Investigación de productos naturales

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ISSN: 1478-6419 (impreso) 1478-6427 (en línea) Página de inicio de la revista: https://www.tandfonline.com/loi/gnpl20

Actividades antihelmínticas y antimicrobianas de tres nuevos

depsides y diez conocidos depsides y fenoles del liquen de
Indonesia: Parmelia cetrata
Ach.

Ari Satia Nugraha, Ludmilla Fitri Untari, Annegret Laub, Andrea Porzel, Katrin Franke y
Ludger A. Wessjohann

Para citar este artículo: Ari Satia Nugraha, Ludmilla Fitri Untari, Annegret Laub, Andrea Porzel, Katrin Franke & Ludger A.
Wessjohann (2020): Actividades antihelmínticas y antimicrobianas de tres nuevos depsides y diez conocidos depsides y fenoles de
líquenes indonesios: Parmelia ??? cetrata Ach., Investigación de productos naturales, DOI: 10.1080 / 14786419.2020.1761361

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Publicado online: 06 de mayo de 2020.

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INVESTIGACIÓN DE PRODUCTOS NATURALES

https://doi.org/10.1080/14786419.2020.1761361

Actividades antihelmínticas y antimicrobianas de tres nuevos depsides

y diez conocidos depsides y fenoles del liquen de Indonesia: Parmelia
cetrata Ach.

Ari Satia Nugraha a , B , Ludmilla Fitri Untari C , Annegret Laub B , Andrea Porzel B
, Katrin Franke B y Ludger A. Wessjohann B
a Grupo de Investigación sobre Descubrimiento y Utilización de Medicamentos, Facultad de Farmacia, Universidad de Jember, Jember, Indonesia; B Departamento

de Química Bioorgánica, Instituto Leibniz de Bioquímica Vegetal, Halle / Saale, Alemania; C Facultad de Biología, Universitas Gadjah Mada,

Yogyakarta, Indonesia

RESUMEN HISTORIA DEL ARTÍCULO

Un extenso estudio fitoquímico de un liquen folioso de Indonesia, Parmelia Recibido el 4 de marzo de 2020

cetrata, resultó en el aislamiento exitoso de 13 derivados de fenol y depsida ( 1 - 13) Aceptado el 22 de abril de 2020
incluyendo los depsides previamente no reportados 3 0- hidroxilo-5 0- 2,4-dihidroxil-6-metilbenzoato
de pentilfenilo ( 7), 3 0- hidroxilo-5 0- 2,4-dihidroxil-6-metilbenzoato de propilfenilo ( 8) PALABRAS CLAVE
Liquen; Parmelia cetrata;
y 3 0- hidroxilo-5 0- 2-hidroxil-4-metoxil-6-propilbenzoato de metilfenilo ( 9). Se
antimicrobiano; vermífugo;
evaluó la actividad antiinfecciosa de los compuestos aislados frente a la
depsides; Aliivibrio fischeri;
bacteria gramnegativa. Aliivibrio fischeri y el nematodo Caenorhabditis elegans. Caenorhabditis elegans

2,4-dihidroxil-6-pentilbenzoato ( 5) y ácido lecanórico ( 6) inhibición inducida del crecimiento de A.

fischeri con valores de inhibición del 49% y 100% a una concentración de 100 metro M,
respectivamente. La actividad antibacteriana podría deberse a su grupo carboxilo libre. Un
grupo fenólico en C4 también contribuyó a la actividad antimicrobiana de los depsidos, como
se muestra para los compuestos. 7 y 8, que causó 89% y 96% de inhibición del crecimiento a
100 metro M, respectivamente. Ácido lecanórico ( 6) además posee importantes efectos
antihelmínticos que causan un 80% de mortalidad de C. elegans a los 100 metro g / mL.

1. Introducción

El liquen es una biomasa única compuesta por un hongo en simbiosis con algas, cianobacterias o bacterias no
fotosintéticas que se comportan como especies cosmopolitas en crecimiento.

CONTACTO Ludger A. Wessjohann wessjohann@ipb-halle.de ; Ari Satia Nugraha arisatia@unej.ac.id

Se puede acceder a los datos complementarios de este artículo en https://doi.org/10.1080/14786419.2020.1761361 .

