA (cartucho

Micotox®1 M2200 o equivalente).
5.9 MÚLTIPLE DE VACÍO
Con llaves de paso en cada puerto para sostener columnas de extracción en fase sólida. Se
puede reemplazar por una jeringa (5 ml a 10 ml) con un adaptador adecuado (Luer).
5.10 TUBOS DE ENSAYO
De 40 ml con fondo cónico, con tapón de goma perforado con dos agujas calibre 18.
5.11 FILTRO DE MEMBRANA
Con tamaño de poro aproximado de 0,45 μm.
5.12 APARATO PARA HPLC
Debe contener lo siguiente:
5.12.1 Cromatógrafo líquido de alta eficiencia, reservorio para el eluente, bomba con flujo
ajustable entre 0,5 ml/min y 5 ml/min, válvula de inyección, por ejemplo con asa de 25 μl ó
inyector automático, detector de fluorescencia, integrador o grabador compatible.
5.12.2 Columna analítica de fase reversa para HPLC:
- longitud: 125 mm
- diámetro interno: 4,6 mm
- empaquetamiento: material esférico de 5 μm C18 o equivalente.
NOTA También se pueden usar columnas más largas (por ejemplo con longitud de 250 mm).
1
Micotox® es un ejemplo de un producto disponible comercialmente. Esta información se da para
conveniencia de los usuarios de esta norma, y no constituye un respaldo de ICONTEC a este producto.
4
5.13 VIALES
Con capacidad aproximada de 5 ml, con tapa rosca recubierta con PTFE o un recipiente
apropiado que se pueda sellar.
5.14 MICROPIPETAS DE VOLUMEN VARIABLE
6. PROCEDIMIENTO
6.1 GENERALIDADES
Se recomienda realizar todo el proceso analítico en un solo día de trabajo. Si se procesan

varias muestras al mismo tiempo, todas las muestras deberían ser analizadas durante la noche
usando un inyector automático.
6.2 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO
Se muele la muestra y se mezcla totalmente hasta que pase a través de un tamiz de 1 mm,
usando un molino de laboratorio o un mezclador.
6.3 EXTRACCIÓN DE OCRATOXINA A DE LA MUESTRA
Se pesa una porción de ensayo de 25 g, con una aproximación de 0,1 g, preparada como se
indicó en el numeral 6.2 en un erlenmeyer de 250 ml o en un vaso de licuadora de 200 ml; se
adicionan 12,5 ml de solución de ácido fosfórico 0,1 mol/L (véase el numeral 4.2), se
homogeniza y se adicionan 125 ml de diclorometano. Se mezcla durante 3 min a velocidad
media (licuadora) o durante 1 h en agitador mecánico de alta velocidad (erlenmeyer). Se filtra el
extracto a través de papel de filtro cuantitativo de porosidad media (por ejemplo S&S 589/32 o
equivalente) y se recolectan 5 ml de filtrado en un tubo de ensayo.
6.4 PREPARACIÓN DEL CARTUCHO Y CARGA DE LA MUESTRA
Acople los cartuchos para OTA (véase el numeral 5.8) a los puertos del múltiple de vacío, el
múltiple debe tener en su interior matraces o vasos de precipitado cónicos para la recolección
de los solventes de acondicionamiento y lavado. Se transfieren los 5 ml de extracto filtrado al
cartucho y se drena por gravedad a un flujo máximo de 2 ml por min. Para evitar que la
solución drene demasiado rápido se recomienda compactar el material de empaque del
cartucho antes de realizar el ensayo presionando el material de empaque con el émbolo de un
jeringa. En caso de necesitar acelerar las eluciones, se aplica succión leve. Este procedimiento
también se puede realizar manualmente aplicando presión con una jeringa de 5 ml a 10 ml fija
a la parte superior del cartucho mediante un adaptador apropiado. No permita que el cartucho
se seque. Se dejan aproximadamente 2 mm de solvente en la parte superior.
6.5 LAVADO DEL CARTUCHO
Con una pipeta se vierten en el cartucho 5 ml de hexano y se dejan aluir por gravedad. No
permita que el cartucho se seque. Se lava luego con 15 ml de diclorometano en tres
volúmenes sucesivos de 5 ml cada uno. Deseche los solventes de lavado.
2
S&S 589/3 es un ejemplo de un producto disponible comercialmente. Esta información se da para
5
6.6 ELUCIÓN DE LA OTA
Se eluye la ocratoxina con 20 ml de solución de elución (véase el numeral 4.9). Se recolecta el

eluato en un tubo de ensayo de 40 ml de fondo cónico. Se evapora el solvente bajo nitrógeno o
mediante calentamiento y vacío, justo hasta que se seque. Se disuelve inmediatamente en 500 μl
(VT) de la fase móvil y se filtra a través de un microfiltro de 0,45 μm en un vial tapa rosca de 5 ml
o en un vial para inyector automático (= solución de muestra de ensayo).
En caso de resultar positiva la muestra de ensayo se debe realizar la confirmación de identidad

mediante la formación del metil-éster de la OTA (véase el numeral 6.11).
6.7 CONDICIONES DE OPERACIÓN DEL HPLC
Cuando se usó la columna según lo establecido en el numeral 5.12.2 y la fase móvil según el
numeral 4.11, se observó que los siguientes parámetros eran adecuados:
Flujo: 0,6 ml/min
Detección de fluorescencia Longitud de onda de excitación de 333 nm.

(con monocromadores): Longitud de onda de emisión de 460 nm.
Detección de fluorescencia (con filtros): Filtro de obturación de 420 nm.
Volumen de inyección (Vi): 20 μl a 25 μl y se usa al menos 50 μl para

llenar el asa de 25 μl.
6.8 CURVA DE CALIBRACIÓN
Se elabora una curva de calibración al comienzo del análisis y siempre que cambien las
condiciones cromatográficas.
Se inyectan mínimo cuatro soluciones de calibración de diferentes concentraciones apropiadas

