Fluorescencia

Biología celular 2017

Dra. Melisa Monteleone
¿Para qué sirve?

Visualizar partes de la célula:

membrana plasmática, núcleo,
vacuolas, retículo endoplásmico, etc.

Estudiar procesos celulares: división

celular, muerte celular, cambios en el
potencial de membrana, endocitosis y
exocitosis.

Localizar moléculas específicas:

proteínas, lípidos, etc

Diferenciar partículas muy pequeñas

que por contraste de fases no se
resolverían.

Estudiar la interacción entre

moléculas in vivo
¿Qué es?
Es un proceso de interacción entre la radiación y la materia en el
cual un material absorbe radiación de una fuente específica y
muy rápidamente emite luz cuya energía es menor (de mayor
longitud de onda) que la de la radiación que ha absorbido

Fuentes:
Excitación por absorción de fotones: fotoluminiscencia
Excitación por una reacción química: quimio-luminiscencia
Excitación por un ser vivo: bioluminiscencia
Diagrama de Jablonski
1) La absorción de la luz de excitación eleva
la molécula del fluorocromo a un estado de
2
excitación con un mayor contenido de S1
energía, S1
S1’
2) En este estado de excitación se
mantienen un tiempo determinado, en el
cual la molécula sufre cambios 1
conformacionales e interacciona con las
moléculas de su entorno.
Como consecuencia, parte de la energía del
estado S1 se disipa, creándose un estado 3
S1’ de menor energía S0

3) Pasado este tiempo de excitación la

molécula emite luz de menor energía
volviendo a su estado fundamental, S0
 Fluorescencia
Ambos procesos
Fotoluminiscencia emiten luz
Fosforescencia

La diferencia entre ambos fenómenos es la capacidad de almacenar la energía.

La fluorescencia absorbe la energía

excitación e inmediatamente emite la
radiación luminosa (singuete excitado)

La fosforescencia, comienza igual,

absorbiendo energía de excitación, pero
la almacena, retardando la emisión,
siendo capaz de emitir esa radiación
luminosa poco a poco durante minutos u
horas después de haber cesado la fuente
de radiación excitadora inicial (triplete
excitado).
¿Por qué algunos materiales fluorescen?

Los materiales que fluorescen lo

hacen porque contienen estructuras
con configuraciones moleculares
particulares conocidas como
fluoróforos o fluorocromos.

Un fluorocromo es una molécula

capaz de absorber fotones y emitir
fotones de menor energía (mayor
longitud de onda). Un fluoróforo es
la parte del fluorocromo
responsable de la emisión de la
fluorescencia.
 Tipos de fluoróforos

1-Moléculas orgánicas: Los fluoróforos

Alexa Fluor (derivados de la rodamina)
han sido utilizados como marcadores de
biomoléculas. La fotoestabilidad es una
de las principales características de este
tipo de colorantes, además barren todo el
espectro.

2-Puntos cuánticos: son nanocristales (2-50

nm) semiconductores que al ser
iluminados, re-emiten luz en una longitud
de onda muy específica y que depende del
tamaño de este. Cuanto más pequeños
sean los puntos, menor es la longitud de
onda y más acotadas las propiedades
cuánticas de la luz que emiten. Por ello la
luz emitida vira del azul al rojo a medida
que el tamaño del punto se incrementa.
3-Proteicos: GFP posee un barril beta formado
por 11 cadenas e incluye una hélice alfa central
que atraviesa el barril en toda su longitud. En
esta hélice hay tres aminoácidos consecutivos
que forman un cromóforo natural, de forma que
cuando la GFP es iluminada con luz ultravioleta,
produce una brillante fluorescencia verde.

Mutaciones en residuos clave

permitieron obtener variantes
de la GFP (espectro de colores
y estabilidad).
Características
Espectros de excitación y emisión
Debido a la diferente configuración electrónica de los fluorocromos cada uno
presenta un espectro de excitación y de emisión característico y único.
Los fabricantes dan el pico de máxima excitación y el pico de máxima emisión o
bien los espectros de excitación y emisión.
 ¿Cómo se obtienen estos espectros?
Fluorímetro

La presencia de 2 monocromadores permiten el registro de dos tipos

de espectros: el espectro de absorción y el espectro de emisión
Espectro de excitación: Muestra la diferente intensidad de
fluorescencia observada en función de la longitud de onda de
excitación, a una longitud de onda de emisión fija

Variación de la IF al variar la λex a

Espectro de una λem constante
excitación
Eficacia de las diferentes λex para
producir fluorescencia
Espectro de emisión: Muestra la intensidad de la emisión fluorescente en
función de la longitud de onda de emisión, con una longitud de onda de
excitación fija (máxima).