2020 Informa UK Limited, cotizando como Taylor & Francis Group

2 COMO NUGRAHA ET AL.

desde el polo frío seco hasta las regiones tropicales cálidas y húmedas (Brodo et al. 2001 ; Selbmann y col. 2010 ).
Se han reportado más de 100,000 especies de líquenes, de las cuales 17,000 especies crecen en Indonesia (Negi 2003
). Se han aislado más de 1050 metabolitos secundarios de líquenes y se han caracterizado como depsidos,
depsidonas, xantonas y terpenos que poseen actividades antibacterianas, antivirales, antianalgésicas, antipiréticas y
antiproliferativas (Mu
€ ller 2001 ; Molnar y Farkas 2010 ).
La actividad antibacteriana de los líquenes se informó por primera vez en 1944. El estudio de 42 especies de líquenes
indicó que 27 extractos crudos poseen una actividad significativa contra las bacterias grampositivas. Staphylococcus aureus
y Bacillus subtilis ( Burkholder y col. 1944 ; Shrestha y St Clair 2013 ). Mientras tanto, treinta y cuatro especies de líquenes de
América del Norte se examinaron contra las bacterias gramnegativas. Pseudomonas aeruginosa, de las cuales 16 especies
indicaron actividades prometedoras con valores de CIM de <16 metro g / mL (Shrestha et al.

2014 ). La actividad antimicrobiana de metabolitos de líquenes chilenos se evaluó previamente contra

meticilina resistente Estafilococos. La depsida esferoforina más activa poseía un valor de MIC de 8 metro g /
mL (Celenza et al. 2013 ).
El país archipelágico de Indonesia tiene la segunda mayor biodiversidad del mundo y está compuesto por
reinos de especies australianos y asiáticos, que cubren 17.000 islas, desde vegetación costera húmeda hasta
vegetación montañosa templada (Nugraha y Keller 2011 ). La exploración científica de la biodiversidad de
Indonesia está progresando, pero es limitada, incluidos los líquenes de Indonesia. El registro de estudio más
antiguo sobre líquenes indonesios fue publicado por Merrill en 1913 en el que el Sr. Fleischer recolectó
muestras de varios lugares de la isla de Java (Merrill 1913 ). El estudio se limitó a informar con fines botánicos
y taxonómicos. Debido a su baja biomasa, solo unos pocos géneros de líquenes han sido parte de la
medicación tradicional de los pueblos indígenas de Indonesia, incluido el género Usnea. La planta decocada
se prescribía tradicionalmente para tratar diarreas, disentería, úlceras aftosas, distensión e inflamación
abdominales.

Usnea misaminensis posee antiinfeccioso actividad contra

Tuberculosis micobacteriana y Plasmodium falciparum debido al contenido de ácido úsnico y ácido
salazínico (Nugraha, Wangchuk, et al. 2019 ). Nuestro análisis preliminar previo en nueve líquenes foliosos
de Indonesia indicó que los extractos de metanol crudo poseen actividades antimicrobianas y
anticancerígenas con Parmelia cetrata siendo el más eficaz (Nugraha, Pratoko, et al. 2019 ). En la
investigación actual, una evaluación fitoquímica y farmacológica detallada de P. cetrata desde Java. La
potencia antiinfecciosa de los componentes aislados se evaluó basándose en pruebas de actividad
antimicrobiana contra la bacteria modelo gramnegativa. Aliivibrio fischeri

y pruebas de actividad antihelmíntica frente al modelo de helmintos Caenorhabditis elegans.

2. Resultado y debate

2.1. Aislamiento y aclaración de la estructura de los componentes de Parmelia cetrata

Parmelia cetrata Ach. (Figura S26) es un liquen folioso con lóbulos lobulados de color gris claro, irregular, corteza
superior reticuladamente agrietada hasta el margen, margen de rizina con cilios negros, sin soredia e isidia; envés
negro con una estrecha zona marginal marrón, rizines negros densos abajo, médula K þ amarillo. No se
encontraron apotecios en el espécimen estudiado. Parmelia acanthifolia Pers., Parmelia cetrata Ach., Parmelia
herrei
 INVESTIGACIÓN DE PRODUCTOS NATURALES 3

Zahlbr., Parmelia reparata Stirt. Parmotrema cetratum ( Ach.) Hale y Rimelia cetrata
(Ach.) Hale y A. Fletcher se consideran los sinónimos taxonómicos de P. cetrata, a veces también mal escrito
Pharmelia cetrata / citrata. La distribución de especies de P. cetrata es cosmopolita con amplia extensión sobre árboles
de hoja caduca en bosques abiertos. Se puede encontrar en bosques tropicales de tierras bajas a áreas submontanas.
Sin embargo, dado que esta especie nunca ha sido sometida a ningún estudio taxonómico en Indonesia, faltan datos
de distribución de especies en Indonesia. Nuestros estudios preliminares de bioprospección en líquenes de la isla de
Java revelaron la P. cetrata extracto de metanol crudo para poseer actividad contra la bacteria gramnegativa patógena
humana Pseudomonas aeruginosa en el cual 1024 metro La concentración de g / ml produjo una inhibición bacteriana
del 50% (Nugraha, Pratoko, et al. 2019 ).