(véase el numeral 4.17).
Se grafican los valores de las soluciones de calibración de ocratoxina A en comparación con

las concentraciones de masa de ocratoxina A, en nanogramos.
Se debe asegurar que se realice la verificación de la linealidad [9].
6.9 IDENTIFICACIÓN
Se identifica la ocratoxina A comparando el tiempo de retención de la muestra con el de la

sustancia estándar.
Algunas veces es necesario identificar el pico de ocratoxina A mediante la inyección simultánea

de la solución de muestra de ensayo y la solución estándar.
6.10 DETERMINACIÓN
Inmediatamente, se lleva la muestra al cromatógrafo. Para realizar la determinación mediante

el método de estándar externo, se integra el área pico o se determina la altura del pico y se
comparan los resultados con los valores correspondientes para la sustancia estándar, con el
área/altura de pico más aproximada, o se utiliza una curva de calibración en cuyo caso se
6
pueden preparar soluciones adicionales con concentraciones que estén dentro del rango lineal
para la curva de calibración.
Se inyectan volúmenes iguales de la solución de muestra de ensayo y de la solución estándar

para la curva de calibración.
Se determina la masa de ocratoxina A, en nanogramos, correspondiente a la fluorescencia de

la solución de muestra de ensayo inyectada.
6.11 CONFIRMACIÓN
Si es necesario, se confirma la identidad mediante la desaparición del pico en el tiempo de

retención para la ocratoxina A y la aparición de un nuevo pico en el mismo tiempo de retención
del metil-éster de la ocratoxina A (aproximadamente 10 min después).
Para la confirmación, se procesa de nuevo la muestra y el residuo seco obtenido finalmente

(véase el numeral 6.6) se redisuelve en 100 µl de diclorometano. Se transfieren los 100 µl a un
vial de 5 ml con tapa rosca y se enjuaga varias veces el tubo de ensayo, llevando los enjuages
al vial y se evapora hasta sequedad el diclorometano bajo nitrógeno. Tanto a la muestra como
a 100 µl de solución estándar de OTA llevados a sequedad en otro vial se adicionan 100 µl de
solución de trifluoruro de boro en solución de metanol (véase el numeral 4.13). Se tapa cada
vial y se calienta durante 15 min al baño de María, con temperatura entre 50 °C y 60 °C. Se
evapora hasta que se seque en un baño de vapor bajo nitrógeno.
Si hay presencia de agua, se adiciona 1 ml de acetonitrilo y se continúa la evaporación hasta

que se seque. Se enfría y se diluye con la fase móvil hasta alcanzar el mismo volumen usado
para el análisis de la solución de muestra de ensayo no derivada y se somete esta solución a
separación cromatográfica bajo las condiciones descritas en el numeral 6.7.
La finalización de la derivación se puede verificar a partir de los cromatogramas.
7. CÁLCULO
Se calcula la fracción de masa, wOTA de ocratoxina A en microgramos por kilogramo usando la

ecuación 2:
Rs x VT
wOTA =
R A x VI x m
en donde
m = masa de la muestra de ensayo en el extracto final, aquí: 25 g x 5 ml/125 ml = 1 g.
RS = respuesta de la solución de muestra de ensayo inyectada medida como área de pico o altura de
pico.
RA = respuesta calculada media normalizada (respuesta para 1 ng de ocratoxina A) de las cinco

diferentes soluciones de calibración (véase el numeral 4.18).
VT = volumen final de la solución de muestra de ensayo (aquí: 500 μl).
VI = volumen de la muestra de ensayo inyectada (aquí: 25 μl).
El resultado se reporta de acuerdo con la legislación actual y después de redondear hasta dos
cifras decimales.
7
Se debe indicar si se aplicó o no corrección para la recuperación.
8. PRECISIÓN
8.1 GENERALIDADES
Límite de detección 1 µg/kg.
Límite cuantificación: 3 µg/kg.
Porcentaje de recuperación promedio en harinas de trigo y de maíz: 78 %.
Desviación estándar relativa, SR = 2,02.
Desviación estándar relativa porcentual, RSDR = 2,60 %.
NOTA Los cambios sugeridos al método tomado del documento de referencia respecto a la eliminación del
reactivo de la trietilamina, la fase móvil (tomada de la referencia de la AOAC 991.44) y el volumen de asa para la
inyección ya que la curva de calibración está basada en un volumen de inyección de 25 ml corresponden a
modificaciones mínimas que no implican variaciones en los parámetros de validación del mismo.
8.2 REPETIBILIDAD
La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo únicos sobre material de ensayo
idéntico, realizado por un operador usando el mismo equipo en el intervalo de tiempo más corto
viable, excederá el límite de repetibilidad r en no más del 5 % de los casos.
NOTA En el anexo B (informativo) se incluyen los valores mencionados sobre la repetibilidad de la prueba en los
productos analizados referenciados en el documento de referencia de la presente norma, la ISO 15141-2.
8.3 REPRODUCIBILIDAD
La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo únicos en material de ensayo idéntico,
reportados por dos laboratorios excederá el límite de reproducibilidad R en no más del 5 % de
los casos.
NOTA En el Anexo B (informativo) se incluyen los valores mencionados sobre la reproducibilidad de la prueba en
los productos analizados referenciados en el documento de referencia de la presente norma, la ISO 15141-2.
9. INFORME DEL ENSAYO
El informe de ensayo debe contener los siguientes datos como mínimo:
- toda la información necesaria para la identificación de la muestra;
- referencia a esta norma o al método utilizado;
- los resultados y las unidades en las cuales se han expresado los resultados;
- fecha y tipo de muestreo (si se conoce);
- fecha de recibo de la muestra de laboratorio;
- fecha del ensayo;

8
- todo aspecto particular observado en el transcurso del ensayo;
- toda operación no especificada en el método o considerada opcional que pueda afectar

los resultados.
9
ANEXO A
(Informativo)
MÉTODO ALTERNATIVO POR CROMATOGRAFIA EN CAPA DELGADA
El método alterno por cromatografía en capa fina es un método "In House", desarrollado y
validado en laboratorios colombianos (véase el Anexo C, literal [10]) con base en métodos
publicados en la literatura científica, se incluye en la norma para los laboratorios que no
cuentan con cromatografía por HPLC.
A.1 EQUIPOS Y MATERIALES
1) Cartuchos de extracción en fase sólida para ocratoxina A (cartucho Micotox®3) M2200 o

