TECNICA HISTOLOGICA

Corresponde al conjunto de procedimientos aplicados a un material biológico con la finalidad de prepáralo y

conferirle las condiciones óptimas para poder observar, examinar y analizar sus componentes morfológicos a
través de un microscopio.

PREPARACION DEL TEJIDO

1. FIJACION

El proceso de fijación es aquel en el que se busca conservar la citohistoarquitectura del tejido.

Se obtiene mediante una sustancia química o una mezcla de ellas. Se utiliza para:

 Abolir el metabolismo celular. METODO DE FIJACION

 Evitar la autolisis: impedir la degradación enzimática de las células y tejidos.
 Destruir microorganismos patógenos INMERSION: la muestra
 Permite conservar la estructura del tejido para tratamientos posteriores extraída inmediatamente se
 Endurecer el tejido como resultado de la formación de enlaces cruzados o sumerge en un
desnaturalización de moléculas proteicas. determinado fijador.
 Insolubilizar los componentes celulares, principalmente proteínas, para conservar el tejido.

El fijador mayormente utilizado es la formalina, una solución acuosa de formaldehido al 37%.

NO EXISTE UN FIJADOR UNIVERSAL OTROS FIJADORES:

El fijador debe seleccionarse en función del La formalina no preserva todos los componentes: no son
objetivo del análisis. específicos para dilucidar la composición química de los electos
celulares. Además, muchos componentes se pierden durante la
La selección del fijador depende del tejido y preparación de la muestra.
lo que se desea ver.
Para retener estos componentes y estructuras, se deben utilizar
FIJACION NO EQUIVALE A CONSERVACION otras técnicas de fijación.
No todos los fijadores conservan el tejido
indefinidamente Especialmente los componentes lipídicos son eliminados por los
procesos donde se utiliza alcohol. Es por esto que para observar
estas estructuras, adipocitos o la membrana plasmática, se utilizan otras técnicas como la fijación con
TETROXIDO DE OSMIO, utilizando microfotografías por ME.

2. INCLUSION

Es el método más común para endurecer el tejido. Se requiere de su infiltración con un medio de
inclusión que permita realizar cortes muy delgados.

Se realizan una serie de procedimientos:

- Lavado con H2O

- Deshidratación en una serie de soluciones alcohólicas de concentración creciente hasta alcanzar el
100%
- Aclarado, se utilizan solventes orgánicos tales como el xileno o tolueno para extraer el alcohol
- Infiltración de la muestra en parafina
- Formación del TACO
- Cuando la muestra se ha enfriado y endurecido se corta con el MICROTOMO
- Los cortes obtenidos se MONTAN sobre portaobjetos utilizando un medio de montaje como
adhesivo.,

Para colorear o teñir los cortes, la parafina debe disolverse y extraerse, con xileno o tolueno y los tejidos
deben rehidratarse mediante el uso de soluciones de alcohol de concentración decreciente.
 3. TINCION

Se utilizan colorantes.

El más utilizado es el binomio HEMATOXILINA-EOSINA (H-E)

1. Se tiñe con hematoxilina en agua.

2. Se deshidrata en soluciones alcohólicas de concentración creciente.
3. Se tiñe con eosina en alcohol.

Después de la tinción, la muestra se pasa por xileno o tolueno y se le coloca un medio de montaje no acuoso
para obtener un preparado permanente. COMPONENTES QUE
¿Qué elementos permite ver? DESAPARECEN con H-E:

Principalmente MACROMOLECULAS ESTRUCTURALES, elementos - Elastina

morfogenicos hísticos: - fibras reticulares
- membranas basales
- Nucleoproteínas - glucógeno
- proteínas intracelulares del citoesqueleto - glucosaminoglucanos y
- proteínas extracelulares proteoglucanos
- Complejos de fosfolípidos y proteínas en las membranas - componentes solubles
- iones

FUNDAMENTOS QUIMICOS DE LA COLORACION CON H-E

COLORANTES ÁCIDOS Y BÁSICOS.

 Un COLORANTE ACIDO tiene carga neta negativa en su parte coloreada y se la describe con la
formula [Na+ anilina-]

 Un COLORANTE BASICO tiene carga positiva en su parte coloreada, se la describe con la formula
[anilina+ Cl-]

HEMATOXILINA [Anilina+ Cl-]: Colorante BASICO+Mordinete+Grupos anionicos= BASOFILIA

La capacidad de los grupos anionicos de reaccionar con un colorante básico se denomina basofilia.

La hematoxilina no es exactamente un colorante básico. Se usa como un mordiente, es decir, como un

intermediario entre el componente del tejido y la anilina.
Cuando los cortes se colocan en agua, la hematoxilina no se disocia del tejido.

Se presta para aquellos procedimientos tintoriales donde es seguida por soluciones

acuosas de colorantes ácidos.

EOSINA [Na- anilina-] colorante ACIDO + Grupos catiónicos= ACIDOFILIA.

La reacción de los grupos catiónicos con un colorante ácido se llama acidofilia.