Aunque el liquen pertenece al grupo de los líquenes foliosos, fue un desafío obtener cantidades razonables para
los estudios de bioactividad y aislamiento. Por lo tanto, las fracciones obtenidas del extracto de metanol crudo se
perfilaron directamente mediante HPLC analítica.
antes de la aplicación de HPLC preparativa. Todas las muestras se limpiaron mediante un C 18
medio de extracción en fase sólida (SPE). Un extenso trabajo cromatográfico dio como resultado la
aislamiento de 13 compuestos ( Figura 1 ) que comprende diez compuestos conocidos, 5-metilresorcinol ( 1) ( Ivanova
y col. 2010 ), 5-propilresorcinol ( 2) ( Schmeda-Hirschmann y col.
2008 ), 2,4-dihidroxi-6-metilbenzoato de metilo ( 3) ( Ango y col. 2016 ), metilo
2-hidroxi-4,6-dimetilbenzoato ( 4) ( Chan y Brownbridge 1980 ), 2,4-dihidroxi-6pentilbenzoato ( 5) ( Lin y col. 2013
), ácido lecanórico ( 6) ( Ivanova y col. 2010 ), 3 0- hidroxi5 0- 2-hidroxi-4-metoxi-6-propilbenzoato de
propilfenilo ( 10), 3 0- hidroxi-5 0- pentilo
2-hidroxi-4-metoxi-6-propilbenzoato de fenilo ( 11), 3 0- hidroxi-5 0- propilfenilo 2-
hidroxi-4-metoxi-6-pentilbenzoato ( 12), 3 0- metoxi-5 0- 2-hidroxi-4-metoxi-6-propilbenzoato de propilfenilo ( 13)
( Elix y Wardlaw 1997 ) y los tres nuevos delegados
7 - 9. Sus estructuras moleculares se establecieron de manera inequívoca sobre la base de análisis de datos
espectroscópicos y espectrométricos y en comparación con los datos de la literatura citada anteriormente. Análisis de
datos espectrales de RMN de los compuestos no descritos anteriormente 7 - 9 se resumen en la Tabla S24. A nuestro leal
saber y entender, estos depsides se informan por primera vez ( Figura 1 ).

Aunque son naturalmente raros, los alquil resorcinoles 1 - 5 forman parte de los lípidos fenólicos que están bien
distribuidos en plantas vasculares, musgos, hongos y hongos. Las plantas usan los orcinoles para protegerse contra
hongos y bacterias hostiles (Vagel y Roo 2004 ). Las estructuras moleculares de 6 - 13 representan depsidos que son
metabolitos secundarios típicos, producidos por líquenes especialmente de la familia Parmeliaceae (Gianini et al. 2008 ).
Compuesto 7 fue aislado de la norte- fracción de hexano en forma de un sólido amorfo de color marrón pálido con
actividad absorbente de UV. El espectro IR indica bandas vibratorias a 3336 y 1587 cm. 1, asignados a los tramos de
hidroxilo y éster de carbonilo, respectivamente. los

fórmula molecular C 19 H 22 O 5 de compuesto 7 fue confirmado por HRESIMS con un pico de [MH] asignado en m / z 329.1391.
Los datos de RMN (Tabla S24) están de acuerdo con
una característica depside de los líquenes. Un pico agudo en D 11,34 ppm en el 1 El espectro de H-NMR es evidente
para un enlace de hidrógeno fenol-carbonilo típico de orto- benzoatos de hidroxilo. Dos protones de doblete ( J ¼ 2,4 Hz)
en D 6.30 y 6.38 ppm representan meta
protones acoplados de H3 y H5. Estos dos protones exhiben una correlación de largo alcance con un grupo
carbonilo en D 171,0 ppm (C ¼ O) basado en análisis espectral gHMBC
4 COMO NUGRAHA ET AL.

Figura 1. Fenoles ( 1 - 5) y depsides 6 - 13) aislado del liquen folioso Parmelia cetrata.