equivalente).
2) Bomba de vacío.
3) Balanza con sensibilidad de 0,1 g.
4) Cabina con lámpara de luz ultravioleta de doble longitud de onda (254 nm y 366 nm).
5) Cabina de extracción de vapores y gases.
6) Cámaras de vidrio para el desarrollo de cromatoplacas de 10 cm x 10 cm (o de 20 cm x 20 cm).
7) Densitómetro con detector UV y de fluorescencia (opcional para cuantificación).
8) Estufa de circulación forzada (con capacidad de graduar temperatura de 105 °C).
9) Jeringa cromatográfica graduada de 50 µl o sembrador automático de placas.
10) Agitador de vaivén o licuadora con vasos de vidrio de 200 ml.
11) Baño termostatado.
12) Papel de filtro cuantitativo de mínimo 15 cm de diámetro (S&S 589/32) o equivalente).
13) Pipetas de 5 ml, 10 ml y 20 ml de capacidad.
14) Tubos de ensayo de fondo cónico de 40 ml de capacidad con tapones de goma

perforados con dos agujas calibre 18.
15) Cromatoplacas de sílica gel 60 sobre aluminio, de 10 cm x 10 cm.
3)
Micotox® es un ejemplo de un producto disponible comercialmente. Esta información se da para
2)
10
A.2 PROCEDIMIENTO
1) Pesar 25 g de muestra molida y homogeneizada en un vaso de licuadora de vidrio de 200

ml de capacidad o en un erlenmeyer de 250 ml con tapa rosca.
2) Adicionar 12,5 ml de solución de ácido fosfórico 0,1 mol/L (véase el numeral 4.2) y
humidificar homogeneamente la muestra.
3) Adicionar 125 ml de diclorometano y homogeneizar durante 3 min (licuadora) o durante

una hora en agitador mecánico.
4) Filtrar a través de papel de filtro cuantitativo y transferir exactamente 5 ml del filtrado a

un tubo de ensayo.
5) Atravesar un tapón de goma #5 con dos agujas calibre 18 de 2 pulgadas de longitud y

colocarlo en un tubo cónico de 40 ml de capacidad. Ajustar el cartucho de fase sólida a
una de las agujas y verter los 5 ml del filtrado al interior del cartucho. Drenar por
gravedad a un flujo máximo de 2.0 ml/min y descartar la solución. Para evitar que la
solución drene demasiado rápido se recomienda compactar el material de empaque del
chartucho antes de realizar el ensayo presionando el material con el émbolo de un
jeringa.
6) Sin dejar secar la columna, adicionar 5 ml de hexano, seguidos de 15 ml de

diclorometano adicionados en tres volúmenes sucesivos de 5 ml cada uno. Descartar
las soluciones de lavado.
7) Cambiar el ensamble de tapón, agujas y columna a un tubo limpio de 40 ml y eluir la

OTA con 20 ml de diclorometano y ácido fórmico, 99 + 1 (V+V) adicionados en dos
volúmenes sucesivos de 10 ml cada uno.
8) Evaporar el eluato a sequedad usando un baño termostatado a 60 °C y vacío (hacer

vacío en una de las agujas dejando la otra libre para circulación de aire) o bajo una
corriente suave de nitrógeno.
9) Disolver el residuo seco con 100 µl de tolueno y ácido acético, 99+1 (V+V).
10) Con ayuda de una jeringa graduada de 20 µl de capacidad o mediante un

autosembrador, sembrar 5 µl, 10 µl y 20 µl de una solución estándar de OTA de 0,2
µg/ml en tolueno y ácido acético, 99 + 1 (V+V) en una cromatoplaca de sílica gel 60 de
10 x 10 cm. En la misma placa, sembrar 20 µl de cada muestra.
11) Desarrollar la placa con tolueno/metanol/ácido acético, 90+5+5 (V+V+V) hasta 1 cm del
borde superior. Una vez desarrollada, retirarla de la cubeta y dejarla secar al aire dentro
de una cabina extractora de gases y vapores.
12) Observar la cromatoplaca bajo luz ultravioleta de onda larga (366 nm) y determinar la
cantidad aproximada de OTA comparando el tamaño e intensidad de las manchas de
los estándares con los que puedan presentarse en las muestras. La OTA presenta una
intensa fluorescencia verdosa y un Rf aproximado de 0.6 en este sistema
cromatográfico.
11
A.3 CÁLCULOS
Se toman 25 g de muestra en 125 ml de solvente orgánico. De este solvente se toman 5 ml

para posterior purificación en cartucho de fase sólida. El eluato seco obtenido de la columna se
redisuelve con 100 µl de solvente, de los cuales se siembran 20 µl en la cromatoplaca. El
equivalente en peso de la muestra sembrada en la placa corresponde a la siguiente ecuación:
Equivalente de muestra en placa = 25 g x 5/125 ml x 0,02/0,1 ml = 0,2 g
La cantidad de OTA en placa correspondiente a los 5 µl, 10 µl y 20 µl de solución estándar

de 0,2 µg/ml es de 1 ng, 2 ng y 4 ng, respectivamente. Estas cantidades equivalen a 5
µg/kg, 10 µg/kg y 20 µg/kg de OTA en muestras de ensayo.
A.4 CONFIRMACIÓN
Rociar finamente la cromatoplaca con una solución alcohólica de bicarbonato de sodio (6,0 g
de NaHCO3 en 100 ml de agua y 20 ml de etanol) y dejar secar. Observar de nuevo la placa
bajo luz ultravioleta: la fluorescencia verdosa de la OTA cambia a azul y se hace más intensa.
Límite de detección: < 5 µg/kg. Límite de cuantificación: 5 µg/kg.
NOTA Para el cálculo de la Ocratoxina A véase el numeral 7; para la determinación de la precisión del método,
véase el numeral 8; para el informe de ensayo, véase el numeral 9 de la presente norma.
12
ANEXO B
(Informativo)
DATOS OBTENIDOS DEL ENSAYO INTERLABORATORIO PARA

LA ELABORACIÓN DE LA NORMA ISO 15141-2:1998
B. DATOS DE PRECISIÓN
B.1 GENERALIDADES
En el presente anexo se resumen los detalles del ensayo interlaboratorio realizado para la
elaboración del documento de referencia utilizado para la elaboración de la presente norma, de
la precisión del método, según la ISO 5725: 1986. Los valores derivados del ensayo
interlaboratorio no se pueden aplicar a los rangos de concentración de analito ni a matrices
diferentes a las presentadas.
De acuerdo con la norma ISO 5725:1986. se han definido los siguientes parámetros en un
ensayo interlaboratorio. El ensayo fue realizado por AOAC Internacional en Cupertino con la
International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) y el Nordic Committee on Food
Análisis (NMKL). Participaron un total 16 laboratorios de Europa, Canadá y Estados Unidos en
este estudio, en el cual se adicionaron 10 μg/kg y 20 μg/kg de ocratoxina A la cebada y al maíz.
Los resultados de este estudio se presentan en la Tabla A.1.
Tabla B.1
Muestra Cebada Cebada Maíz Maíz