GRUPOS CATIONICOS GRUPOS ANIONICOS

 Filamentos citoplasmáticos  heterocromatina y nucléolos
 Componentes membranosos intracelulares.  componentes citoplasmáticos
 fibras extracelulares.  Materiales extracelulares.
VARIANTES TINCIONALES

Reacción PAS

Este método de tinción se emplea para detectar hidratos de carbono (polisacáridos) en los tejidos, tales
como el glucógeno y mucopolisacáridos.

PAS = Ácido peryódico + Reactivo de Schiff

Reactivo de Schiff = fucsina básica decolorada.

Ácido periódico: esta sustancia oxida los compuestos que poseen grupos hidroxilos, rompiendo los enlaces
entre los átomos de carbono y formando grupos aldehídos que pueden reaccionar con el reactivo de Schiff.

MECANISMO DE ACCIÓN: el tejido es oxidado con ácido peryodico, con el fin de formar grupos aldehídos.
Posteriormente el reactivo de Schiff interactúa por afinidad con los grupos aldehídos y se colorea de rojo-
fucsia.

Reacción de Feulgen: una hidrolisis débil de ácido clorhídrico para teñir ADN

Se basa en la separación de purinas de la desoxirribosa del ADN mediante una hidrolisis ácida débil; el anillo
de los sacáridos se abre y se forman grupos aldehído. Estos, reaccionan con el reactivo de Schiff para darle el
color.

INMUNOCITOQUIMICA
Fundamento: la especificidad de la reacción entre el antígeno y el anticuerpo.

Los anticuerpos (inmunoglobulinas) son glucoproteínas que se producen por células específicas del sistema
inmunitario en respuesta a una proteína extraña o antígeno. Los anticuerpos pueden purificarse de la sangre
y asociarse con un colorante fluorescente.

 El colorante más utilizado es la FLUORESCEINA, absorbe la luz ultravioleta y emite LUZ VERDE.
 Se pueden utilizar muestras sometidas a fijación química (formalina) o física (congelación) para
localizar un antígeno.
 La reacción del anticuerpo con el antígeno puede examinarse con un microscopio de fluorescencia o
un microscopio confocal.

Para localizar un antígeno diana, se utilizan técnicas de INMUNOFLUORESCENCIA.

Existen 2 tipos de fluorescencia basado en el uso o no de anticuerpo LA IFI PRODUCE UNA FLUORESCENCIA MAS
secundario y al anticuerpo al que se encuentra conjugado el fluorocromo, INTENSA QUE LA IFD, YA QUE MULTIPLES
ANTICUERPOS SECUNDARIOS PUEDEN
UNIRSE AL MISMO ANTICUERPO PRIMARIO

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

Utiliza un anticuerpo primario (polo o El fluorocromo se asocia con un anticuerpo

monoclonal) marcado con fluorocromo que
reacciona con el antígeno dentro de la
muestra.
 Procedimiento de un solo paso
 involucra un único anticuerpo
marcado
 Baja intensidad de la emisión de la
señal.
Si el antígeno buscado está presente se
emitirá fluorescencia permitiendo
identificar la estructura.
secundario dirigido contra el anticuerpo
primario.
El Ac 2° se une a un Ac PRIMARIO no
marcado previamente unido al antígeno a
observar.
Procedimiento de 2 pasos
Comprende 2 anticuerpos de los cuales
uno está marcado
Aumenta la emisión de la señal de
fluorescencia del tejido.
 MICROSCOPIA
Un microscopio es un instrumento que amplifica una imagen permite ver más detalles. PERMITE AUMENTAR
LA CAPACIDAD DE RESOLUCION DEL OJO HUMANO.

Capacidad de resolución  capacidad de una lente de microscopio o sistema óptico para obtener imágenes
separadas de objetos que están muy cerca de otros.

CAPACIDAD MAXIMA DE DIFERENCIA DOS OBJETOS QUE SE ENCUENRTAN CERCANOS, COMO DIFERENTES,
UNO DE OTRO.

LA RESOLUCION DEPENDE del sistema óptico, la longitud de onda de luz, el espesor de la muestra, la calidad
de fijación la intensidad de tinción.

MICROSCOPIO OPTICO

El más utilizado es el microscopio de campo claro. Componentes

- Fuente luminosa, ilumina la muestra

- lente condensador enfoca el haz de luz
- platina sobre la que se coloca el portaobjetos
- lente objeto recoge la luz que atraviesa la muestra
- lente ocular. se puede examinar directamente la imagen formada por la lente objetivo.

Para que le muestra pueda verse, debe ser lo suficientemente fina y estar en un medio de tinción.

OTROS TIPOS DE MICROSCOPIOS

 DE CONTRASTE DE FASES: permite el examen de tejidos sin tinción y es útil para estudiar células
vivas.
 DE CAMPO OSCURO: la lente objetivo no capta la luz directa proveniente de la fuente luminosa. útil
para la detección de cristales y la identificación de espiroquetas
 DE FLUORESCENCIA: observa fluorescencia primaria o secundaria.
 CONFOCAL DE BARRIDO: permite la visualización de una muestra en tres dimensiones.
 MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISION Y DE BARRIDO: preparados con criofractura para el
estudio de membranas.