(Figura S5). Una señal singlete en D 2.60 ppm indica un grupo metilo aromático que se correlaciona con el grupo
carbonilo en D 171,0 ppm. 1 Los espectros de H-NMR y gCOSY muestran tres dobletes de picos de doblete ( J ¼ 2.0,
2.0) en D 6,60 (H2 0), 6,63 (H6 0), 6,66 (H4 0),
indicando claramente un benceno 1,3,5-trisustituido. Es más, 1 Los espectros de H-NMR y gTOCSY mostraron un
sistema de pico de protones en D 0,90 (dd, J ¼ 7.2, 7.2, 3H, H, H11 0), 1,35 (m, 4H, H10 0 y H9 0), 1,63 (2H, H8 0) y 2,58
ppm (dd, J ¼ 7.8, 7.8Hz, 2H, H7 0) evidente
para una cadena alifática (-C 5 H 11). El análisis de gHMBC demostró la unión de este alquilo a C5 0. Las correlaciones de
HMBC se resumen en la Figura S27. En general, estos análisis sugieren
gest para compuesto 7 la estructura depside de 3 0- hidroxilo-5 0- 2,4-dihidroxil-6-metilbenzoato de
pentilfenilo.
Compuesto 8 fue aislado de la norte- fracción de hexano como un sólido amorfo de color marrón pálido con actividad
absorbente de UV. El espectro de IR indicó similitud con el compuesto 7
con hidroxilo (3345 cm 1) y estiramientos de carbonilo (1656 cm 1). La formula molecular
C 17 H 18 O 5 de compuesto 7 fue confirmado por HRESIMS con un pico de [MH] asignado en m / z 301.1079. los 1 Los
espectros de H-NMR y gHSQC mostraron un patrón similar como
libra 7 con una clara diferencia. En compuesto 8 una cadena alifática más corta, un grupo propilo, se une a C6 0. Compuesto
8 fue identificado como 3 0- hidroxilo-5 0- propilfenilo
2,4-dihidroxil-6-metilbenzoato.
Compuesto 9 se aisló como un sólido amorfo marrón, activo frente a UV. El espectro IR indicado
nuevamente se extiende a 3307 y 1615 cm 1, asignado a hidroxilo y car-
bonyl se estira, respectivamente. La fórmula molecular C 18 H 20 O 5 se dedujo de su pico [MH] en m / z 315.1237
en HRESIMS. los 1 Espectros de H-NMR y gHSQC indicados
similitudes con los compuestos 7 y 8, sin embargo, los sustituyentes en la posición 6 0 y 2 se intercambian. La cadena
alifática unida a C6 0 es reemplazado por un grupo metilo en 9,
y un grupo propilo está unido a C2 en lugar del grupo metilo en 7 y 8. Además, otra señal de protones
distinta en D 3,86 ppm sugiere la presencia de un grupo metoxilo. Las correlaciones de largo alcance de
estos protones a C4 indican la ubicación del grupo metoxilo en la posición C4. Compuesto 9 fue
identificado como 3 0- hidroxilo5 0- 2-hidroxil-4-metoxil-6-propilbenzoato de metilfenilo.
 INVESTIGACIÓN DE PRODUCTOS NATURALES 5

2.2. Actividades antimicrobianas y antihelmínticas de los compuestos 1 - 13

Para evaluar las propiedades antiinfecciosas, los compuestos aislados se probaron contra la bacteria
gramnegativa. A. fischeri y contra los helmintos C. elegans. Ambos son organismos de ensayo modelo no
patógenos que se pueden utilizar para el cribado inicial de compuestos antibacterianos o antihelmínticos.

Las actividades antimicrobianas relativas de resorcinoles y depsides contra A. fischeri se muestran en la Figura S28 y
se resumen en la Tabla S25. Ácido lecanórico ( 6) posee la mayor actividad antibacteriana, previniendo completamente el
crecimiento de A. fischeri a una concentración de 100 metro M (Figura S27). Se acepta comúnmente que los grupos de
ácido benzoico libres son responsables de la actividad antimicrobiana, como también se muestra para el compuesto. 5

(Cho et al. 1998 ). Esterificación de este grupo, presente en compuestos. 3 y 4, relegan significativamente la actividad
antimicrobiana. Además, la ausencia de un grupo ácido libre disminuyó la actividad antimicrobiana como se muestra
para los compuestos. 1, 2, 7 - 13. Sin embargo, la aparición de un grupo fenólico en C4 elevó significativamente la
actividad antibacteriana contra el organismo de prueba gramnegativo como se observa en los compuestos. 7 y 8 con
tasas de inhibición superiores al 80%. Comparando los dos, el compuesto más lipofílico 7 va mejor. En general, la
combinación de descriptores antimicrobianos típicos de depsides, un grupo de ácido carboxílico libre junto con un
grupo fenólico en C4, existe en el ácido lecanórico ( 6).