Año del ensayo interlaboratorio 1990 1990 1990 1990
Número de laboratorios 16 16 16 16
Número de muestras 1 2 1 2
Número de laboratorios conservados después de 15 14 15 15
eliminar a los atípicos.
Número de atípicos (laboratorios) 1 2 1 1
Número de resultados aceptados 15 28 15 30
− 7,4 14,4 8,2 16,3
Valor medio x (μg/kg)
Desviación estándar de la repetibilidad sr (μg/kg). - 1,1 - 3,3
Desviación estándar relativa de la repetibilidad RSDr - 7,9 % - 20,1
Límite de repetibilidad r (μg/kg) - 3,1 - 9,2
Desviación estándar de la reproducibilidad sR 2,0 3,8 1,7 4,6
(μg/kg).
Desviación estándar relativa de la reproducibilidad 27,2 % 26,5 % 20,7 % 28,4 %
RSDR
Límite de reproducibilidad R (μg/kg). 5,6 10,6 4,8 12,9
Recuperación 74 % 72 % 82 % 82 %
En un segundo estudio interlaboratorio, 12 laboratorios europeos analizaron muestras de

salvado de trigo y centeno a las cuales se les había adicionado ocratoxina A y muestras de
cebada contaminadas de manera natural. Las concentraciones de ocratoxina A estuvieron
entre 3 μg/kg y 9 μg/kg. Los resultados de este estudio se presentan en la Tabla A.2.
13
Tabla B.2
Salvado Salvado
Muestra Cebada Cebada Centeno Centeno
de trigo de trigo
Año del ensayo interlaboratorio. 1993 1993 1993 1993 1993 1993
Número de laboratorios. 16 16 16 16 16 16
Número de muestras. 2 2 2 2 2 2
Número de laboratorios conservados
después de eliminar a los atípicos. 12 12 12 12 12 12
Número de atípicos (laboratorios). 4 4 4 4 4 4
Número de resultados aceptados. 24 24 24 24 24 24
Valor medio x (μg/kg) 3,0 2,9 4,8 2,9 4,5 3,8
Desviación estándar de la 0,46 0,49 0,78 0,64 0,77 0,80
repetibilidad sr (μg/kg).
Desviación estándar relativa de la
repetibilidad RSDr 15,2 % 17,1 % 16,2 % 22,5 % 17,1 % 20,8 %
Límite de repetibilidad r (μg/kg) 1,28 1,37 2,18 1,80 2,16 2,23

Desviación estándar de la 0,68 0,62 1,11 0,84 1,20 0,92
reproducibilidad sR (μg/kg).
Desviación estándar relativa de la 22,6 21,7 % 23,0 29,2 % 26,5 % 24,2 %
reproducibilidad RSDR
Límite de reproducibilidad R (μg/kg). 1,90 1,74 3,10 2,34 3,35 2.58
Recuperación - - 65 % 64 % 68 % 70 %
NOTA La recuperación de la ocratoxina A adicionada a las muestras de centeno no satisface los criterios
adoptados por CENT/TC 275/WG 5. Por ello, esta norma no se aplica a la ocratoxina A en centeno.
B.2 REPETIBILIDAD
La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo únicos sobre material de ensayo
idéntico, realizado por un operador usando el mismo equipo en el intervalo de tiempo más corto
viable, excederá el límite de repetibilidad r en no más del 5 % de los casos.
Los valores son:
Cebada − 7,4 μg/kg r= - μg/kg

x =
Cebada − 14,4 μg/kg r= 3,1 μg/kg
x=
Maíz − 8,2 μg/kg r= - μg/kg
x=
Maíz − 16,3 μg/kg r= 9,2 μg/kg
x=
x=
x=
Salvado de trigo − 4,5 μg/kg r= 2,16 μg/kg
x=
Salvado de trigo − 3,8 μg/kg r= 2,23 μg/kg
x=
14
B.3 REPRODUCIBILIDAD
La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo únicos en material de ensayo idéntico,
reportados por dos laboratorios excederá el límite de reproducibilidad R en no más del 5 % de
los casos.
Los valores son:
Cebada − 7,4 μg/kg R= 5,6 μg/kg

x=
x=
Maíz − 8,2 μg/kg R= 4,8 μg/kg
x=
Maíz − 16,3 μg/kg R= 12,9 μg/kg
x=
x=
x=
Salvado de trigo − 4,5 μg/kg R= 3,35 μg/kg
x=
Salvado de trigo − 3,8 μg/kg R= 2,58 - μg/kg
x=
15
ANEXO C
(Informativo)
CUADRO COMPARATIVO RESPECTO A LOS CAMBIOS INTRODUCIDOS EN EL