Variación de la IF al variar la λem a

Espectro de una λex constante
emisión
Intensidad de la radiación emitida
a las diferentes λ
Espectro de Espectro de
excitación emisión
Características de los espectros

1- La intensidad de fluorescencia
emitida varía con la longitud (λ)
de excitación. La excitación a la
λmax (A), produce la fluorescencia
más intensa (A).

2- El perfil o aspecto del

espectro de emisión no depende
de la l de excitación.

3- El espectro de emisión es la
imagen especular del espectro
de absorción.

4- Los espectros se encuentran

desplazados
Puntos 1 y 2: Regla de Kasha

La emisión siempre
proviene del S1 con una
intensidad proporcional al
número de fotones
absorbidos.

Esto ocurre por la rápida

conversión interna que
precede a la emisión
Punto 3: La regla del espejo

El espectro de absorción muestra los niveles vibracionales del

estado excitado y el espectro de emisión los niveles vibracionales
del estado basal, los cuales en la mayoría de los fluorocromos son
similares (ocurren las mismas transiciones electrónicas)
Punto 4: Corrimiento de Stokes

Cuando los electrones pasan del estado excitado al estado basal existe una
pérdida de energía vibracional. Como consecuencia, el espectro de emisión es
desplazado hacia longitudes de onda mayores respecto al espectro de
excitación. A este desplazamiento se lo denomina corrimiento de Stokes.

La distancia entre los picos de excitación y

emisión de un fluoróforo depende de su
estructura electrónica.

Es fundamental para la sensibilidad dado

que permite que los fotones de emisión
sean detectados contra un fondo bajo,
aislado de los fotones de excitación
http://www.mcb.arizona.edu/IPC/spectra_page.htm

http://www.lifetechnologies.com/ar/es/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html
Tipos de fluorescencia.

La fluorescencia primaria (fluoróforos

intrínsecos) es la que se da porque existe una
configuración inherente a la estructura
molecular. Ejemplo: clorofila, GFP

La fluorescencia secundaria (fluoróforos Aequorea victoria

extrínsecos) ocurre cuando una molécula
específica o un grupo capaz de fluorescer, un
fluorocromo, se introduce en la estructura de
la muestra. Ejemplo: sondas catiónicas
planares como BrEt o DAPI que se agregan a
los ácidos nucléicos
DAPI intercalado
Éste es el procedimiento para la mayoría de las en una molécula
de ADN
aplicaciones biológicas de la microscopía de
fluorescencia.
Los fluoróforos extrínsecos pueden ser, a través de vectores de expresión,
introducidos en bacterias, células u organismos para dirigir la expresión tanto de
las proteínas fluorescentes solas como fusionadas a otra proteína de interés en el
contexto del proceso biológico en estudio.
Factores que afectan la fluorescencia
1) Photobleaching: Descomposición irreversible de las moléculas de los
fluorocromos.
Está directamente relacionado con la intensidad de la excitación y con el tiempo
durante el cual estamos excitando la muestra.
Se usan detectores altamente sensibles, objetivos y filtros ópticos optimizados.

Comercialmente se han desarrollado productos

con menor labilidad ante la estimulación
lumínica (por ejemplo los fluoróforos Alexa).
También se desarrollaron sustancias “antifade”
que reducen el bleaching (Slow Fade, Vecta
Shield, etc). Sin embargo estas sustancias no se
pueden utilizar en células vivas

2) Quenching: Disminución de la intensidad de la emisión debida a condiciones

de temperatura o presión elevada, agentes oxidantes y algunas sales. También
puede ser debida a interacciones entre moléculas de fluorocromo, por lo que
aumentar la concentración de éste no siempre supone un aumento de
fluorescencia.
Se debe trabajar con agentes secuestradores de oxígeno.
Problemas al utilizar dos (o más) fluoróforos

Cuando se solapan los espectros de emisión. Ejemplo GFP/Alexa 488

NO SE PUEDEN USAR JUNTOS

SE PUEDEN USAR JUNTOS
Problemas al utilizar dos (o más) fluoróforos

Cuando la emisión de un fluoróforo es capaz de excitar un segundo fluoróforo y

es esta fluorescencia la que es detectada.
Usos de estos “problemas” como herramientas en
la investigación
FRET

Nature

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/spectralimaging/fretbiosensors/indexflash.html
FRAP y FLIP

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) se decolora un área específica

por altos pulsos de láser de intensidad. Posteriormente la cinética de recuperación de
fluorescencia es registrada por imágenes de muestreo en intervalos de tiempo
regulares con la iluminación de intensidad baja. Uso: Difusión y movilidad de
macromoléculas.

Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) una célula fluorescente es decolorada

por el láser sostenidamente en una única región mientras se registra la célula
completa. Cualquier región en contacto con el área afectada será gradualmente
decolorada por los movimientos laterales de las proteínas. En regiones sin conexión
la fluorescencia permanecerá intacta. Uso: evaluar continuidad entre áreas,
movimiento de proteínas