En el bioensayo antihelmíntico, el ácido lecanórico ( 6) poseía la mayor actividad entre los derivados de
despside, aunque es un 20% menor que la respuesta máxima del control positivo (ivermectina) (Figura S28).
Los depsides restantes se consideraron inactivos y provocaron una mortalidad de helmintos inferior al 50%.

Ácido lecanórico ( 6) Anteriormente se informó que era activo contra varias bacterias y hongos
patógenos, incluidos Bacillus mycoides, Bacillus subtilis, Enterobacter cloaceae, Eschericia coli,
Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Botrytis
cinerea, Candida albicans, Fusarium oxysporum, Penicii mucensillium varcensporum, Penicii mucedoillus y

Trichoderma harsianum con valores de MIC entre 0,062 y 0,125 metro g / mL (Hew y Gam 2010 ). Estudios
farmacológicos anteriores revelaron compuestos 3 para inhibir el crecimiento bacteriano y fúngico de Providencia
stuartii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Escherichia
coli y Candida albicans con valores MIC considerablemente más altos de 256, 512, 256, 128, 256, 512, 256 y 512 metro
g / mL, respectivamente (Ango et al. 2016 ). También hubo estudios farmacológicos previos sobre los conocidos
depsidos y didepsidos descarboxilados. 10 - 13 ( Elix y Wardlaw 1997 ).

3. Experimental

3.1. Procedimientos experimentales generales

UV - Los espectros visibles de muestras diluidas en MeOH se obtuvieron usando un espectrofotómetro Jasco V-560 UV /
Vis. Los espectros de IR se registraron con un espectrómetro Thermo Nicolet 5700 FT-IR. Los espectros de RMN 1D (1H,
13C) y 2D (gCOSY, TOCSY, ROESY, gHSQC, gHMBC) se registraron en un sistema Agilent VNMRS 600. los 1 Mano 13 Los
espectros de RMN C se midieron a 600 MHz y 150 MHz, respectivamente. Se hizo referencia a los cambios químicos

al TMS interno ( D H 0, 1 H) o señales de disolvente (CD 3) 2 CO ( D C 29,8, 13 C) o CD 3 OD ( D C

6 COMO NUGRAHA ET AL.

49,0, 13 C). El tiempo de mezcla para los experimentos TOCSY y ROESY se estableció en 0,4 s. Los espectros de masas
ESI de alta resolución de iones negativos se obtuvieron de un espectrómetro de masas Orbitrap Elite (Thermo Fisher
Scientific, Alemania) equipado con una fuente de iones de electropulverización HESI. Los datos fueron evaluados por el
software Xcalibur 2.7 SP1. La HPLC analítica se realizó en un sistema Shimadzu HPLC Prominence (unidad de
desgasificación DGU-20ASR, bomba LC-20AT, muestreador automático SIL-20AHT, detector de matriz de diodos
SPD-M20A, módulo de bus de comunicaciones CBM-20A, controlado por Shimadzu LabSolution

software) con un Symmetry C 18 columna (5 l m, 4,9 150 mm). La HPLC preparativa se realizó en un
sistema Knauer prep-LC (bomba WellChrom K-1001, WellChrom UV
detector K-250-1, cámara de mezcla Knauer dynamix, inyector Rheodyne 7725i, controlado por software
EuroChrom 2000 V3.05) con un YMC J ' columna esfera M-80 (4 l m, 10250 mm). La absorbancia para los ensayos
antimicrobianos se midió en un lector de microplacas Spark Tecan. Caenorhabditis elegans Se observó morbilidad
con un microscopio Olympus BX41 (Modelo BX41TF) con un aumento de 40 veces. Todos los disolventes eran de
calidad HPLC comprados a Merck. El estándar de ivermectina y la solución de penicilina-estreptomicina se
obtuvieron de Sigma-Aldrich

3.2. Material de liquen

La muestra de líquenes se tomó de Sukosari, Bondowoso Regency, Indonesia (N-

7.969496, E114.025594) a 1500 metros sobre el nivel del mar. Se recolectó biomasa fresca de líquenes (240
g) de tres Caoba Swietenia Árboles en la misma ubicación. La especie se determinó como Parmelia cetrata Ach.
por Ludmilla Fitri Untari, liquenóloga del Laboratorio de Botánica, Facultad de Biología, Universitas Gadjah
Mada, Indonesia, donde la muestra del comprobante se deposita con el código LCB01. Parmelia cetrata Ach.
actualmente se considera sinónimo de Rimelia cetrata ( Arch.) Hale & Fletcher y

Parmotrema cetratum ( Ach.) Hale.