DOCUMENTO Y SU DOCUMENTO DE REFERENCIA
Documento de referencia
Norma Técnica Colombiana Sustentación
ISO 15141-2:1998
Determinación de ocratoxina a en Alimentos. Véase observación consulta pública:
cereales y sus derivados por determinación de ocratoxina a en Título.
cromatografía líquida de alta cereales y sus derivados
eficiencia, HPLC parte 2: método de cromatografía
líquida de alto
rendimiento con extracción de
bicabornato
1. Alcance El párrafo fue eliminado de la norma,
El método ha sido validado debido a que se pretende mencionar
exitosamente en estudios únicamente el método de referencia
interlaboratorio, de acuerdo con sin tener en cuenta los datos
ISO 5725:1986 (1) en cebada entera obtenidos por los interlaboratorios
con contenido de 2,9 μg/kg, 3,0 μg/kg, contenidos en el documento de
7,4 μg/kg y 14,4 μg/kg de ocratoxina A, referencia. Se considera que puede
en maíz entero con contenido de 8,2 causar confusión en los lectores ya
μg/kg y 16,3 μg/kg de ocratoxina A, así que en el estudio se entendían como
como en salvado de trigo con 3,8 μg/kg límites para ocratoxina A, para los
y 4,5 μg/kg de ocratoxina A. productos con los que se llevaron a
cabo los estudios.
OCRATOXINA A (OTA) OCRATOXINA A Se incluye la abreviatura para
Todo el texto. denominar este tipo de ocratoxina A,
debido a que en la literatura y en
otros estudios se menciona de esta
forma.
4. REACTIVOS 4. REACTIVOS Debido a que el método mencionado
Durante el análisis, a menos que se 4.1 Cloroformo, estabilizado, en el documento de referencia se
establezca algo diferente, se utilizan por ejemplo con 2-metil-2-buteno o modificó teniendo como base el
únicamente reactivos con grado etanol. método oficial de la AOAC 991.44
analítico reconocido y agua 4.2 Ácido fosfórico, c (H3PO4) para determinación de ocratoxina A,
destilada o de Grado 1, según la ≈ 0,1 mol/l. de acuerdo con la experiencia y las
norma EN ISO 3696. El solvente 4.3 Tierra de diatomeas validaciones realizadas por el
debe tener calidad adecuada para el Se sumergen aproximadamente 900 laboratorio de toxicología de la
análisis de HPLC. g de tierra de diatomeas lavada en Universidad Nacional, se eliminaron
ácido, por ejemplo Celite 545, de un los reactivos que no son de uso
4.1 Diclorometano día para otro. Se filtra a través de frecuente en Colombia y que con la
4.2 Ácido fosfórico, c (H3PO4) una capa doble de papel en un nueva técnica propuesta por la
≈ 0,1 mol/l. embudo de Buchner , se lava con 8 l Universidad, se obtienen resultados
4.3 Hexano de agua y se seca durante 12 h a reproducibles y repetibles.
4.4 Ácido fórmico 150 °C. Adicionalmente véase la justificación
4.5 Metanol 4.4 Solución de bicarbonato en las observaciones realizadas en
4.6 Tolueno de sodio, p(NaHCO3) Consulta pública.
4.7 Ácido acético glacial, ϕ 4.5 Acetato de etilo
(CH3COOH) ≈ 98 % 4.6 Tolueno
4.8 Acetonitrilo 4.7 Metanol
4.9 Solución de elución: 4.8 Ácido acético glacial, ϕ
diclorometano y ácido fórmico, 99+1 (CH3COOH) ≈ 98 %
(V+V). 4.9 Acetonitrilo
4.10 Fase móvil: se mezclan 4.10 Diclorometano
acetonitrilo, agua y ácido acético glacial 4.11 Solución de elución: acetato
49.5 + 49.5 + 1 (V+V+V) y se de etilo, metanol y ácido glacial acético
desgasifica. 95+5+0,5 (V+V+V).
Continúa
16
(Continuación)
ISO 15141-2:1998
4.11 Mezcla de solvente para 4.12 Fase móvil: se mezclan
disolver la OTA: tolueno y ácido acetonitrilo, agua y ácido acético
acético glacial, 99+1 (V+V). glacial, 99+99+2 (V+V+V) y se
4.12 Trifluoruro de boro desgasifica.
4.13 Trifluoruro de boro en 4.13 Mezcla de solvente:
solución de metanol, p (BF3) = 14 tolueno y ácido glacial acético,
g/100 ml. 99+1 (V+V).
ADVERTENCIA: Se debe usar una 4.14 Trifluoruro de boro
campana de ventilación con buen 4.15 Trifluoruro de boro en
mantenimiento. Evite el contacto solución de metanol, p (BF3) = 14
con la piel, los ojos y el tracto g/ 100 ml.
respiratorio. ADVERTENCIA Se debe usar
4.14 Ocratoxina A, en forma de una campana de ventilación con
cristales o como película en vial. buen mantenimiento. Evite el
4.15 Solución madre de contacto con la piel, los ojos y el
ocratoxina A tracto respiratorio.
4.16 Ocratoxina A, en forma
de cristales o como película en
empollas.
4.17 Solución base de
ocratoxina A.
M x 100 Se modifica la fórmula de acuerdo
ρ OTA = A máx x con la técnica de la AOAC 991.44 y
M x 1000 κ xδ
ρ OTA = Amáx x en donde
la experiencia del laboratorio de
ε toxicología de la Universidad
Nacional con su método validado.
en donde Amáx = es la
absorción determinada en el
Amáx = es la absorción determinada máximo de la curva de absorción
en el máximo de la curva de (aquí: en 333 nm).
absorción (aldededor de 333 nm).
M = es la masa molecular relativa
M = es la masa molecular relativa de ocratoxina A (M = 403 g/mol).
de ocratoxina A (M = 403,8 g/mol).
κ = es el coeficiente de absorción
ε = es el coeficiente de absorción molar relativa de ocratoxina A en
molar relativa de ocratoxina A en la la 2 mezcla de solvente (aquí: 544
mezcla de solvente (en este caso: m /mol).
5,440 l mol-1 cm-1).
δ = es la longitud del trayecto de la
celda de cuarzo en centímetros.
4.17 SOLUCIONES DE 4.19 SOLUCIONES DE Se realiza la corrección de acuerdo
CALIBRACIÓN DE OCRATOXINA A CALIBRACIÓN DE OCRATOXINA con las observaciones recibidas en
A consulta pública de los valores.
Se dispensan alícuotas de 5 μl, 25 Respecto a la jeringa, esta se
μl, 50 μl y 100 μl de la solución Se dispensa 5 μl, 25 μl, 50 μl y 100 reemplaza de la norma por las
estándar en viales separados de 4 μl en porciones de alícuotas de la micropipetas de volumen variable
ml a 5 ml, usando una micropipeta solución estándar en frascos que tienen mayor exactitud en la
apropiada. Se evapora bajo separados de 4 ml a 5 ml, usando toma de alícuotas.
nitrógeno, justo hasta que se seque. jeringas de volumen fijo. Se
Se adiciona 1,0 ml de la fase móvil evapora bajo nitrógeno, justo hasta
a cada frasco para obtener que se seque. Se adiciona 1,0 ml
concentraciones finales de masa de la fase móvil a cada frasco para
de OTA de 0,125 ng/25 μl, 0,625 concentraciones finales de masa
ng/25 μl, 1,25 ng/25 μl, y 2,5 de ocratoxina A de 0,5 ng/25 μl,
ng/25μl. Estas cantidades 1 ng/25 μl, 2,5 ng/25 μl, 5 ng/25
equivalen a una concentración en μl y 10 ng/ 25 μl.
una muestra de 2,5 µg/kg, 12,5
µg/kg, 25,0 µg/kg y 50,0 µg/kg,
respectivamente.
17
(Continuación)
ISO 15141-2:1998
5.14 MICROPIPETAS DE 5.16 JERINGA DE VOLUMEN La jeringa se reemplaza de la norma
VOLUMEN VARIABLE FIJO por las micropipetas de volumen
variable que tienen mayor exactitud
en la toma de alícuotas.
5.12.2 Columna analítica de fase 5.12.2 Columna analítica de fase Se modifica la especificación para la
reversa para HPLC: reversa para HPLC: longitud de la columna analítica por
- longitud: 125 mm - longitud: 250 mm ser ésta la que está disponible en los
- diámetro interno: 4,6 mm - diámetro interno: 4,6 mm laboratorios colombianos sin alterar
- empaquetamiento: - empaquetamiento: material el resultado, aclarando en una nota
material esférico de 5 μm C18 o esférico de 5 μm C18 o equivalente. que puede ser utilizada la de 250
equivalente. mm de longitud.
NOTA También se pueden usar

columnas más largas (por ejemplo
con longitud de 250 mm).
6.3 EXTRACCIÓN DE 6.3 EXTRACCIÓN DE Al modificar el tamaño de la
OCRATOXINA A DE LA MUESTRA OCRATOXINA A DE LA MUESTRA columna, se modifica el tamaño de la
muestra pero conservando la
Se pesa una porción de ensayo de Se pesa una porción de ensayo de proporción para no alterar el
25 g, con una aproximación de 0,1 50 g, con una aproximación de 0,1 resultado.
g, preparada como se indicó en el g, preparada como se indicó en el
numeral 6.2 en un erlenmeyer de numeral 6.2 en un erlenmeyer de
250 ml o en un vaso de licuadora de 250 ml o en un vaso de licuadora de
200 ml; se adicionan 12,5 ml de 200 ml; se adicionan 12,5 ml de
solución de ácido fosfórico 0,1 mol/L solución de ácido fosfórico 0,1 mol/L
(véase el numeral 4.2), se (véase el numeral 4.2), se
homogeniza y se adicionan 125 ml homogeniza y se adicionan 125 ml
de diclorometano. Se mezcla de diclorometano. Se mezcla
durante 3 min a velocidad media durante 3 min a velocidad media
(licuadora) o durante 1 h en agitador (licuadora) o durante 1 h en agitador
mecánico de alta velocidad mecánico de alta velocidad
(erlenmeyer). Se filtra el extracto a (erlenmeyer). Se filtra el extracto a
través de papel de filtro cuantitativo través de papel de filtro cuantitativo
de porosidad media (por ejemplo de porosidad media (por ejemplo
S&S 589/33 o equivalente) y se S&S 589/31 o equivalente) y se
recolectan 5 ml de filtrado en un recolectan 5 ml de filtrado en un
tubo de ensayo. tubo de ensayo.
6.4 PREPARACIÓN DEL 6.4 PARTICIÓN Se realiza la modificación del
CARTUCHO Y CARGA DE LA Se transfieren 50 ml del filtrado a un método con base en el método de la
MUESTRA embudo de separación de 100 ml. AOAC y la técnica validada por la
Acople los cartuchos para OTA Se adicionan 10 ml de solución de Universidad Nacional de Colombia.
(numeral 5.8) a los puertos del bicarbonato de sodio y se agita
múltiple de vacío, el múltiple debe ligeramente. Se permite que se
tener en su interior matraces o separen las fases. Si se forma una
vasos de precipitado cónicos para la emulsión, se centrífuga durante 2
recolección de los solventes de min a 2.000 min. Se recolecta la
condicionamiento y lavado. Se
transfieren los 5 ml de extracto
filtrado al cartucho y se drena por
gravedad a un flujo máximo de 2 ml
por min.
3
18
(Continuación)
ISO 15141-2:1998
Para evitar que la solución drene fase acuosa superior para la
demasiado rápido se recomienda extracción del cartucho.
compactar el material de empaque 6.5 PREPARACIÓN DEL
del cartucho antes de realizar el CARTUCHO
ensayo presionando el material de Acople los cartuchos C18 a los
empaque con el émbolo de un puertos del múltiple de vacío, el
jeringa. En caso de necesitar múltiple debe tener en su interior
acelerar las eluciones, se aplica matraces o vasos de precipitado
succión leve. Este procedimiento cónicos de 25 ml para la
también se puede realizar recolección de los solventes de
manualmente aplicando presión con condicionamiento y lavado. Se lava
una jeringa de 5 ml a 10 ml fija a la cada cartucho dos veces
parte superior del cartucho aproximadamente con 2 ml de
mediante un adaptador apropiado. metanol, 2 ml de agua y 2 ml de
No permita que el cartucho se solución de bicarbonato de sodio.
seque. Se dejan aproximadamente NO PERMITA QUE EL CARTUCHO
2 mm de solvente en la parte FUNCIONE SECO. Para acelerar
superior. las eluciones, se aplica succión leve.
Este procedimiento también se
6.5 LAVADO DEL CARTUCHO puede realizar manualmente
aplicando presión con una jeringa de
Con una pipeta se vierten en el 5 ml a 10 ml fija a la parte superior
cartucho 5 ml de hexano y se dejan del cartucho. Se dejan
aluir por gravedad. No permita que aproximadamente 2 mm de solvente
el cartucho se seque. Se lava en la parte superior del bulbo.
luego con 15 ml de diclorometano 6.6 EXTRACCIÓN DEL
en tres volúmenes sucesivos de 5 CARTUCHO
ml cada uno. Deseche los solventes Con una pipeta se vierten en el
de lavado. cartucho C18 5 ml del extracto de
bicarbonato obtenido, según lo
6.6 ELUCION DE LA OTA establecido en el numeral 6.4. NO
PERMITA QUE EL CARTUCHO
Se eluye la ocratoxina con 20 ml de FUNCIONE SECO. Se lava con 2 ml
solución de elución (numeral 4.9). de solución de ácido fosfórico
Se recolecta el eluato en un tubo de seguido por 2 ml de agua. Deseche
ensayo de 40 ml de fondo cónico. los líquidos de lavado.
Se evapora el solvente bajo Se eluye la ocratoxina con 8 ml de
nitrógeno o mediante calentamiento solución de elución. Se recolecta el
y vacío, justo hasta que se seque. eluato en un tubo de ensayo de 10
Se disuelve inmediatamente en 500 ml que contenga 2 ml de agua. Se
μl (VT) de la fase móvil y se filtra a agita o mezcla el eluato con una
través de un microfiltro de 0,45 μm varilla de vidrio para combinar las
en un vial tapa rosca de 5 ml o en dos fases. Con una pipeta se vierte
un vial para inyector automático (= el extracto de ocratoxina A (fase
solución de muestra de ensayo). superior) en otro tubo de ensayo de
10 ml con tapa rosca. Se enjuaga
En caso de resultar positiva la dos veces la fase superior
muestra de ensayo se debe realizar remanente, en el primer tubo, con 1
la confirmación de identidad ml de acetato de etilo y se adiciona
mediante la formación del metil- a la fase de ocratoxina A en el
éster de la OTA (véase el numeral segundo tubo. Se deja evaporar bajo
6.11). nitrógeno, justo hasta que se seque.
Se disuelve inmediatamente en 500 μl
(VT) de la fase móvil y se filtra a través
de un microfiltro de 0,45 μm hacia un
frasco de tapa rosca de 5 ml (=
solución de muestra de ensayo).
19
(Continuación)
ISO 15141-2:1998
Se reserva la solución de muestra
de ensayo restante para
confirmación de identidad mediante
la formación de éster de metilo
(véase el numeral 6.11).
6.7 CONDICIONES DE 6.7 CONDICIONES DE Se realiza la modificación en la tasa
OPERACIÓN DEL HPLC OPERACIÓN DE LA HPLC de flujo del método con base en el
método de la AOAC y la técnica
Cuando se usó la columna según lo Cuando se usó la columna según lo validada por la Universidad Nacional
establecido en el numeral 5.12.2 y establecido en el numeral 5.14.2 y la de Colombia.
la fase móvil según el numeral 4.11, fase móvil según el numeral 4.12, se
se observó que los siguientes observó que los siguientes
parámetros eran adecuados: parámetros eran adecuados:
Flujo: 0,6 ml/min Tasa de flujo: 1 ml/min