3.3. Extracción y aislamiento

La biomasa de líquenes se limpió, se secó y se trituró con ayuda de nitrógeno líquido. Se cargó liquen en
polvo (150 g) en un matraz Erlenmeyer (500 ml), se empapó con metanol (400 ml) y se agitó durante 24 h.
El sobrenadante se recogió y se secó al vacío para producir el extracto de metanol crudo (9,9 g). Una
porción de extracto crudo (2,5 g) se redisolvió en metanol: agua (1: 9; 100 ml) y se extrajo
secuencialmente con
norte- hexano (15 100 ml) y acetato de etilo (15 100 ml) seguido de secado al vacío para producir el norte- fracción de
hexano (100 mg) y fracción de acetato de etilo (1,99 mg).
El seco norte- La fracción de hexano (100 mg) se cargó en un Isolute TM Columna SPE (C 18,
5 g, 20 ml) conectado con un 0.45 metro m Filtro de muestra de HPLC. La solución fue entonces
desplegado en una HPLC semipreparativa con un gradiente de 2% a 50% de disolvente B en 2 min, 50% a 55%
de disolvente B en 18 min, 55% a 100% de disolvente B en 10 min (disolvente A: agua; disolvente B:
acetonitrilo , caudal 3 ml / min). Los compuestos 5-propilresorcinol ( 2, 1,7 mg), 2,4-dihidroxil-6-metilbenzoato de
metilo ( 3, 5,0 mg), 2-hidroxil-4,6dimetilbenzoato de metilo ( 4, 3,2 mg), 2,4-dihidroxil-6-pentilbenzoato ( 5, 5,4
mg), 3 0- hidroxilo5 0- 2-hidroxil-4-metoxil-6-propilbenzoato de metilfenilo ( 9, 5,2 mg), 3 0- hidroxilo-5 0-
 INVESTIGACIÓN DE PRODUCTOS NATURALES 7

2-hidroxil-4-metoxil-6-propilbenzoato de propilfenilo ( 10, 3,4 mg), 3 0- hidroxilo-5 0- 2-hidroxil-4-metoxil-6-propilbenzoato

de pentilfenilo ( 11, 1,0 mg), 3 0- metoxil-5 0- propilo
2-hidroxil-4-metoxil-6-propilbenzoato de fenilo ( 13, 1,0 mg), se recogieron a t R 7,7,
8.5, 9.3, 12.4, 14.3, 20.1, 26.6 y 28.4min, respectivamente.
Parte de la fracción de acetato de etilo (500 mg) se cargó en un Isolute TM Columna SPE
(C 18, 5 g, 20 ml) y posteriormente se eluyó con metanol al 50% en agua (10 ml), metanol al 75% en agua (20 ml),
metanol al 100% (20 ml) para producir las fracciones A (48 mg), B
(90 mg) y C (204 mg). La fracción A se inyectó en una HPLC semipreparativa con un gradiente del 2% al 10% de
disolvente B en 2 min, del 10% al 80% de disolvente B en 18 min, del 80% al 100% de disolvente B en 1 min
(disolvente A: agua; disolvente B : acetonitrilo) para recoger los compuestos 5-metilresorcinol ( 1, 2,7 mg),
5-propilresorcinol ( 2, 5,2 mg), metil 2,4-dihidro
droxil-6-metilbenzoato ( 3, 3,2 mg) y ácido lecanórico ( 6, 2,2 mg) en t R 10,9, 14,2, 15,7 y 16,4 min, respectivamente. La
fracción B se separó mediante HPLC semipreparativa utilizando un
gradiente de 2% a 30% de disolvente B en 2 min, 30% a 50% de disolvente B en 20 min (disolvente A: agua;
disolvente B: acetonitrilo) para aislar 2,4-dihidroxil-6-metilbenzoato de metilo ( 3,
4,3 mg), ácido lecanórico ( 6, 26,3 mg), 2,4-dihidroxil-6-pentilbenzoato ( 5, 6,2 mg) y 3 0-
hidroxilo-5 0- 2-hidroxil-4-metoxi-6-metilbenzoato de propilfenilo ( 8, 4,9 mg) en t R
11,4, 15,4, 16,3, 23,5 min, respectivamente. La fracción C se inyectó en un semipreparativo
HPLC con un gradiente de 2% a 50% de disolvente B en 2 min, 50% a 100% de disolvente B en 16 min
(disolvente A: agua; disolvente B: acetonitrilo, caudal 3 ml / min) para producir ácido lecanórico ( 6, 18,3 mg), 3 0-
hidroxilo-5 0- 2-hidroxil-4-metoxil-6-propilbenzoato de propilfenilo ( 10, 6,2 mg), 3 0- hidroxilo-5 0- 2-hidroxil-4-metoxil-6-propilbenzoa
de pentilfenilo
( 11, 7,9 mg), 3 0- metoxil-5 0- propilfenilo 2-hidroxil-4-metoxil-6-
propilbenzoato 13, 2,6 mg), 3 0- hidroxi-5 0- propilfenil 2-hidroxil-4-metoxil-6-pen-
tilbenzoato 12, 1,4 mg), en t R 8.5, 13.5, 15.9, 17.6 y 18.4min, respectivamente. Una fracción
recogido en t R 11 - Se purificaron 13 min mediante HPLC semipreparativa adicional usando desarrollo de gradiente de
2% a 20% de disolvente B en 2 min, 20% a 100% de disolvente B en
20 min (disolvente A: agua; disolvente B: acetonitrilo) para obtener 3 0- hidroxilo-5 0- 2-hidroxil-4-metoxil-6-metilbenzoato
de pentilfenilo ( 7, 0,7 mg) y 3 0- hidroxilo-5 0- metilfenilo
2-hidroxil-4-metoxil-6-propilbenzoato ( 9, 1,4 mg) en t R 17,5, 17,8 min, respectivamente.

3.3.1. 3 0- Hidroxilo-5 0- 2,4-dihidroxil-6-metilbenzoato de pentilfenilo (7)

Sólido amorfo marrón con actividad UV (0,7 mg, 0,01 mg g 1 peso seco); k max 216 (23,386) 269 (11,613); IR [cm 1]: 3336
(m), 2927 (m) 1587 (s), 1251 (s), 1133 (s); Para 1 H-NMR
((DISCOS COMPACTOS 3) 2 CO, 600MHz) y 13 C-NMR ((CD 3) 2 CO, 150MHz) datos espectroscópicos ver Tabla

S24; ESIMS, m / z 329 [MH]. HRESIMS: calculado para C 19 H 21 O 5 [ MH]: 329,1394, encontrado 329,1391.

3.3.2. 3 0- Hidroxilo-5 0- propilfenil 2,4-dihidroxil-6-metilbenzoato (8)

Sólido amorfo marrón pálido con actividad UV (4,9 mg, 0,11 mg g 1 peso seco); k max 212 (18.177) 269 (8.819) 301
(3.708); IR [cm 1]: 3345 (m), 2957 (m), 1656 (s), 1615 (s) 1246 (s), 1156
(s); Para 1 H-NMR ((CD 3) 2 CO, 600MHz) y 13 C-NMR ((CD 3) 2 CO, 150MHz) espectroscópico
ver los datos en la Tabla S24; ESIMS, m / z 301 [MH]. HRESIMS: calculado para C 17 H 17 O 5
[MH]: 301,1081, encontrado 301,1079.
8 COMO NUGRAHA ET AL.

3.3.3. 3 0- Hidroxilo-5 0- 2-hidroxil-4-metoxil-6-propilbenzoato de metilfenilo (9)

Un sólido amorfo marrón con actividad UV (1,4 mg, 0,03 mg g 1 peso seco); k max 217 (18.502) 245 (6.242) 268
(8.607) 304 (3.557); IR [cm 1]: 3307 (m), 2931 (m), 1615 (s), 1248 (s),
1156 (s), 1019 (s); Para 1 H-NMR ((CD 3) 2 CO, 600MHz) y 13 C-NMR ((CD 3) 2 CO, 150MHz) datos espectroscópicos
ver Tabla S24; ESIMS, m / z 315 [MH]. HRESIMS: calculado para
C 18 H 19 O 5 [ MH]: 315,1238, encontrado 315,1237.