8.1 GENERALIDADES 8.1 GENERALIDADES El anexo A de la norma ISO pasa al
Límite de detección 1 µg/kg En el Anexo A se resumen los Anexo B del documento en estudio.
Límite cuantificación: 3 µg/kg. detalles del ensayo interlaboratorio Véase justificación 1. Alcance. En el
Porcentaje de recuperación de la precisión del método, según numeral B.1 se incluyen los
promedio en harinas de trigo y de ISO 5725: 1986. Los valores resultados obtenidos por la
maíz: 78%. derivados del ensayo interlaboratorio Universidad Nacional de Colombia
Desviación estándar relativa, SR = no se pueden aplicar a los rangos de para la prueba validada en la misma.
2.02. concentración de analito ni a las
Desviación estándar relativa matrices diferentes a las
porcentual, RSDR = 2.60%. presentadas en el Anexo A.
8.2 REPETIBILIDAD 8.2 REPETIBILIDAD Se decide enviar esta información a

La diferencia absoluta entre dos La diferencia absoluta entre dos un anexo por tratarse de datos
resultados de ensayo únicos sobre resultados de ensayo únicos sobre obtenidos por los miembros de la
material de ensayo idéntico,material de ensayo idéntico, ISO respecto a los ensayos
realizado por un operador usando el realizado por un operador usando el interlaboratorios, que sirven como
mismo equipo en el intervalo de mismo equipo en el intervalo de información para aquellos
tiempo más corto viable, excederá tiempo más corto viable, excederá el laboratorios que validen la técnica en
el límite de repetibilidad r en no más límite de repetibilidad r en no más Colombia.
del 5 % de los casos. del 5 % de los casos.
(Ver en documento valores
NOTA En el anexo B (informativo) obtenidos para los ensayos
se incluyen los valores realizados)
mencionados sobre la repetibilidad
de la prueba en los productos 8.3 REPRODUCIBILIDAD
analizados referenciados en el La diferencia absoluta entre dos
documento de referencia de la resultados de ensayo únicos en
presente norma, la ISO 15141-2. material de ensayo idéntico,
reportados por dos laboratorios
8.3 REPRODUCIBILIDAD excederá el límite de
La diferencia absoluta entre dos reproducibilidad R en no más del 5
resultados de ensayo únicos en % de los casos.
material de ensayo idéntico, (Ver en documento valores
reportados por dos laboratorios obtenidos para los ensayos
excederá el límite de realizados)
reproducibilidad R en no más del 5
% de los casos.
NOTA En el anexo B (informativo)

se incluyen los valores
mencionados sobre la
reproducibilidad de la prueba en los
productos analizados referenciados
en el documento de referencia de la
presente norma, la ISO 15141-2.
20
(Continuación)
ISO 15141-2:1998
ANEXO A (Informativo) Anexo A (informativo) Se incluye un método alternativo
METODO ALTERNATIVO POR fuente tomada de estudios
CROMATOGRAFIA EN CAPA realizados y validados por la
DELGADA Universidad Nacional (véase
Véase proyecto DE 149-03 referencia bibliográfica [11] en el
anexo C informativo, Bibliografía),
debido a que no todos los
laboratorios de análisis cuentan con
un HPLC como alternativa para el
análisis de la Ocratoxina A en
alimentos tales como cereales y sus
derivados.
ANEXO B (Informativo) Se incluye el anexo que contiene los
DATOS OBTENIDOS DEL ENSAYO datos obtenidos en los
INTERLABORATORIO PARA LA interlaboratorios que sirven para
ELABORACIÓN DE LA NORMA informar a los usuarios respecto a la
ISO 15141-2:1998 obtención de resultados para
determinar la repetibilidad y
reproducibilidad de la técnica
analítica para determinación de la
ocratoxina A.
21
ANEXO D
(Informativo)
BIBLIOGRAFÍA
[1] ISO 5725:1986 Precision of Test Methods. Determination of Repeatability and

Reproducibility for a Standard Test Meted by Inter. Laboratory Tests.
[2] AOAC INTERNATIONAL Official Methods of Analysis 16th Ed 1995, AOAC

INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, USA, Method 991.44 Ochratoxin A in corn and
barley. Liquid chromatographic method. P. 62 Chapter 49.
[3] AOAC INTERNATIONAL Official Methods of Analysis 16th Ed 1995, AOAC

INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, USA, Method 973.37 Ochratoxins in barley.
Graphic method. P. 56 Chapter 49.
[4] Nordic Committee on Food Analysis (1992) No 143. Ochratoxin A. Liquid

Chromatographic Determination in Barley and Maize.
[5] Nesheim, S., Atack, M:E:, Trucksess, M.W., Eppley, R:M: and Krogh, P.: Rapid Solven-
Efficient Method for Liquid Chromatographic Determination of Ochratoxin A in Corn,
Barley and Kidney: Collaborative Study. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1992, 75, 481-487.
[6] Larsson, K and Möller, T. (1996) LC-Determination of Ochratoxin A in Barley, Wheat-

Bran and Rye with the AOAC/IUPAC/NMKL Method: A NMKL Collaborative Study. J.
Assoc. Off. Anal. Chem. Int., 79, 1996, 1102 - 1106.
[7] Tauchmann, F., Mintzlaff, H.J., Leistner, L.: Schutzmaβnahmen beim Arbeiten mit
Mykotoxinen (Protective Measures for Working with Mycotoxins) Alimenta 1972, 11, 85.
[8] Castegnaro, M., Hunt, D.C., Sansone, E.B., Schuller, P.L., Siriwardana, M.G., Telling,
G.M., van Egmon, H.P. and Walker, E.A.: Laboratory Decontamination and Destruction
of Aflatoxins B1, B2, G1 y G2 in Laboratory Wastes. In: IARC Scientific publication No
37, International Agency for Research on Cancer (WHO), Lyon, France, 1980, 59p.
[9] Castegnaro, M., Barek, J., Freny, J.M., Lafontaine, M., Miraglia, M., Sansone, E.B., and
telling, G.M.: Laboratory Decontaminación and Destruction of Carcinogens in Laboratory
Wastes. In: IARC Scientific Publication No 113, International Agency for Research on
Cancer (WHO), Lyon, France, 1991, 63p.
[10] Van Trijp, J.M.P. and Roos, A.H.:Model for the Calculation of Calibration Curves, RIKILT
Report 91.02, January 1991.
[11] Laboratorio de Toxicología, Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia,

Universidad Nacional de Colombia. Manual de métodos. Método para la determinación
de Ocratoxina A en cereales por cromatografía en capa fina. 2005.
22
DOCUMENTO DE REFERENCIA
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Foodstuffs. Determination of

Ochratoxin A in Cereals and Cereal Products. Part 2: High Performance Liquid
Chromatographic Method with Bicarbonate Clean Up. Geneva: ISO, 1998, 11 p (ISO 15141-2).
23

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NORMA TÉCNICA NTC

E: DETERMINATION OF OCHRATOXIN A IN CEREALS AND

DESCRIPTORES: producto alimenticios - harinas; harina

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)

Prohibida su reproducción Editada 2007-03-28

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo

La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica

La NTC 5472 fue ratificada por el Consejo Directivo del 2006-03-21.

A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a

ACTA-DELTAGEN HARINERA INDUPAN S.A.

Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las

ALIMENTOS COMPLEMENTARIOS COLOMBINA S.A.

1. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN ........................................................................1

2. REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................1

5. EQUIPOS Y MATERIALES ..........................................................................................3

5.1 MOLINO DE LABORATORIO Y TAMIZ ......................................................................3

5.2 MEZCLADOR DE ALTA VELOCIDAD ........................................................................3

5.3 ESPECTRÓFOTOMETRO ...........................................................................................3

5.4 CELDAS DE CUARZO ................................................................................................3

5.6 PAPEL DE FILTRO CUALITATIVO RAPIDO ..............................................................4

5.7 ERLENMEYER DE 250 ml CON TAPA ROSCA O VASOS DE LICUADORA

5.8 CARTUCHO DE ADSORCIÓN.....................................................................................4

5.9 MÚLTIPLE DE VACÍO..................................................................................................4

5.10 TUBOS DE ENSAYO ...................................................................................................4

5.11 FILTRO DE MEMBRANA.............................................................................................4

5.12 APARATO PARA HPLC ..............................................................................................4

5.13 VIALES .........................................................................................................................5

5.14 MICROPIPETAS DE VOLUMEN VARIABLE ..............................................................5

6.1 GENERALIDADES .......................................................................................................5

6.2 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO.......................................................5

6.3 EXTRACCIÓN DE OCRATOXINA A DE LA MUESTRA .............................................5

6.4 PREPARACIÓN DEL CARTUCHO Y CARGA DE LA MUESTRA..............................5

6.5 LAVADO DEL CARTUCHO .........................................................................................5

6.6 ELUCION DE LA OTA..................................................................................................6

6.7 CONDICIONES DE OPERACIÓN DEL HPLC .............................................................6

6.8 CURVA DE CALIBRACIÓN .........................................................................................6

6.9 IDENTIFICACIÓN .........................................................................................................6

8.1 GENERALIDADES .......................................................................................................8

8.3 REPRODUCIBILIDAD ..................................................................................................8

9. INFORME DEL ENSAYO .............................................................................................8

DETERMINACIÓN DE OCRATOXINA A EN CEREALES

El Comité Técnico 50 de productos de molinería elaboró el presente documento técnico,

1. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

Esta norma especifica un método para la determinación cuantitativa de ocratoxina A (OTA) en

El siguientes documento normativo referenciado es indispensable para la aplicación de este

La ocratoxina A (OTA) se extrae con una solución de diclorometano (cloruro de metileno,

4.2 Ácido fosfórico, c (H3PO4) ≈ 0,1 mol/L.

4.4 Ácido fórmico

4.7 Ácido acético glacial, ϕ (CH3COOH) ≈ 98 %.

4.9 Solución de elución: diclorometano y ácido fórmico, 99+1 (V+V).

4.12 Trifluoruro de boro

4.13 Trifluoruro de boro en solución de metanol, ρ (BF3) = 14 g/100 ml.

4.14 Ocratoxina A, en forma de cristales o como película en vial.

4.15 Solución madre de ocratoxina A

Se disuelve 1 mg de ocratoxina A (cristales) o el contenido de un vial (si la ocratoxina A está en

referencia. Se calcula la concentración de masa de ocratoxina A, ρota, en microgramos por

Amáx = es la absorción determinada en el máximo de la curva de absorción en este caso (aldededor de

M = es la masa molecular relativa de ocratoxina A (M = 403,8 g/mol).

κ = es el coeficiente de absorción molar relativa de ocratoxina A en la mezcla de solvente (en este