3.4. Ensayo antimicrobiano

Compuestos 1 - 13 ( 100 l M) se probaron contra la bacteria gramnegativa Aliivibrio fischeri con cloranfenicol (100 metro
M) utilizado como control positivo. Debido a la estructura especial de la envoltura celular de las bacterias
gramnegativas, la alta concentración de prueba comparativa de 100 metro Se aplicó M. La prueba de bioactividad se
realizó utilizando el A. fischerii
cepa DSM507 (lote nº 1209). El stock bacteriano se cultivó en medio BOSS (25 ml) a 100 rpm y 23ºC durante 18 h.
Fue necesaria la dilución con medio BOSS nuevo para obtener un número de células adecuado en función del valor
de luminiscencia ( - 50.000 RLU (unidades de luminiscencia relativa)). El ensayo se realizó en placas negras de 96
pocillos de fondo plano (CellGrade TM premium, STERILE R) y consistía en una solución bacteriana (100 metro L) y
solución de prueba (100 metro L) con una concentración final de DMSO del 1% en medio BOSS. Las placas de
pocillos se incubaron en ausencia de luz a 23ºC y 100% de humedad sin tapa y sin agitar durante 24 h. La
luminiscencia se registró utilizando un lector de microplacas TecanSpark. Se detectó todo el rango de longitud de
onda durante 1000 ms sin agitación preliminar para evitar efectos secundarios del oxígeno. El porcentaje de
inhibición se calculó como un valor relativo en comparación con el control negativo (crecimiento bacteriano, DMSO al
1%, sin compuesto de prueba). Los resultados se obtuvieron como un promedio de seis pocillos replicados
distribuidos en dos placas de pocillos. Los valores negativos representan una elevación de la luminiscena que indica
un aumento del crecimiento bacteriano.

3.5. Ensayo antihelmíntico

La cepa de tipo salvaje Bristol N2 de Caenorhabditis elegans se obtuvo del Caenorabditis Genetic Center,
Universidad de Minnesota, Minneapolis, EE. UU.
Procedimientos generales para preparar gusanos y la fuente de alimento. E. coli OP50 se basaron en un protocolo
estándar (Stiernagle 2006 ). El ensayo se realiza en 384 placas de microtitulación contando gusanos vivos y muertos en
cada pocillo después de 30 min de incubación como describieron previamente Thomsen et al. ( 2012 ). Compuestos 1 - 13 fueron
probados en la concentración de 100 metro g / mL. El disolvente DMSO (2%) y el antihelmíntico estándar ivermectina (10 metro
g / mL) se utilizaron como control negativo y positivo, respectivamente. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Los
resultados se expresan como porcentaje de gusanos muertos ± DE.

4. Conclusión

El liquen folioso Parmelia cetrata de Indonesia produjo depsides típicos como metabolitos secundarios. Un
protocolo de aislamiento de HPLC preparativa permitió obtener trece derivados depsidos ( 1 - 13) incluyendo
tres nuevos compuestos ( 7 - 9). Farmacológico
 INVESTIGACIÓN DE PRODUCTOS NATURALES 9

los estudios indican compuestos 6 poseer la mayor actividad antimicrobiana contra la bacteria gramnegativa Aliivibrio
fischeri con un valor de inhibición del 100% a una concentración de 100 metro M. A la misma concentración, este
compuesto también indujo> 80% de mortalidad de Caenorhabditis elegans en un ensayo antihelmíntico. Las
actividades observadas pueden deberse a su grupo carboxilato libre, que no se encuentra en los otros fenoles. Los
nuevos compuestos 7 y 8 que tienen un grupo fenólico libre en C4 causaron 89.0% y 95.5% de inhibición del
crecimiento bacteriano a 100 metro M, respectivamente. En resumen, el liquen P. cetrata

puede considerarse como una fuente valiosa de productos naturales antiinfecciosos.

Agradecimientos

ASN agradece al Sr. Aang Yudianto por ayudar en el viaje de campo para recolectar el liquen en la región de gran altitud de
Klocing-Bondowoso Indonesia. ASN también agradece a la Universidad de Jember y al Instituto Leibniz de Bioquímica Vegetal,
Halle (Alemania), por el apoyo a la investigación. Además, los autores agradecen la asistencia técnica de Gudrun Hahn (NMR),
Anke Dettmer (bioensayos) y Anja Ehrlich (HPLC).

Declaración de divulgación

Los autores no informaron ningún conflicto de intereses potencial.

Fondos
El trabajo fue apoyado financieramente por BMBF (16GW0123) y DAAD (57243965) dentro del programa ' Biodiversidad y
salud '.

ORCID

Ari Satia Nugraha http://orcid.org/0000-0002-9117-4713

Andrea Porzel http://orcid.org/0000-0002-8148-6895

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